A propagao in vitro de plantas.

CULTURA DE TECIDOS

O que isso?

L. Pedro Barrueto Cid

Cultura de tecidos vegetais - uma ferramenta fundamental no estudo da biologia moderna de plantas.

Bilogo M.Sc. Ph.D Embrapa/Cenargen - rea de Biologia Celular Autor do livro "O mtodo cientfico, o cientista e a sociedade", pela editora da Universidade do Amazonas. lpedro@cenargen.embrapa.br Fotos do autor

Definio A propagao in vitro de plantas, Figs.1 e 2, chamada tambm micropropagao, uma tcnica para propagar plantas dentro de tubos de ensaios ou similares de vidro (por isso, o termo in vitro), sob adequadas condies de assepsia, nutrio e fatores ambientais como luz, temperatura, 02 e CO2. uma parte importante de biotecnologia, conjuntamente com outras duas reas: DNA recombinante e fermentao. A cultura in vitro, apresenta diferentes modalidades conforme os objetivos de sua aplicao, como por exemplo, cultura de protoplastos; anteras; calos (Fig. 3); clulas em suspenso (Fig. 4); sementes (Figs. 5 e 6),etc.

Antecedentes histricos A teoria da totipotencialidade formulada por Matthias Schleiden & Theodor Schwann, em 1838, pode ser dita que constitui um dos primeiros fundamentos da cultura in vitro, embora seus formuladores nem tenham imaginado uma metodologia como essa. A teoria afirma que a clula autnoma, portanto, que contm o potencial necessrio para originar um organismo completo; nesse caso, uma planta completa. claro que essa capacidade deve manifestar-se sob especiais condies de estmulo. Em decorrncia desta teoria, clulas com diferentes fentipos dentro da planta tm idntico gentipo. Haberlandt, um fisilogo

vegetal austro-hngaro, por volta de 1902, imbudo dessa teoria, foi o primeiro a manipular um sistema de cultura in vitro de plantas, procurando estabelecer e consolidar um sistema de micropropagao. Infelizmente, por limitaes tcnicas da poca, seus esforos falharam. Contudo, alguns anos mais tarde a partir dos trabalhos de Robbin (1922) e White (1934) em ponta de razes; cultura de embries, por La Rue (1936); cultura de calos, por Gautheret Nobcourt (1939); enriquecimento de meios nutritivos com leite de coco, por van Overbeek, 1941; uso de plantas de tabaco como modelo experimental para estudo de morfognese, por Skoog, desde 1944, e uso de meristemas apicais na obteno de plantas livres de vrus, por Morel & Martin, 1952, abriram-se as estradas que a cultura de tecido de plantas percorreria triunfalmente ao longo de todo o sculo XX, com mais e mais descobertas e aplicaes. Importncia A cultura in vitro de plantas, uma tcnica que no apenas apresenta importncia prtica na rea florestal e agrcola, mas, tambm na cientfica bsica. Dentro do campo da biologia de plantas talvez seja uma das tcnicas mais polivalentes. Assim, atravs da cultura de protoplastos, podem-se hibridizar variedades diferentes, vencendo barreiras genticas. Atravs da cultura de anteras, podem-se obter plantas haplides, que logo depois podem-se diploidizar e transformar-se em homozigotos, isto , indivduos que produ-

Fig.1: Plntula de caf cv Rubi, crescida in vitro e obtida a partir 16 Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento de gema axilar de uma outra plntula similar a ela. Assim por diante, outros clones podem ser obtidos

