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Determinao da atividade da bomba potssio ATPase

Docente: Ana Preto Licenciatura: Biologia e Geologia

Autores: Alexandra Monteiro Barbara Cristvo Hugo Ferreira Maria Gomes Maria Soares 1

ndice

Resumo - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 3 Introduo e objetivos - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 4 Material e mtodos - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 6 Resultados - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -9 Discusso - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 13 Bibliografia - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 14

Abstract ou resumo
No mbito da disciplina de Bioenergtica e Metabolismo, na sua componente prtica procedeu-se determinao da actividade da Na+/K+ATPase em membranas plasmticas sinpticas isoladas de fgado de porco. Numa primeira fase, procedeu-se homogeneizao do tecido num homogeneizador.De seguida passamos ao fraccionamento celular por centrifugao diferencial, utilizando primeiro o homogeneizador de Blender e de seguida o homogeneizador de Potter, com o objectivo de separar as diferentes fraces subcelulares das clulas do fgado. Posteriormente procedeu-se a determinao da concentrao de protena da fraco subcelular atravs do mtodo colorimtrico do Reagente de Biureto com o qual se construiu uma curva padro de BSA. Numa segunda fase, procedeu-se actividade da Na+/K+ ATPase em membranas plasmticas, pela anlise do fosfato (pelo Reagente de Molibdato) resultante da hidrlise de ATP, em diferentes condies experimentais (tais como o uso de inibidor Uabana ou ausncia de substrato NaCl e KCl), construindo-se uma curva padro de fosfato. O valor da actividade especfica da Na+/K+ ATPase obtido no final da experincia foi 5.6 nmol Pi/mg protena/hora.

Introduo e objetivos
Este trabalho foi desenvolvido no mbito da unidade curricular Bioenergtica e Metabolismo, e tem como principal objectivo determinar a actividade da bomba Na+/K+- ATPase em membranas plasmticas isoladas do fgado do porco. Para a realizao do estudo foram utilizados os mtodos da homogeneizao, centrifugao diferencial e centrifugao em gradiente de densidade para separar as diferentes fraces subcelulares das clulas do fgado, seguidos do mtodo do Reagente de Biureto para a quantificao proteica. A Homogeneizao consiste na utilizao de homogenizadores mecnicos para ruptura das clulas. O homogeneizado constituido pelos organelos das clulas lisadas suspendidas numa soluo de sacarose. O mtodo da Centrifugao Diferencial baseia-se nas diferenas de velocidade com que as partculas sedimentam no fundo de um tubo de centrifugao. Sujeitas a uma determinada fora de centrifugao, as estruturas relativamente grandes, densas e pesadas, sedimentam mais rapidamente [1]. A Centrifugao em Gradiente de Densidade consiste em sujeitar uma suspenso de partculas com diferentes densidades, a uma fora centrfuga constante, mas num meio de densidade gradualmente varivel, de uma extremidade outra do tubo [2]. Normalmente, utiliza-se sacarose para criar umgradiente de densidade num tubo de centrifugao. A quantificao proteica foi realizada utilizando o mtodo colorimtrico do Reagente de Biureto, que consiste numa reaco da protena com o reagente de biureto (essencialmente hidrxilo de sdio e sulfato de cobre), formando-se um complexo de cor violeta. O complexo corado o produto da coordenao do io Cu2+ com os pares de electres desemparelhados do tomo de azoto da protena e do oxignio da gua [3]. Este complexo formado posteriormente colocado no espectrofotmetro e lida a absorvncia a 540nm. Falamos assim da Lei de Beer-Lambert, que diz que a absorvncia directamente proporcional espessura e concentrao. No segmento da realizao da experincia, procedeu-se determinaoda actividade da Na+/K+- ATPase em membranas plasmticas isoladas do fgado do porco, pela anlise do fosfato resultante da hidrlise de ATP, utilizando uma curva padro de fosfato. A maioria das clulas animais possui diferentes concentraes de Na+ e de K+ entre o meio interno e o meio circundante, sendo a concentrao de Na+ no meio interno inferior e a de K+ superior em relao

Fig1. Bomba Na+/k+

ao meio externo. A protena responsvel pelo transporte activo que ocorre denominada bomba Na+/K+, e mantem estas concentraes diferentes, obtendo a energia necessria no ATP.

