Seccin Microbiologa de Alimentos 1.

OBJETIVO

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Obtener confirmacin mediante la caracterizacin bioqumica de cepas aisladas y presuntivas de Listeria monocytogenes. 2. CAMPO DE APLICACIN Y ALCANCE

Aplicable a todas las cepas aisladas de muestras de alimentos y ambientales. 3. FUNDAMENTO

Las pruebas o ensayos bioqumicos, son pruebas simples que se han desarrollado para demostrar en forma clara una determinada caracterstica bioqumica como presencia o ausencia de una determinada actividad enzimtica, grupo de enzimas o determinada va metablica, crecimiento a una determinada temperatura, crecimiento en presencia de inhibidores, etc. No significan de ninguna manera un estudio profundo del metabolismo bacteriano. Para la identificacin presuntiva del gnero Listeria aislados de muestras de alimentos y ambiente puede usar ensayos convencionales o kit bioqumicos comerciales. Estos ltimos basados en la demostracin o verificacin mediante respectivos anlisis de laboratorio de una adecuada correlacin entre el kit comercial y las pruebas bioqumicas convencionales. Los kits comerciales se basan en las propiedades enzimticas que contiene el microorganismo y su actuar en los substratos deshidratados que permite que sean convertidos en productos metablicos finales los cuales son detectados por el sistema al producir un cambio visible de color. Los ensayos bioqumicos tradicionalmente utilizados, llamadas pruebas bioqumicas convencionales, generalmente determinan la actividad de una va metablica (conjunto de reacciones qumicas) a partir de un sustrato que se incorpora en un medio de cultivo y que la bacteria al crecer transforma o no.

Seccin Microbiologa de Alimentos 4. 4.1 REFERENCIAS

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Bacteriological Analytical Manual online. Carpeta 10, enero 2003.

4.2 Official Methods of Analysis AOAC. Captulo 17, subcarpeta 10 edicin 18, 2005. 4.3 Sistema de identificacin API Listeria, bioMrieux SA. 5. TERMINOLOGA No Aplica 6. 6.1.1 6.1.2 6.1.3 6.1.4 6.1.5 6.1.6 6.1.7 6.1.8 6.1.9 MATERIALES, INSUMOS Y EQUIPOS Agar sangre N 2 Sangre de cordero defibrinada Kit tincin Gram Solucin de perxido de hidrgeno al 3% (test catalasa) Solucin de KOH al 40% (test acetona) - naftol al 5% en alcohol (test acetona) Medio Reduccin nitrato Caldo nutritivo Solucin salina 0,85%

6.1 Reactivos y Medios de cultivo

6.1.10 Caldo base de fermentacin prpura de bromocresol 6.1.11 SIM o medio prueba motilidad. 6.1.12 Reactivo cido sulfanlico al 0,8% (test nitratasa) 6.1.13 Reactivo de - naftol al 0,5% en cido actico al 5N o Reactivo de N-(1 naftil) etilendiamina al 0,125% en cido actico al 5N (test nitratasa) 6.1.14 Sistema API Listeria ( opcional)

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6.2 Materiales y equipos 6.2.1 6.2.2 6.2.3 6.2.4 6.2.5 6.2.6 6.2.7 6.2.8 Incubadora a 30 C y a 35 C 1 C Microscopio binocular Tubos de fermentacin (Durham) Asas de inoculacin Asas de punta para inoculacin Tubos de 16 x 160 mm con tapa a rosca Tubos de 12 x 120 mm con tapa a rosca Placas de Petri

7. 7.1.1

DESARROLLO De los cultivos de colonias presuntivas de Listeria monocytogenes puras y aisladas en placa de agar Soya tripticasa con extracto de levadura 6% a 30 C por 24 a 48 h , examinar sus caractersticas y realizar las pruebas siguientes:

7.1 Perfil bioqumico convencional

7.1.1.1 Motilidad: Picar colonias tpicas y examinar motilidad formando una suspensin usando solucin salina al 0,85%, emulsionar bien y observar al microscopio con objetivo de inmersin de fase de contraste. Observar: bastones delgados cortos, con suave rotacin o no mviles. 7.1.1.2 Catalasa: En un tubo estril agregar 0,3 mL de perxido de hidrgeno al 3% y suspender una colonia con aplicador de madera o asa de platino ( no utilizar asa de nicrom-nquel). Observar la formacin de burbujas indica prueba positiva. 7.1.1.3 Tincin Gram: Todas las Listerias spp son bacilos cortos Gram positivos. Sin embargo algunos cultivos pueden presentar una morfologa variable y algunas pueden observarse en forma de cocos. Tambin pueden presentar una distribucin en empalizada similar a clulas difteriodes. 7.1.1.4 Hemlisis: Preparar placas de agar sangre de cordero al 5%, que contengan aproximadamente 15 mL de agar, lo ideal es obtener una profundidad inferior a 5 mm, esto se puede lograr efectuando superposicin del agar en 1-2 mm. Utilizar la placa con agar sangre bien seca (comprobar que estn libre de humedad antes de usar). Se puede

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confeccionar una red de cuadrantes para sembrar en cuas. Siempre considerar controles positivos: Listeria monocytogenes y Listeria ivanovii y control negativo: Listeria innocua. Incubar por 24-48 h. Observar las placas con luz brillante y evidenciar la presencia de hemlisis. Listeria monocytogenes y Listeria seeligeri presenta una suave hemlisis (- hemlisis). Al contrario Listeria ivanovii, presenta una hemlisis fuerte e intensa y Listeria innocua no presenta hemlisis. Resolver hemlisis dudosas con prueba de CAMP (Christie- AtkinsMunch-Peterson test) si fuera necesario. 7.1.1.5 Prueba de reduccin nitratos a nitritos: esta prueba es opcional .Inocular en caldo nitrato e incubar por 5 das a 35C. Agregar 0,2 mL del reactivo de naftilamaina y del cido sulfanlico. Observar la formacin anillo rojo, reaccin positiva. Si no se forma anillo rojo-violeta agregar polvos de zinc y mantener durante una hora, si se forma anillo rojo-violeta, la reaccin es negativa y si no se forma color la reaccin es positiva. Listeria monocytogenes no reduce nitratos a nitritos. Si utiliza - naftol y cido sulfanlico, la coloracin que se observa es anaranjada para la reaccin positiva y si no se forma color agregar polvos de Zinc y la presencia de color naranjo indica reaccin negativa y la ausencia de color indica reaccin positiva. 7.1.1.6 Movilidad: Inocular agar SIM o MTM e incubar por 7 das a temperatura ambiente. Observar diariamente. Listeria spp son mviles, dando un crecimiento en paraguas como patrn tpico de crecimiento. El agar MTM es mejor para observar la movilidad. Si no dispone de estos agares observar la emulsin preparada a partir del agar TSA con extracto de levadura incubado a 30 C, con microscopa de contraste de fases (x 1000) . Ver 7.1.1.1. 7.1.1.7 Fermentacin de carbohidratos: Inocular caldo base de prpura de bromocresol con 0,5% de carbohidrato (el uso de campanas Durham es opcional): dextrosa, esculina, maltosa, ramnosa, manitol y xilosa. Se puede hacer una batera corta slo con manitol, ramnosa y xilosa cuando se utilizan otras pruebas adicionales y complementarias como sistema API. Incubar por 7 das a 35C. Observar la produccin de cido sin gas. Todas las especies son positivas a dextrosa, esculina y matosa. Si en Palcam, OXA, LPM, en la prueba de esculina se observa una pigmentacin inequvoca, puede omitir la prueba de esculina en caldo. Listeria monocytogenes es manitol negativo, ramnosa positiva y xilosa negativa.

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7.1.1.8 Test de CAMP: Esta prueba es til cuando las hemlisis son ambiguas. Para realizar la prueba inocular por estra una cepa de S. aureus - hemoltico y en paralelo y diametralmente opuesto una cepa de Rhodococcus equi en un aplaca de agar sangre de cordero. Siembre por estra varios cultivos de ensayo en paralelo el uno del otro en forma uniforme pero en ngulo recto hacia y entre S. aureus y Rhodococcus. Incube a 35 C por 24- 48 h. Observar despus de la incubacin examine las reacciones hemolticas de L. monocytogenes y L. seeligeri las que se incrementan en la zona influenciada por la hemlisis de S. aureus. Siguen siendo las otras especies no hemolticas. La reaccin de Listeria monocytogenes suele ser ptima a las 24 h en lugar de las 48 h.. Para obtener suficiente R. equi para proporcionar un buen equilibrio, incubar el cultivo inclinado 48 h en lugar de 24 h. Se recomienda el uso de las cepas conocidas de control de Listeria spp. sobre una placa de agar sangre de cordero. Placas de agar sangre de cordero debe ser lo ms fresca posible.