zem um s tipo de gameta para um determinado locus. Com a cultura de clulas em meio lquido, podem-se obter mutantes, isto , gentipos que ganharam ou perderam alguma caracterstica especfica. Com a cultura de embries e meristemas, podem-se fazer trabalhos de criopreservao para conservar materiais em bancos de germoplasmas, com economia de espao e dinheiro, especialmente em espcies de reproduo assexuada como batata, mandioca, abacaxi etc. Com a cultura de meristemas apicais, pode-se pensar em obter plantas livres de vrus, e com a cultura de gemas axilares (Fig.7), propagar milhares de plantas, com gentipos superiores, por exemplo resistentes a nematides, Fusarium etc. (Fig.8). Na mesma linha de raciocnio, a embriognese somtica (Fig.9), pode fornecer grandes quantidades de plntulas que podem servir de base para plantios no campo, tanto na rea florestal quanto na agronmica e na hortigranjeira. Por outro lado, a cultura de tecidos d suporte tcnico a trabalhos de transformao na rea da gentica e na obteno de plantas transgnicas, hoje, assunto da moda e muito controvertido. No campo da aplicao bsica, a cultura de tecidos d suporte tcnico tambm bioqumica, fisiologia vegetal, fitopatologia e citogentica. Na bioqumica, para estudo e dilucidao de rotas metablicas. Na fisiologia, para estudos de crescimento e desenvolvimento, efeito de metais pesados etc., na fitopatologia, para estudos de toxinas; e na citogentica, para estudos de cromossomos ou aberraes cromossmicas (quebras cromossmicas). Apesar de toda essa diversidade de tcnicas, a cultura de tecido uma s, e o denominador comum de todas elas : a assepsia, o explante, o meio nutritivo e os fatores ambientais: luz, temperatura, C02 e 02. Assepsia Ser entendida como um conjunto de procedimentos para tornar um explante livre de microrganismos (bactrias, fun-

Fig.2: Plntula de banana obtida in vitro e transferida para terra em casa de vegetao

gos filamentosos, leveduras etc). A respeito de como evitar microrganismos que possam contaminar o explante, inevitvel o uso de antisspticos, sejam estes bacteriostticos ou germinicidas. Esses antisspticos podem ser antibiticos ou de outra natureza, como lcoois (lcool etlico); halognios (hipoclorito de sdio); sais de metais pesados (bicloreto de mercrio), fungicidas orgnicos etc. Em relao vidraria e aos meios de cultura, estes devem ser esterilizados para que se destruam todos os microrganismos, por calor seco (forno, ar quente) ou mido (autoclave). Pinas bisturis e

demais utencilios metlicos para a manipulao do tecido podem ser esterilizados por flambagem direta, como por exemplo: lamparina com lcool ou bico de Bunsen na cmara de fluxo laminar, ambiente este axnico (livre de germes) portanto, adequado para o trabalho in vitro. Explante Dentro da terminologia da cultura de tecidos, em geral, explante qualquer segmento de tecido oriundo de uma planta para iniciar uma cultura in vitro, geralmente com as vistas a estabeler um protocolo de plantas de gentipo superior. Assim, o explante pode ser um pice radicular ou caulinar, uma gema axilar (Fig.7), um segmento de folha jovem (Fig. 10), uma antera, um ovrio, um embrio zigtico, etc. Esses explantes podero devir plantas diretamente, ou passar por uma etapa intermediria de calo, antes de a planta ser obtida. Um calo uma massa de clulas no diferenciadas do ponto de vista organognico (brotos, razes, frutos etc), que est em contnua proliferao celular, podendo ser compactos, friveis, esbranquiados ou amarelados Fig. 3, etc. Podemos realizar induo de plntulas a partir de um calo, com hormBiotecnologia Cincia & Desenvolvimento 17

Fig.3: Calo frivel oriundo de razes de plntulas de eucalipto in vitro (Eucalyptus grandis x E.urophylla)

Fig.4: Aspecto microscpico de um conglomerado de clulas em suspenso, obtidas a partir de calos friveis de razes de plntulas de eucalipto in vitro
nios vegetais ou reguladores do crescimento (estes ltimos de ao hormonal, mas de origem sinttica). Assim, numa reviravolta espetacular (morfognese) o calo comea a induzir brotos, mas a base molecular do fenmeno na clula, ainda no especificamente conhecida, por isso tambm a dificuldade de extrapolar protocolos de micropropagao de uma espcie para outra, ou de uma variedade para outra. Contudo, muitas vezes, a incapacidade de induzir brotos pode estar relacionada com a poliploidia ou com aberraes cro-