Por definio, transporte activo um processo que desloca solutos contra o seu gradiente electroqumico e que est ligado a uma fonte de energia. Esta pode ser o ATP (transporte activo primrio) ou um gradiente transmembranar de um segundo soluto (transporte activo secundrio) [4]. A bomba Na+/K+ realiza transporte activo primrio, onde ocorre gasto de energia para transportar os ies Na+ e Ka+ de zonas com baixa concentrao para zonas com alta concentrao.

Material e mtodos
Material: Fgado de porco Equipamentos: Centrifuga de Bancada; Homogeneizador de Potter. Reagente e solues: Soluo isotnica de sacarose 0,25 M tamponizada com Hepes-Tris 20 mM (pH 7,4); Reagente de Biureto; TCA (cido Tricloactico); Reagente de Molibdato; KH2PO4 5mM; Tampo pH 7,0; MgCl2 0,1M; NaCl 1M; Uabana. Protocolo: Parte I Fraccionamento celular e centrifugao diferencial: Obteve-se 20g de fgado de porco sacrificado recentemente e mergulhou-se numa soluo isotnica de sacarose 0,25 M tamponizada com Hepes-Tris 20 mM (pH 7,4) fria (meio de isolamento MI). Com o auxlio de um bisturi cortou-se, finamente, o tecido mantendo se sempre no frio (4C). Homogeneizou-se o tecido em 200 ml de MI, usando primeiro o homogeneizador Imagem 1 Cortar o tecido finamente de Blender (velocidade 2) de forma a obter uma massa uniforme e de seguida filtrou-se usando uma vareta e um funil com papel de filtro para remover o tecido insolvel. Posteriormente, homogeneizar utilizando um homogeneizador de Potter (previamente passado por MI e mantido no gelo), rodando a 300-400 rpm. Durante o decorrer deste processo todo o homogeneizador teve que se manter no gelo.

O homogeneizado foi vertido para uma proveta. DividiuImagem 2 Homogeneizador de Blender

se equitativamente por 4 tubos de centrifuga (30 ml), acertando os pesos na balana com MI e centrifugar a 5500 xg (rotor 12166) durante 2min a 4C. O homogeneizado teve que se manter no frio enquanto se aguardava pela preparao do gradiente de sacarose. Por inverso decantou-se os sobrenadantes para tubos limpos em que posteriormente os seus pesos foram acertados. Imagem 3 Homogeneizador de Potter Centrifugou-se a 12000 xg durante 12 min. Desprezou-se os sobrenadantes (contm vesculas mais leves de RE como a fraco celular solvel). Ressuspendeu-se cada um dos sedimentos P2 obtidos em 800 l de MI (400 + 400 l para lavagem do tubo e tip) com o auxlio da vareta de vidro e ponta azul cortada em bisel, e verteu-se todos os P2 para o tubo de vidro para homogeneizar a suspenso. Retirou-se 600 l para 2 tubos Eppendorf e congelou-se a -20C para a aula P3. Retirou-se tambm 300 l para um Eppendorf e congelou-se a -20C para quantificao proteica. Por fim, procedeu-se determinao da concentrao proteica da suspenso SPM atravs da preparao duma curva de calibrao com padro BSA. Determinao da quantificao da protena: Identificou-se e preparou-se os tubos de acordo com a ordem indicada na tabela I disponibilizada pela docente, presente na seco de anexos. Adicionou-se 50 l de amostra (suspenso fraco MP) aos tubos 4 e 5.Misturou-se com a ajuda de um vrtex. Adicionou-se a cada tubo 2 ml de Reagente de Biureto, agitando de novo. Colocou-se os tubos num copo de gua tpida e deixou-se reagir cerca de 10 min. Leu-se a D.O. a 540 nm. Com os valores obtidos construiu-se uma curva Imagem 4 Medio da D.O a 540 nm de calibrao D.O vs. Quantidade (mg) de protena padro. De seguida, determinou-se a concentrao de protenas nas amostras.