7.1.1.9 Se pueden usar kits comerciales (pruebas complementarias pueden ser necesarias) como Vitek o API Listeria el cual no requiere un aprueba adicional de CAMP. 7.2 7.2.1 Perfil Bioqumico comercial Sistema API Listeria

7.2.1.1 La galera API es un sistema estandarizado para la identificacin de Listeria que utiliza ensayos miniaturizados, as como una base de datos especfica. El sistema consta de 10 microtubos que contienen los sustratos deshidratados y permiten la realizacin de ensayos enzimticos o de fermentacin de azcares. 7.2.1.2 Las reacciones que se producen durante la incubacin se traducen en cambios de color, bien espontneos o bien provocados mediante la adicin de reactivos.

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7.2.1.3 La lectura de estas reacciones se realiza con la ayuda de la Tabla de Identificacin y la interpretacin se realiza tras consultar la lista de perfiles de la ficha tcnica o con la ayuda de un software de identificacin. 7.2.1.4 La composicin de la galera API Listeria est conformada por: Galera API Listeria, Ampollas de suspensin medium (agua desmineralizada), ampolla de Reactivo ZYM, cmaras de incubacin, hoja de resultados y ficha tcnica. 7.2.1.5 Material necesario adicional: McFarland Standard 1, programa apiweb, pipetas o PSIpettes, protege ampollas, gradillas para ampollas, equipo general de laboratorio. 7.2.1.6 Reactivo complemetario: Agar Ottaviani Agosti (OAA) o chromagar Listeria. 7.2.1.7 Precauciones: No emplear los reactivos despus de su fecha de caducidad, antes de su utilizacin verificar la integridad del envase y sus componentes, no utilizar galeras que hayan sufrido alguna alteracin fsica: cpula deformada, bolsa de deshidratante abierta, etc.; antes de su utilizacin permitir que los reactivos alcancen la temperatura ambiente. 7.2.1.8 Abrir las ampollas: en forma delicada realizar lo siguiente: 7.2.1.8.1 7.2.1.8.2 Introducir la ampolla en el protege-ampolla. Sujetar verticalmente el conjunto en una mano (tapn blanco hacia arriba).

7.2.1.8.3 Presionar a fondo el tapn. 7.2.1.8.4 Luego cubrir la parte inclinada del tapn con la primera falange del pulgar. 7.2.1.8.5 Ejercer una presin con el pulgar en la base de la tapa inclinada del tapn para romper la extremidad de la ampolla. 7.2.1.8.6 Otra alternativa es ejercer una presin horizontal con el pulgar en la parte estriada del tapn para romper la extremidad de la ampolla. 7.2.1.8.7 Retirar la ampolla del protege-ampolla y conservarlo para un prximo uso. 7.2.1.8.8 En el caso de la ampollas sin tapn cuentagotas, retirar delicadamente el tapn. 7.2.1.8.9 En el caso de ampolla con tapn cuentagotas, invertir la ampolla y mantenerla en posicin vertical. Aplicar una presin lateral sobre el tapn para transferir la totalidad del reactivo al frasco cuentagotas. Para usar posteriormente se recomienda apretar el tapn antes de invertir la ampolla con el fin de aspirar todo el resto de reactivo y evitar que se derrame por el exterior del tapn.

