TLC - Cromatografia de camada fina

Qumica Analtica / JCM

Cromatografia de camada fina

TLC - Thin Layer Chromatography planar / adsoro / zonal / analtica possibilidade de desenvolvimento bidimensional e de quantificao

Fases estacionrias
Adsorventes / diferentes de absorventes actividade de um adsorvente determinada pela sua rea superficial, a sua natureza qumica e o arranjo geomtrico dos tomos superficiais propriedades de um adsorvente:
no deve dissolver na fase eluente no deve reagir com a fase mvel no deve reagir com os solutos deve dar resultados reproductveis o processo de adsoro deve ser reversvel o adsorvente no deve ser muito caro
distncia percorrida pelo soluto Rf = ----------------------------------------------------------distncia percorrida pela frente do solvente

Camada de fase estacionria : :250 m Camada de fase estacionria 250 m

TLC - adsorventes
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Polares
vrios xidos inorgnicos ( slica, alumina, magnsia)
ordem de eluio dos solutos segue a polaridade destes - solutos polares so fortemente retidos hidrocarbonetos saturados < hidrocarbonetos aromticos < teres < steres aldedos cetonas < lcoois aminas < amidas < cidos carboxlicos

No-polares
carvo activado
ordem de eluio segue a polarizabilidade das molculas MAIS RETIDOS - compostos aromticos, homlogos de maior peso molecular, molculas com tomos de halognio ou enxofre

F o rte s s ilic a g e l a lu m in a c a rv o a c tiv a d o

M d io s h id r x id o d e c lc io c a rb o n a to d e c a lc io m a g n s ia

F ra c o s ta lc o a m id o s u c ro s e

cidos : : slica (separa cidos) cidos slica (separa cidos)

Bsicos: Alumina / /magnsia (separa bases Bsicos: Alumina magnsia (separa bases

TLC - adsorventes
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Slica gel
suporte mais popular (5-10 m) O preparada por hidrlise do silicato de sdio seguida de condensao e polimerizao actividade resulta da presena dos grupos Si -- OH (silanol) superfcie controlo da actividade por aquecimento durante a preparao
activao recomendada (110 / 30 - 60 min)
Si O

OH Si O O

OH O

Slica gel ligeiramente cida

esterides, amino-cidos, lcoois, hidrocarbonetos, lpidos e vitaminas

Preparao
50g / 60 ml gua destilada - espalhar rapidamente / secar / activar
H - sem impregnante G - com 13% de sulfato de clcio F254 - com indicador fluorescente

impregnao com nitrato de prata (20%) - separao de compostos com duplas ligaes (menos duplas > Rf)

TLC - adsorventes
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Alumina

O Al

O Al O

Ainda muito comum Al Preparada por condensao do hidrxido de O alumnio hidratado A actividade depende quer dos tomos de oxignio quer dos de alumnio
mais difcil de preparar dado que geralmente contem mais impurezas

o contedo de gua muito importante para obter resultados reproductveis

activao a 75 - 110 / 30 - 60 min

Pode ser obtida com superfcie cida, neutra ou bsica (a mais comum)
separao de corantes, vitaminas e alcalides

Preparao
30g / 40 ml de gua destilada - espalhar rapidamente / secar e activar
pode conter impregnantes e indicadores de fluorescncia

TLC - adsorventes
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Celulose
material orgnico diferente da cromatografia de papel
papel - apresenta espaos vazios onde se acumula o solvente - a difuso leva ao alargamento das manchas celulose - so usadas partculas pequenas / distribuio mais regular - menor difuso

Celulose usada para separar compostos hidroflicos tal como acares, aminocidos, ies inorgnicos solveis e cidos nuclicos - solues aquosas
geralmente aderem muito fortemente slica e alumina

Tal como em papel o mecanismo predominantemente de partilha

Preparao
400 mg amido / 10 ml gua destilada + 90 ml de gua a ferver + 20 g de celulose
o grau de hidratao depende do tempo de agitao agitao durante muito tempo leva formao de gel

espalhar rapidamente / secar a 110 pode conter indicadores de UV

Placas comerciais
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Adsorventes
Slica; alumina

Suportes
Vidro, alumnio ou plstico (tereftalato de polietileno)