mossmicas. Por outro lado, discute-se muito se a obteno de plantas via calo um bom sistema para clonar plantas com fins comerciais. Embora a preocupao seja pertinente, h tambm nessa preocupao muita carga especulativa. Dentro da biologia, clone um termo de origem botnica e representa a idia de plantas que se originam de uma mesma matriz e, supostamente, possuem o mesmo gentipo. Em cultura de tecidos, isso no necessariamente pode ser verdade, por isso, ento, essa dificuldade de aceitar sem suspeitas plantas via calo. Quando essa variabilidade morfogentica acontece a denominamos variao somaclonal, embora ela seja indesejvel para a propagao clonal, ela possui muito potencial no estudos de melhoramento de plantas. Meio nutritivo a) sais minerais Se uma planta no solo precisa para crescer de elementos minerais que so absorvidos pelas razes, quanto mais um explante, que , por definio, um pedao de tecido separado da planta me. E que elementos minerais so

esses? Os estudos da nutrio de plantas provenientes do mbito da fisiologia vegetal informam que os elementos que compem o meio nutritivo da cultura in vitro devem pertencer categoria dos essenciais, isto , a planta no se desenvolve na ausncia deles. Existem dois grupos deles: os macronutrientes e os micronutrientes. Entre os primeiros, podem-se citar: fsforo, magnsio, nitrognio etc.; entre os segundos, boro, mangans, cobre etc. Os primeiros so adicionados em forma de sal, acima de 100 mg/l at o mximo de 2.500, como no caso de KNO3 em B5, enquanto os segundos, na quantidade de frao de miligramas, uns poucos miligramas por litro (mximo 27 mg no caso do Fe em FeSO4. 7H2O). No sendo o selnio, rubdio e outros, essenciais para a planta, no formam parte dos meios nutritivos mais utilizados: tais como MS, B5, White, Heller. Embora a manipulao desses meios constitua um processo de receiturio, existe muito fundamento fisiolgico na sua utilizao; por exemplo, balano lquido de ctions e nions na soluo; antagonismo inico (o aumento da absoro de um diminui a do outro); percentagem crtica de um elemento (consumo de luxo); influncia do pH na disponibilidade dos sais para a planta; absoro diferencial de ons entre tipos de planta, exemplo: rvores e gramneas, estas ltimas mais exigentes em bases; transporte ativo de ons a nvel celular; enfim, so conhecimentos que podem auxiliar de modo importante no estabelecimento de um protocolo de cultura de tecidos para uma espcie. b) componentes orgnicos: sacarose Um meio nutritivo tambm possui componentes orgnicos, entre eles, sacarose, vitaminas e inositol, para citar os mais utilizados. A sacarose importante como fonte de carbono para alimentar a gliclise e o ciclo de Krebs, devido a que, inicialmente, o tecido, explante, no suficientemente autotrfico. De um outro ponto de vista, a sacarose, quando em presena de auxina, pode contribuir para a diferenciao do cmbio em benefcio de novas formaes de xilema e floema. Em alho, altas con-

Fig.5: Fruto de mamo (Carica papaya L. cv tainung 1) mostrando aspectos e quantidade de sementes por fruto
18 Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento

centraes de sacarose (6%) tm melhorado ostensivamente sua bulbificao. Sua concentrao normalmente varia entre 1% a 3 %, mas, por efeito da autoclavagem e do pH, sua concentrao no meio pode variar, j que hidrolizada em glicose e frutose, sendo que esses limites no so claros e esse problema pode tornar-se limitante para o explante ou para a planta. vitaminas So substncias requeridas por animais e plantas, embora estas ltimas sejam mais autnomas quanto sua Fig.6: Germinao de sementes de mamo sob condies in vitro, aps sntese. As vitaminas so importantes ter-se retirado a sarcotesta e realizado sua assepsia fatores catalticos de rotas metablicas na clula. Nos trabalhos pioneiros da cultura de tecido, os requerimentos de ser encontrado como pertencente ao mentos variam segundo as plantas, senvitaminas foram satisfeitos mediante su- complexo vitamnico B e necessrio ao do que, no meio de cultura, as monocoplementos de composio pouco co- crescimento de leveduras e de clulas tiledneas so muito sensveis sua nhecidos, como extrato de leveduras, de animais (mamferos) in vitro. falta. No MS, o meio mais universalmenleite de cco, hidrolizado de protenas, Na rea de cultura de tecidos vege- te utilizado, sua prescrio 100 mg/ extrato de malte, etc. Hoje, apesar de tais, muitos o consideram uma fonte litro. essa tendncia no haver desaparecido, complementar de carboidrato, mais o mais freqente, que, os meios nutri- que um composto vitamnico, e que agentes gelificantes tivos incorporem vitaminas especficas desempenha um papel importante na So necessrios, considerando que o como B1 (tiamina), B6 (piridoxina), ci- formao de pectinas e hemicelulose explante e as plantas obtidas devem do pantotnico, cido nicotnico, cido na parede celular. Seu uso data, apro- ficar sobre um suporte, para no afundaascrbico etc. ximadamente, de 1951, e decorrente rem. Em geral, os meios slidos so No obstante as plantas sepreferidos aos de cultura lquirem capazes de sintetizar suas da, sendo que estes ltimos so prprias vitaminas, fica a dvida mais caros pelo fato de exigirem se a incorporao no meio um agitador para evitar o afogasempre necessria. Contudo, em mento ou a hipoxia do explante. se tratando de drenos, razes, por O agente gelificante forma exemplo, a suposio de que com a gua um gel que funde a nem todos os seus requerimen100C e que solidifica por volta tos nutricionais orgnicos sejam dos 45C; no hidrolizado por sintetizados ficou evidenciada j enzimas e, aparentemente, no em 1930, quando pesquisadores reage com o resto de ingrediencomo Bonner, Robbins, White tes do meio. etc, observaram que, na presena O gar-gar um tipo de de algumas vitaminas (tiamina, agente gelificante de natureza Fig.7: piridoxina, c. nicotnico, etc.), o polissacardica produzido por Prvia assepsia, gema caulinar de abacaxi (Ananas algas (Gelidium amansii), sencrescimento das razes (tomate, ervilha e rabanete) melhorava comosus L. Merr. Cv Prola) cultivada in vitro do que sua composio em posensivelmente. lisacardeo pode variar de 50% a Com respeito quantidade a ser do fato de que, em muitos casos, sua 90 %, por isso, a procedncia do mesmo incorporada, ela varia desde frao de incorporao ao meio de cultura pro- importante. Por outro lado, a autoclamiligramas at 10 miligramas por litro, moveu diferentes eventos: formao vagem pode hidroliz-lo se o pH do podendo ser esterilizada por filtrao ou de gemas, crescimento de calos etc. meio est cido, fazendo com que perca autoclavagem. Convm lembrar que, em algumas plan- firmeza e, dependendo da marca, o tas, o myo-inositol est conjugado com agente gelificante pode apresentar immyo-inositol a auxina, sendo essa uma forma de purezas, como cloro, brio, sulfato etc, Este composto tambm descrito como estocar ou transportar aquele horm- que podem afetar o crescimento dos meso-inositol, um ismero do inositol nio, ou, conjugado, em alguns tipos de explantes. o que, apresenta importncia biolgica, sementes, com o cido fosfrico, forGelrite (Merck) um outro tipo de j que participa da internalizao de mando o cido ftico. agente gelificante. Produzido pela bacestmulos externos a partir de receptores A respeito da sua aplicao, a infor- tria Pseudomonas elodea, usado em de membrana. Na literatura mdica, pode mao disponvel que os requeri- menor quantidade (2,5 g/l); uma vez
Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento 19

solidificado, transparente, o que facilita a observao da raiz e focos de contaminao. Com ons, como Ca++ e Mg++, forma um elo mais firme do que com ctions monovalentes (K+ e Na+). Devem-se ter cuidados porque, s vezes, os agentes gelificantes, includa a agarose, podem induzir hiperhidricidade (vitrificao) nos brotos ou plntulas obtidas. A hiperhidricidade uma anomalia do tecido, na qual este fica rgido e quebradio (glassy shoot), havendo malformao de estmatos na plntula e dificuldade para enraizar. um fenmeno complexo e depende tambm de outros fatores como umidade, amnia, citocinina, pH etc. hormnios Estes representam o alma mater da cultura de tecido, porque so eles que direcionam o processo morfogentico. Agrupam-se tradicionalmente em 5 grupos: auxinas, citocininas, giberelinas, etileno e ac. abscico, sendo, os trs primeiros os mais usados na micropropagao. Por exemplo, sob condies in vitro, uma planta de abacaxi pode ser clonada atravs de uma gema axilar, a qual, induzida a produzir inmeros brotos com citocinina, que, depois de alongados com giberelinas, podem ser enraizados com auxina e transferidos para terra em casa de vegetao. Quando se fala de hormnios, sempre oportuno registrar uma diferenciao terminolgica importante. Trata-se dos chamados reguladores de crescimento, que so substncias que tm ao similar aos hormnios, porm, tm origem sinttica. Assim, o cido indol actico (AIA) e o Picloram so duas auxinas, mas, enquanto o primeira hormnio, a segunda um regulador de crescimento, que, na prtica laboratorial, terminam sendo chamados de hormnios. Em geral, tanto uns como outros so usados na ordem de uns poucos M at 40 M. No caso do meio ter carvo ativado, pode-se aumentar a concentrao em at 100 M. Por outro lado, as auxinas e giberelinas
20 Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento