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7.2.1.9 Condiciones de almacenamiento: las galeras se conservan a 2-8 C hasta la fecha lmite de utilizacin indicada en el envase. 7.2.1.9.1 Los medios se conservan a 2-30 C hasta la fecha lmite de utilizacin indicada en el envase. 7.2.1.9.2 Conservar los reactivos en la oscuridad a 2 -8 C hasta la fecha lmite de utilizacin indicada en el envase. 7.2.1.9.3 Tras la apertura de las ampollas y transferir los reactivos a los frascos cuentagotas, los reactivos pueden conservarse un mes (o hasta la fecha lmite de su utilizacin si sta fuera anterior): anotar la fecha de apertura sobre la etiqueta de los frascos. 7.2.1.9.4 Como el reactivo ZYM B es muy sensible a la luz verificar el aspecto del reactivo antes de transferirlo al cuentagotas. 7.2.1.9.5 El reactivo ZYM B presenta en su estado normal una coloracin amarilla a mbar. Eliminar el reactivo si se observa una coloracin rosa (alteracin).Una exposicin corta a la luz del laboratorio (alrededor de 1 hora) entraa una degradacin del reactivo. 7.2.1.10 Utilizacin del reactivo ZYM B: abrir ampolla sin lo descrito en numeral 7.2.1.8. 7.2.1.10.1 Agregar una gota de reactivo. 7.2.1.10.2 Volver a cerrar bien el frasco despus de su uso y conservar segn el punto 7.2.1.9. 7.2.1.11 Muestras: Recogida y Preparacin: la galera API Listeria no debe ser utilizada directamente a partir de muestras de origen clnico o de otro tipo. 7.2.1.11.1 En una primera fase, los microorganismos a identificar deben aislarse sobre un medio de cultivo apropiado siguiendo las tcnicas usuales en bacteriologa. 7.2.1.12 Modo operativo 7.2.1.12.1 Seleccin de las colonias 7.2.1.12.1.1 Verificar que la cepa a estudiar pertenezca al gnero Listeria (bacilos cortos, Gram- positivos, polimorfos, mviles a 25 C pero no a 37 C, catalasa positivos y oxidasa negativos). 7.2.1.12.1.2 Dado que las muestras contienen con frecuencia una mezcla de varias especies de Listeria, resulta preferible realizar un subcultivo sobre agar con sangre a partir de una colonia bien aislada.

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7.2.1.12.1.3 Incubar la placa a 24 h a 36 C 2 C. 7.2.1.12.1.4 Se pueden usar los siguientes medios para aislar las colonias antes del empleo galera API Listeria: medios a base de agar con sangre no selectivos, tipo Columbia o TSA, con o sin antibiticos; medios selectivos para Listeria con excepcin del medio McBride que inhibe la expresin enzimtica de bacterias sobre la galera API Listeria. Si se empleara este medio para aislamiento, realizar un subcultivo sobre agar con sangre. 7.2.1.13 Preparacin de la galera 7.2.1.13.1 Reunir fondo y tapa de un cmara de incubacin y repartir aproximadamente 3 mL de agua destilada o desmineralizada (o cualquier agua sin aditivos ni derivados susceptibles a liberar gases (Ej: Cl2, CO2 ) en los alvolos del fondo para crear una atmsfera hmeda. 7.2.1.13.2 Escribir la referencia o la identificacin de las muestras o cepas en la lengeta lateral de la cmara (no escribir la referencia o identificacin sobre la tapa, ya que sta puede resultar extraviada durante la manipulacin. 7.2.1.13.3 Sacar una galera de su envase individual. 7.2.1.13.4 Colocar la galera en la cmara de incubacin. 7.2.1.13.5 Eliminar la bolsita antihumedad. 7.2.1.14 Preparacin del inculo 7.2.1.1.4.1Abrir una ampolla de API Suspensin Medium (2 mL) como se indica en el punto 7.2.1.8. 7.2.1.1.4.2Con la ayuda de una pipeta o PSIpette, coger colonias bien aisladas. Se recomienda utilizar cultivos jvenes (18 a 24 h). 7.2.1.1.4.3Realizar una suspensin de turbidez igual a 1 de McFarland. Esta suspensin debe ser utilizada de inmediato. Observar el tipo de hemlisis y anotarlo en la hoja de resultados, ya que esta caracterstica constituye un ensayo adicional al API pero de gran importancia. 7.2.1.15 Inoculacin de la galera 7.2.1.15.1 Repartir la suspensin bacteriana precedente, en los tubos evitando la formacin de burbujas (para ello inclinar la cmara de incubacin hacia delante y colocar la pipeta o la PSIpette en un lado de la cpula).