Parte II Determinao da actividade da Na+/K+-ATPase em membranas plasmticas sinpticasisoladas de fgado de porco:


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Imagem 5 - Agitar no Vortex

Inicialmente uma srie de tubos cnicos de vidro de centrfuga, de acordo com o que est indicado na tabela que foi disponibilizada pela docente, presente na seco de anexos, ajustando o volume final a 2ml (agitando brevemente no vrtex). Deixou-se que a temperatura equilibra-se num banho a 37C. Iniciou-se a reaco pela adio de 100 l de ATP. Controlou-se o tempo com um cronmetro. Agitou-se brevemente no vrtex aps adio de ATP. Procedeu-se do mesmo modo para os outros 3 Imagem 5 Agitar no vrtex tubos com intervalos de 1 minuto entre cada um. Deixouse que a reaco decorre-se durante 30 minutos. Parou-se a reaco pela adio de 2 ml de TCA (cido tricloroactico) a 10% frio, com intervalos de 1 minuto entre os diferentes tubos, tal como se fez ao adicionar ATP. Aps a adio de TCA, agitou-se o tubo no vrtex e colocou-se imediatamente em gelo. Centrifugou-se as suspenses numa centrfuga de Imagem 6 Banho a 37C para equilibrar bancada durante 5 minutos a cerca de 400 rpm (na marca anterior da velocidade mxima), a fim de sedimentar a protena precipitada pelo TCA. Recolheu-se 2 ml de cada sobrenadante para diferentes tubos, que se designou por amostras I, II, III e IV, respectivamente. Completou-se a experincia pela construo de uma curva padro de fosfato de acordo com a tabela III, disponibilizada pela docente, presente na seco de anexos. Adicionou-se a cada tubo 2 ml de Reagente de Molibdato, recentemente preparado, para a determinao do fosfato. Deixou-se decorrer a reaco exactamente Imagem 7 Preparao das amostras durante um minuto e leu-se a absorvncia a 660 nm. Calculou-se a quantidade de fosfato inorgnico presente em cada tubo e construiu-se um grfico de barras exprimindo a quantidade de ATP hidrolisado nos ensaios I, II e III em nmoles de Pi por mg de protena por hora. Por fim, calculou-se a actividade de Na+/K+-ATPase das MP isoladas.

Resultados
Parte I Para determinao da concentrao de protena utilizou-se o mtodo colorimtrico do reagente de biureto. De seguida medimos a absorvncia (a 540nm) da suspenso proteica, e, obtivemos a seguinte tabela:

Tabela I absorvncia (540nm) da suspenso proteica dos tubos 1 a 5.

Grupos 1 2 3 4 5
Mdia

Tubo 1 Tubo 2

Tubo 3

Tubo 4

Tubo 5

0 0 0 0 0 0

0.079 0.115 0.072 0.122 0.078 0.093

0.168 0.240 0.147 0.227 0.159 0.188

0.155 0.210 0.419 0.215 0.378 0.193

0.177 0.230 0.215 0.246 0.381 0.217

*Os valores a vermelho foram eliminados para obtermos uma melhor curva de calibrao com padro

De seguida calculamos as concentraes de BSA e obtivemos o seguinte grfico:

Curva de calibrao com padro BSA


Absorvancia (540nm)
0.2 0.15 0.1 0.05 0 0 0.5 1 1.5 2 2.5 concentrao (mg/ml) Figura 1: Relao entre valores de absorvncia e concentrao de BSA. O grfico foi obtido utilizando os valores da tabela I. A recta de regresso linear obtida permite calcular valores de concentrao de protenas a partir de absorvncias.

Parte II

Tabela II valores de absorvncia e concentraes dos tubos 1 a 7.