tidas em freezer ou refrigerador. Fatores ambientais: luz Luz e temperatura so dois fatores importantes nas salas de cultura, onde devem ser controlados para que as plantas ali mantidas se desenvolvam adequadamente. So raras as salas de cultura com iluminao constante. A luz importante para a planta sob trs pontos de vista. Do ponto de vista da fotossntesse, da fotomorfognese e do fototropismo; por isso, a sua incluso numa sala de cultura. Nessa sala, a luz deve seguir um determinado fotoperodo, por exemplo, 16 h luz e 8 de escuro, sendo que, nas prateleiras a irradincia (densidade de fluxo radiante por superfcie, W m-2, ou densidade de fluxo de ftons, mol m-2 s-1)1 pode variar de 8 a 15 W m2 . Embora nas salas seja usada luz branca fluorescente, a composio espectral pode variar conforme as marcas comerciais oferecidas. Algumas podem apresentar mais irradiao na regio do azul / violeta (perto de 71 kcal/Einstein ); outras, na regio do laranja / vermelho ( cerca de 43 kcal/Einstein) Essas variaes podem representar impactos diferentes na cultura in vitro, segundo a espcie em questo. Assim, em alguns casos, uma luz mais rica em vermelho que azul pode, por exemplo, estimular melhor a induo de razes adventcias. J em outros casos, a luz azul pode estimular mais a brotao de calos que outros comprimentos de onda, mas esta tambm pode contribuir a quebrar a molcula de AIA. De modo geral, a luz branca estimula a induo de brotos, porm, tende a inibir a induo de razes. Entretanto, bom lembrar que o nvel de irradincia importante na resposta morfogentica. Sendo assim, uma irradincia baixa (3 W m-2) pode ser mais efetiva que uma irradincia alta (12 W m-2) na induo de brotos a partir de calos, ou vice-versa. Pode-se contornar o problema de se obterem maiores ou menores irradincias com o nmero de lmpadas por pra-

Fig.8: Plntula de abacaxi oriunda de uma gema caulinar. Por micropropagao milhares dessas plntulas (clones) podem ser obtidas

podem ser dissolvidas em NaHO (0,1 1 N) e as citocininas em HCl tambm na faixa de 0,1 - 1 N. Em doses maiores produzem efeitos txicos ou teratolgicos ou ainda inibirem a fotosntese, como o caso da auxina sinttica 2,4D ( cido 2,4-diclorofenoxiactico). No caso de seu uso em quantidades pequenas, aconselhvel obt-los de solues estoques que devem ser man-

Fig.9: Embries somticos de caf, obtidos a partir de explantes foliares de cv Rubi

teleira ou determinando que altura dever ter a prateleira. Para a cultura in vitro, irradincias maiores que 15 W m-2 podem reduzir a fotosntesse das plantas, o que no necessariamente pode acontecer em condies de campo. Irradincias maiores na sala de cultura obviamente contribuiro para elevar a temperatura dos frascos, embora se saiba que, em caf, irradincias altas no reduziram a fotosntesse quando a temperatura foliar permaneceu constante a 25 C. temperatura Em geral, nas salas de cultura, a temperatura a ser usada varia entre 24 e 27C. importantssimo contar com um sistema de refrigerao acionado por termostato para manter fixa a temperatura. O fato de os reatores das lmpadas ficarem fora da sala de cultura, ajuda, ou seno, o uso de reatores eletrnicos, que no esquentem. Mesmo com todas as precaues de manter as variaes de temperatura sob controle, sempre temos nas placas ou tubos de ensaios problemas de condensao da gua nas paredes desses materiais. Existem cmaras ou incubadoras que evitam esse problema, mas seu preo proibitivo. Com respeito s necessidades eventuais de temperaturas alternadas entre o dia e a noite, prefervel usar incubadoras para lograr isso. 02 e C02 Existe pouca informao sobre o microclima gasoso dentro do tubo de ensaio. De qualquer maneira, a presena deles importante para a respirao do explante ou para a fotossntesse da plntula. No que diz respeito respirao aerbica-(gliclise + ciclo de Kreb), considerando apenas um tecido heterotrfico, e em se tratando de tubos de ensaio, podemos supor que, no volume disponvel acima do meio slido, existe, inicialmente, uma concentrao e uma presso parcial do 02 equivalente atmosfrica (25 C e 1 atmosfera); isso :, 8,6 mM e 0,2 atmosfera, respectivamente, embora esse valor, no decorrer do tempo, possa