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7.2.1.15.2 Llenar el tubo y la cpula del ensayo DIM (100 L aprox.) cuidando que no se produzca un menisco convexo. 7.2.1.15.3 Llenar solamente la parte del tubo de los ensayos ESC a TAG (50 L aprox.). 7.2.1.15.4 La calidad del llenado es muy importante ya que los tubos con excesiva o insuficientemente llenos originan resultados falsos positivos o negativos. 7.2.1.15.5 Cerrar la cmara de inmediato. 7.2.1.15.6 Incubar de 18-24 horas a 36 C 2 C en atmsfera aerobia.

PI Listeria

Cerrar

PRUEBAS NEGATIVAS

PRUEBAS POSITIVAS

7.2.1.16 Lectura 7.2.1.1.6.1 Agregar una gota de reactivo ZYM al ensayo DIM. 7.2.1.1.6.2 Pasados 3 minutos leer todas las reacciones haciendo referencia a la Tabla de identificacin de la ficha tcnica. 7.2.1.1.6.3 Anotar las reacciones +/ - en la hoja de resultados. 7.2.1.1.6.4 Anotar igualmente el tipo de hemlisis. 7.2.1.1.6.5 El resultado de este ensayo no se tiene en cuenta en la interpretacin de la galera.

Seccin Microbiologa de Alimentos 7.2.1.17 Interpretacin

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7.2.1.17.1 La identificacin se obtiene a partir del perfil numrico. En la hoja de resultados, los test estn separados en grupos de 3 y se asigna para cada uno un valor 1, 2 4. Para ello, las pruebas de la galera se separan en grupos de tres y se da a cada reaccin positiva un valor igual a 1, 2 4 dependiendo de la posicin de la prueba en su grupo, 1, 2, 3 respectivamente. 7.2.1.17.2 El principio de codificacin es condensar la informacin binaria (+, -) en un perfil numrico. 7.2.1.17.3 La suma de los 3 valores obtenidos (0 para reacciones negativas) dan una cifra entre 0 y 7 para cada grupo. 7.2.1.17.4 Colocar el cursor en el campo que usted desee rellenar. 7.2.1.17.5 Sumando en el inferior de cada grupo los nmeros que corresponden a reacciones positivas, se obtiene 4 cifras que constituye el perfil numrico. 7.2.1.18 Identificacin 7.2.1.18.1 Se realiza mediante la base de datos (V 1.2) 7.2.1.18.2 Con la ayuda del perfil numrico en la lista de la ficha tcnica; esta lista no exhaustiva, en caso de un perfil inexistente, consultar uno de los programas citados o con la Asistencia tcnica de bioMerieux. 7.2.1.18.3 Por medio del software de identificacin apiweb . 7.2.1.18.4 Introducir manualmente por teclado el perfil numrico de 4 cifras. 7.2.1.18.5 Es posible introducir directamente: - "+", "-" o "?" en los campos superiores de la galera. Las cifras correspondientes se visualizarn en los campos inferiores. - las cifras (0-7) en los campos inferiores. 7.2.1.18.6 La tecla 7.2.1.18.7 El botn (tab) del teclado permite pasar de un campo a otro. Reinicializar permite cancelar la introduccin anterior.

7.2.1.18.8 Una vez rellenos los campos, pulsar el botn Validar para visualizar los resultados. Pueden aadirse una referencia y comentarios a la pgina de los resultados.

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1

+
2

+
4

+
1

+
4

+
1

DIM ESC

MAN

DARL XYL RHA

MDG RIB G1P

TAG

HEM

Validar

BUENA IDENTIFICACION Galera Perfil Nota Taxn significativo Listeria monocytogenes Taxn siguiente Listeria innocua % ID 98.6 % ID 1.3 T 1.0 T 0.58 Pruebas en contra DIM 99% Pruebas en contra API LISTERIA V1.2 6510

7.2.1.19 Control de calidad 7.2.1.19.1 Los medios y reactivos son objeto de controles de calidad sistemticos durante las diferentes etapas de su fabricacin. 7.2.1.19.2 El usuario debe realizar adems un control bacteriolgico de los ensayos de la galera, utilizando las cepas: Listeria innocua ATCC 33090 preferentemente o una de las cepas siguientes: Listeria ivanovii ATCC BAA-139 o Listeria monocytogenes ATCC 19115.