Espessura
0,25 mm / 0,5 mm / 1,0 mm / 2,0 mm Maior amostra exige maior espessura (TLC preparativa)

Activao
15 minutos ao ar + 30 minutos a 110 C Nalguns casos pode elevar-se a temperatura a 200 C (4 horas) para maior activao

Conservao
Aps secagem / activao as placas devem ser guardadas num excicador As placas de slica desactivam-se muito rapidamente
50% de actividade perde-se em 3 minutos numa atmosfera com 50% de humidade

TLC outros adsorventes

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Kieselguhr
Diatomite - terra de diatomceas
slica com plncton marinho (diatoms)

elevada porosidade e rea superficial - muito usada como ajudante de filtrao muito usada como suporte de fase estacionria lquida - partilha

Sephadex
gel dextran - hidroflico e neutro habitualmente usado na filtrao em gel - de acordo com os pesos moleculares

Fase reversa / inversa

a separao de soluto de polaridade semelhante difcil com slica gel mesmo para molculas de pesos moleculares diferentes possvel alterar a superfcie da slica (OH reagem com silanos orgnicos) RP-2, RP-8 , RP-18
a fase estacionria orgnica apresenta uma reteno preferencial dos compostos nopolares (fase reversa) e a separao depende dos pesos moleculares

a fase mvel polar (acetonitrilo) cromatografia de partilha

TLC - fase eluente

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Caractersticas - a fase mvel o componente de mais fcil substituio

boa qualidade - a composio no deve variar de lote para lote no reactiva - de outro modo os resultados seriam difceis de interpretar baixo ponto de ebulio - prefervel para a secagem da placa Alta pureza (Analar) e preo razovel !!

Escolha
a fase eluente deve ser activa ( retirar o soluto da fase estacionria) e selectiva (separar dois solutos diferentes) actividade (capacidade de eluio) em relaco a slica-gel
gua > metanol > etanol > propanol > propanona > triclorometano > diclorometano > benzeno > metilbenzeno > tricloroetileno > tetraclorometano > ciclohexano > hexano

Misturas de solventes
o mais usual - capacidade de eluio no proporcional composio

amostra desconhecida
usar slica gel e um solvente pouco polar (pentano) acrescentar solvente polar (2, 4, 8, 16, 32%)

Separao de pigmentos
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Srie eluotrpica para adsorventes polares

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Tabela definida para placa de alumina

A escala vai at cerca de 0,75 para uma placa de slica

Uso de misturas de misturas de solventes (slica)

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J.C. Touchstone (Practice of TLC)

Uso de misturas de misturas de solventes (slica)

Qumica Analtica / JCM

J.C. Touchstone (Practice of TLC)

Uso de misturas de misturas de solventes (slica)

Qumica Analtica / JCM

J.C. Touchstone (Practice of TLC)

Exemplo de fases mveis

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TLC - aspectos experimentais

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Preparao
preparar a mistura eluente nas propores adequadas ao ensaio saturar a cmara - manter fechada e temperatura do ensaio evitar evaporao da mistura eluente - alterao da composio controlar o grau de humidade da placa

Aplicao da amostra
usar micropipeta (1 -2 l) - no danificar o suporte colocar a amostra a cerca de 1,5 cm da base - todas a amostras na mesma linha a mancha deve ser de reduzidas dimenses (1,5 mm)
no caso de amostras diludas colocar por diversas vezas, secando aps cada aplicao

evitar que a mancha toque a superfcie do solvente (5 - 8 mm)

Desenvolvimento
manter a temperatura deixar desenvolver o cromatograma at cerca de 3 cm do topo da placa

Revelao
usar luz UV (254 / 366 nm) ou revelador adequado (H2SO4) determinar Rf, definir tamanho das manchas - quantificar se desejvel

Placa de TLC
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Saturar a cmara / equilibrar a placa

Efeito da insaturao da placa

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TLC - maus exemplos

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Polaridade
soluto muito polar retido na origem

Amostra em demasia / amostra mal seca

demasiada amostra cria tailing / amostra mal seca cria anis

Cmara mal saturada

saturao insuficiente leva a demasiada evaporao da fase eluente

Colocao muito baixa / demasiada humidade

amostra baixa difunde-se na fase eluente / muita humidade leva a maior difuso das manchas e tambm a uma separao deficiente