Fig.10: Explante foliar de caf, mantido no escuro, insinuando, aps 30 dias, formao de calo pela ao de um regulador de crescimento presente no meio nutritivo
diminuir no interior do tubo e a respirao anaerbica, supostamente, no comear a operar antes da repicagem seguinte do material. provvel que, em nveis de 0,3 mM e 0,07 atmosfera de presso parcial do 02 no espao interior do tecido (explante, calo etc.) essa respirao rapidamente comece a operar e, com isso, iniciar-se a morte do explante. Isso levanta a questo sobre a transferncia peridica do material, o volume do frasco e a permeabilidade ou no da tampa. A concentrao de C02 de 350 l / l no ambiente externo no necessariamente reflete a concentrao de C02 no ambiente interno do tubo de ensaio. Muitas vezes ela pode ser maior no tubo, devido respirao da plntula no perodo noturno. Por outro lado, no caso de uma plntula com irradincia de 60 m m-2 s-1 e aquela quantidade de C02 rapidamente deveria ultrapassar o ponto de compensao. Contudo, parece que essas interaes so mais complexas do que parecem, porque existem evidncias de que a presena de sacarose no meio pode deprimir a rubisco, reduzir a fotosntesse e, conseqentemente, a utilizao de C02 e, dessa forma, a plntula no apresentar sinais de

crescimento satisfatrio e provocar reaes de desconcerto no observador, sobre as possveis causas de seu no crescimento. Tentou-se aqui apresentar uma viso sinptica do que seja a cultura de tecido in vitro e sua importncia para a biologia de plantas. No campo econmico, sem ir muito longe, basta lembrar que, atravs dessa tcnica, a floricultura movimenta milhes de dlares e de plantas anualmente. Na Embrapa /Cenargen (Braslia DF) usamos essa tcnica em quatro frentes: na micropropagao , na criopreservao, na conservao de germoplasma e na transformao, todas elas, visando a uma agricultura mais moderna e competitiva para o pas. Bibliografia BARRUETO CID, L.P. (Ed.). Introduo aos hormnios vegetais. Braslia: Embrapa Recursos Genticos e Biotecnologia,2000. 205 p. No prelo. BARRUETO CID, L.P.; MACHADO, A. C.G.; CARVALHEIRA, S.B.C.; BRASILEIRO, A.C.M. Plant regeneration from seedling explants of Eucalyptus grandis x E. urophylla. Plant Cell, Tissue Organ Culture, v.56:17-23,1999. BUCHANAN, B.B.; GRUISSEM, W.; JONES, R.L. Biochemistry & molecular biology of plants. Rockville: American Society of Plant Physiologist, 2000. 1367 p. DODDS,J.H.; ROBERTS, L. Experiment in plant tissue culture. London: Cambridge Unv. Press, 1982. 178 p. FOSKET, D.E. Plant growth and development. A molecular approach. San Diego: Academic Press, 1994. 580 p. GEORGE, E.F. Plant propagations by tissue culture. Part 1-2. Edington: Exegetics Ltd, 1993/1996. 1361 p. PIERIK, R.L.M. In vitro culture of higher plants. Drodrecht: Martinus Nijhoff Pub.,1987. 344 p. REDLIN, S.C.; CARRIS, L.M. Endophytic fungi in grasses and woody plants. Minnesota: APS Press, 1996. 223 p.
Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento 21