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7.2.1.19.3 Los resultados esperados se resumen el cuadro siguiente: Cepa L. innocua L.ivanovii L. monocytogenes DIM + + ESC + + + MAN + + DARL + + + XYL + RHA + + MDG + V + RIB G1P +* TAG -

* Ocasionalmente (-). Perfiles obtenidos despus de cultivo sobre agar Columbia con sangre de cordero.

7.2.1.20 Lmites de ensayo 7.2.1.20.1 El sistema API Listeria est destinado nicamente a la identificacin de bacterias del gnero Listeria presentes en la base de datos (tabla de identificacin). 7.2.1.20.2 No puede utilizarse para identificar otros microorganismos ni para excluir su presencia. 7.2.1.20.3 Slo se pueden utilizar medios puros que contengan un solo tipo de microorganismo. 7.2.1.21 Eliminacin de desechos 7.2.1.21.1 Eliminar el Reactivo ZYM B no utilizando siguiendo los procedimientos relativos a los desechos qumicos peligrosos. 7.2.1.21.2 Eliminar todos los reactivos utilizados o no utilizados (diferentes al ZYM B), as como el material de un solo uso contaminado siguiendo los procedimientos relativos a los productos infecciosos o potencialmente infecciosos.

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8. REGISTROS Identificacin del registro Hoja Registro resultados anlisis Listeria monocytogenes RG-712.00-077 Almacenamiento Archivador rojo rotulado Registros resultados anlisis Listeria monocytogenes Laboratorio 338 Recuperaci Tiempo retencin y n disposicin Acceso Papel 5 aos y disposicin restringido al en basura normal personal Seccin partidos en trozos Microbiologa Proteccin

9. TABLA DE MODIFICACIONES Revisin N Pg. Modificada Motivo del cambio Fecha Aprobacin

10. ANEXOS Anexo N 1 Tabla de identificacin API Listeria. Anexo N 2 Tabla diferenciacin especies de Listeria BAM online. Anexo N 3 Hoja Registro resultados anlisis Listeria monocytogenes RG-712.00-077.

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ANEXO N 1 TABLA DE IDENTIFICCAIN API LISTERIA Test DIM Componente s activos Substrato enzimtico Esculina citrato frrico 4-nitrofenilDmanopiranosi da D- Arabinol D-Xilosa L-Rhamnosa Metil-Dglucopiranosi do D-Ribosa Glucosa-1 Fosfato D-Tagatosa Cantidad Mg/cp. 0,106 Reacciones Diferenciacin L. innocua/ monocytogenes Hidrlisis (ESCulina) - MANosidasa Resultados Negativo Positivo
ZYM B /< 3 min

ESC MAN

0,16 0,024 0,045

L. Naranja plido Naranja Rosa beige Gris beige Amarillo negro plido Incoloro Amarillo

DARL XYL RHA MDG RIB GP1 TAG

0,4 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4

Acidificacin (D-Arabinol) Acidificacin ( Xilosa) Acidificacin(RHAmnosa) rojo Amarillo/ Acidificacin (Metil-D- Rojo/ anaranjado amarillo Glucopiranosido) anaranjado Acidificacin (RIBosa) Acidificacin (Glucosa-1Fosfato) Acidificacin (TAGatosa)

Se pueden ajustar las cantidades en funcin de los ttulos de las materias primas. Ciertas cpulas contienen componentes de origen animal especialmente peptonas.

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ANEXO N 2 TABLA DIFERENCIACIN ESPECIES DE LISTERIA

Table 1. Differentiation of Listeria species Acid produced from

Species

-Hemolysisa Mannitol Rhamnose Xylose

Virulenceb

L. monocytogenes L. ivanoviic L. innocua L. welshimeri L. seeligeri L. grayie

+ + + -

+ Vd Vd Vd

+ + + -

+ + -

Placa agar sangre cordero. Ensayo en ratn. c Cepas fermentadoras de ribosa son clasificadas como Listeria ivanovii subsp. Ivanovii. Cepas no fermentadoras de ribosa son clasificadas como .Listera ivanovii subsp. londiniensis. d V biotipos variables. e Incluye dos subespecies: L. grayi subsp. Murrayi que reduce nitratos a nitritos y L. grayi subsp. grayi que no reduce nitratos a nitritos.
b