TLC - reveladores
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Mtodos qumicos / mtodos fsicos Mtodos no-destructivos

radiao visvel e UV (254 nm e 366 nm) Vapor de iodo
evaporao / placa sem alterao

gua indicadores de pH (bromocresol / bromofenol)

Mtodos destructivos
50% H2SO4 / 110 C 5% dicromato de potssio ou 5% cido ntrico em 40% H2SO4 seguido de aquecimento a 110 C UV (vitaminas) / gua (hidrlise - steres) / iodo (cidos gordos poliinsaturados) Reagentes especficos so conhecidos para quase todas as classes de compostos

NOTA: o uso de mtodos destructivos desaconselhado sempre que a quantificao seja o objectivo da separao cromatogrfica

TLC - amostras
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Classificao (energias de adsoro)

Grupo 1: molculas neutras - hidrocarbonetos
foras de Van der Waal - fsicas (no h formao de ligaes qumicas grupos metileno - no h separao por peso molecular separaes boas e manchas redondas Energias de adsoro (slica gel)
Grupo
R-CH3 R-CH2R-Cl R-O-R R-CHO R-NO2 R-CO2R R-COR R-OH R-NH2 R-CO2H

Qi
+0.07 -0.05 +1.32 +3.61 +4.97 +5.71 +5.27 +5.27 +5.60 +8.00 +7.60

interao
VdW VdW dip. ind. receptor H receptor H dip.ind rec.H /dip.ind. rec.H/dip.ind. H-H H-H H-H

Grupo 2: ligaes polares (C - Cl / C - NO2)

dipolo induzido - fsicas / manchas redondas

Grupo 3: molculas polares ( cidos, lcoois)

Grupos de superfcie polar - nucleoflica interao com adsorvente via lig. H-H forte - possibilidade de caudas nas manchas

Grupo 4: ligaes qumicas (covalentes)

ligaes fortes - m separao

A forma das manchas depende do equilbrio de concentraes estabelecido entre as fases mvel e estacionria

Cs

Cs

Cs

Cm

Cm

Cm

Casos especiais
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TLC preparativo
Colocar bandas largas de amostra e desenvolver a placa Retirar a slica de cada mancha e dissolver usando um solvente adequado Analisar noutro equipamento (HPLC, LCMS, FTIR)

TLC bidimensional
Colocar a amostra no lado esquerdo da placa e desenvolver Secar a placa e desenvolver de novo noutro eluente (colocar o lado esquerdo da placa para baixo) Revelar Separao de aminocidos
F. estacionria: slica gel F. Mvel 1: tolueno:2-cloroetanol:piridina F. Mvel 2: clorofrmio:lcool benzlico:ac. Acrtico

1: ac. Asprtico, 2: ac. Glutmico, 3: serina 4: alanina, 5: glicina, 6: alanina, 7: metionina, 8: valina, 9: isoleucina, 10: cisteina

TLC - vantagens e desvantagens

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Vantagens
Tcnica simples e verstil - aplica-se a quase todas as classes de compostos Pequenas quantidades de amostra sem grande preparao A separao pode ser obtida com custos razoveis - bom adsorvente e solventes puros As separaes podem ser obtidas em tempos relativamente curtos
comea a no ser vantagem em relao s pequenas colunas de HPLC

O processo de separao visvel e pode ser melhorado alterando suportes ou a fase eluente
ao contrrio do GC ou HPLC e que os solutos muito retidos podem passar despercebidos

Desvantagens
A preparao das placas complicada
est a cair em desuso (aquisio de placas preparadas)

A quantificao possvel mas implica um enorme custo financeiro

por isso o TLC a tcnica de separao cromatogrfica tipicamente qualitativa / semiquantitativa Colocao de amostras em quantidades conhecidas e quantificao por comparao

Qumica Analtica / JCM

Linha de frente do solvente

Distncia percorrida pelo solvente

Distncia percorrida pelo soluto B

Distncia percorrida pelo soluto A

Linha de colocao das amostras

Resoluo = X / 0,5 (d1 + d2); x - distncia entre as manchas; d1 e d2 dimetros das manchas R mnimo = 1 Rf = distncia percorrida pelo soluto / distncia percorrida pela frente do solvente