Tubos

Absorvncia Concentrao de KH2PO4 (M) 1 0 0 2 0.170 500 3 0.340 500 4 0.513 1000 5 0.928 1500 6 1.218 2000 7 1.972 800 Amostra 0.592 I Amostra 0.595 II Amostra 1.245 III Amostra 0.200 IV

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A partir da seguinte tabela, construmos o seguinte grfico:

Curva Padro de Fosfato


2.5 Absorvncia a 660nm 2 1.5 1 0.5 0 0 1000 2000 3000 4000 5000 KH2PO4 0,5 M(ml) Figura 2: Relao entre valores de absorvncia e concentrao de KH 2PO4. O grfico foi obtido utilizando os valores da tabela II. E a recta de regresso linear permite-nos calcular a concentrao dos valores restantes na tabela II. y = 0,0005x + 0,0997 R = 0,982

Utilizando a equao da recta de regresso linear da figura 2, e substituindo o x pelas absorvncias das amostras I, II, II, IV calculamos a concentrao de fosfato inorgnico:

Tabela III concentraoes das amostras I a IV. Estes valores foram obtidos atravs da equao da figura 2 (y=0.0005x+0.0997).

Amostra

Concentrao de KH2PO4 (M)

Concentrao de KH2PO4 (nM)

I II III IV

984.6 990.6 2290.6 200.6

0.9846 0.9906 2.2906 0.2006

Depois realizamos os clculos para o resultado ficar em nmol/mg/hora e finalmente obtivemos o seguinte grfico de barras:

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9 8 7 6 PI/mg/h 5 4 3 2 1 0 PI/mh/h

Quantidade de ATP hidrolisado

1 7.8768

2 7.9248 Amostras

3 2.3248

4 1.6048

Figura 3:quantidade de ATP hidrolisado nas amostras I, II, III e IV.

Uma vez que a amostra IV no apresenta atividade, fomos subtrair o seu valor s amostras II e III. A uabana, um inibidor da bomba sdio potssio ATPase, estava presente na amostra III mas o nosso interesse est em descobrir a atividade especfica da bomba por isso subtramos a amostra II, actividade total, amostra III (figura 4).

Actividade da bomba sodio potassio ATPase (nmol/mg/h)

Actividade final da bomba sdio potssio ATPase


6 5 4 3 2 1 0 II-III 5.6 amostras

Coluna2

Figura 4: Actividade final da bomba sdio potssio ATPase

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Discusso

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Bibliografia
[1] http://www.dbio.uevora.pt/jaraujo/biocel/fracciontecnicas.htm [2] http://www.dbio.uevora.pt/jaraujo/biocel/fracciontecnicas.htm [3] http://portal.ipb.pt/pls/portal/PORTAL.wwv_media.show?p_id=151560&p_settingssetid=1&p_ settingssiteid=235&p_siteid=235&p_type=basetext&p_textid=151561 [4] http://fisiologia.med.up.pt/Textos_Apoio/Membranas/Membranas.pdf Fonte da imagem 1: http://files.eodabiatambem.webnode.pt/20000002641c5742bfb/bomba%20sodio%20potassio.jpg fonte da imagem da capa:

http://www.google.pt/search?tbm=isch&hl=ptBR&source=hp&biw=1366&bih=667&q=bomba+sodio+potassio+ATPase&gbv=2&oq =bomba+sodio+potassio+ATPase&aq=f&aqi=&aql=&gs_l=img.12...2945.11564.0.135 96.27.4.0.23.23.0.85.324.4.4.0...0.0.giGInl6aWss#hl=ptBR&gbv=2&tbm=isch&sa=1&q=bomba+sodio+potassio+ATPase+&oq=bomba+sodio +potassio+ATPase+&aq=f&aqi=&aql=&gs_l=img.3...14682.14682.4.14888.1.0.0.1.0.0 .0.0..0.0...0.0.wdKkHemjiy4&pbx=1&bav=on.2,or.r_gc.r_pw.r_qf.,cf.osb&fp=a6afa2d8 e317a93c&biw=1366&bih=667

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