ENZIMAS

Tema 8

Prof. Martha Pernalete Lic. en Bioanlisis MSc. Bioqumica y Biologa Molecular

Objetivos
n

n n

Analizarelefectodelaconcentracinde sustratosobrelavelocidaddeunareaccin catalizadaenzimticamenteycompararla conunanocatalizada. InterpretarelsignificadodeKM,yVmax AplicarelconceptodeKMyVmaxenla resolucindeproblemas. Interpretarlarepresentacingrficade LineweaveryBurk.

Contenido
n

n n n n n n n

Relacinmatemticaentrelavelocidaddeunareaccinqumica ylaconcentracindesustrato,enreaccionescatalizadasyno catalizadasenzimticamente. Ordenesdereaccin.RepresentacingrficadelaVelocidad (inicial)vsconcentracindesustrato PostuladosdelateoradeMichaelisyMenten Reaccionesdepseudoprimerorden RepresentacingrficadelaecuacindeMichaelisyMenten. IdentificacindeKMyVmaxenungrficodeVovs[S] RelacinentreelvalordeKMylaafinidadenzimasustrato. EjemplosdeaplicacindelosconceptosdeKMyVmax. RepresentacingrficadeLineweaveryBurk:Utilidaddedicha grfica.

ComofuncionanlasEnzimas?
lEstas

proporcionan un ambiente especfico dentro del cual una reaccin determinada es energticamente ms favorable
SITIO ACTIVO SUSTRATO

ENZIMA

Quimotripsinaunidaaunsustrato

PRODUCTO

Factores que afectan la velocidad de una reaccin enzimtica

v v v v v v

Temperatura pH Concentracin Concentracin Concentracin Concentracin Activadores

de la Enzima del Producto del Sustrato de Inhibidores o

Bioqumica,AspectosEstructuralesyvasmetablicas McGrawHill,1996

Introduccin
Laconversin: S P

SemideLaVelocidad paracaracterizaralasEnzimas

Velocidad

Revelalavaquesiguenlosreactivos Indicaelmecanismodereaccin

CinticaEnzimtica

El enfoque central para estudiar el mecanismo de una reaccin catalizada por una enzima, consiste en medir la velocidad de la reaccin y la forma en como sta se modifica en respuesta a cambios en los parmetros experimentales.

CinticaEnzimtica

Velocidaddeunareaccin:sedefine comolacantidaddemateriainicial, sustrato,transformado,ocomola cantidaddecompuestofinal,producto, formado,porunidaddetiempo.

Como se mide la velocidad?

BajoCondicionesdelaboratorio yenpresenciadesustratos competidoresoInhibidores

ENZIMAS BUFFER
Sustrato
Inhibidores

DeduccinfuncionesFisiolgicas delosmecanismosreguladoresde ENZIMAS

Espectrofotmetro

Conceptos

Ordenesdereaccin
n

ElOrdendeunareaccinelemental: correspondealnmerodemolculas quedebencolisionarenforma simultneaparagenerarunproducto

Atemperaturaconstante,laVelocidaddeunareaccinelemental,es proporcionalalafrecuenciaconlaquelasmolculasquereaccionan serenen.

Ordenesdereaccin

Reaccindeprimerorden:esunimolecular
AP
1 V=k[A]

Lavelocidaddelareaccinencualquierpuntodeltiempo esproporcionalalaconcentracindeA

Reaccindesegundoorden:esbimolecular
2AP
2 V=k[A]

A+BP
1 1 V=k[A] .[B]

Elordendeunareaccinesuntrminoqueseutilizaparadefinirsta,enfuncin delosfactoresquedeterminansuvelocidad.

Anlisismatemticodeunareaccin catalizadaporenzima
MichaelisyMentenanalizarondicharx n Laecuacindeduceapartirdeun modelodeaccinenzimticaendonde:
n
K E+SESE+P K n K ,k yk :sonlasconstantesde 1 1 2 velocidad
2 1

K1

Postulados:LeonorMichaelisyMaud Mentel,1913 1. La enzima tiene un nico sustrato. 2. El complejo E-S se encuentra en estado estacionario. 3. Bajo condiciones de saturacin, todas las molculas de enzima intervienen en la formacin del complejo E-S. 4. Cuando toda la enzima se encuentra en forma del complejo E-S la velocidad de la reaccin es mxima.

EstadoEstacionario

Paraunmodelosimple: E+SESP Donde Et=E+ES

Tomadode:BioqumicaAspectosestructuralesyvasmetablicas. Interamericana,McGrawHill

Efectodelaconcentracindesustrato,sobrelavelocidad Inicialdeunareaccincatalizadaporunaenzima LeonorMichaelisyMaudMentel,1913

E + SES
K1 K2

K1

Expresinalgebraicadelacurva

Ecuacin de Michaelis-Menten

ESE + P
Vi=

V [S] max K +[S] M

Donde

E:enzima S:sustrato P:producto ES:complejoEnzima+Sustrato

Vi :Velocidadinicial Vmax:Velocidadmxima [S]:concentracindesustrato KM: constantedeMichaelis [(K1+K2)/K1]

Representacingrficadelaecuacin deMichaelisMenten
Se observa el efecto de la concentracin de sustrato, sobre la velocidad inicial de una reaccin catalizada por una enzima

Nelson y Cox, 2001

K m:ConstantedeMichaelis:Definelaafinidaddelaenzimaporsusustrato

RetomandoOrdenesdereaccin

Lavesindependiente delaconcentracin desustrato

Cintica de orden cero

Cintica de primer orden

MathewsyvanHolde,1998

Efectodelaconcentracindesustratosobrelavelocidadinicial Deunareaccincatalizadaporunaenzima

Tomadode:Bioqumicailustrada.Harper Ladependenciadelavelocidaddereacciny[s]yKm,puedeilustrarse alevaluarlaecuacindeMMbajo3condiciones:ptos.a,bycenlagrafica

Anlisisdelarelacinentrelavelocidaddereaccin y[s]yKm

Puntoa:la[s]<<km Puntob:la[s]=km Puntoc:la[s]>>km

Viesproporcional ala[s] Vi=Vmax/2 Vi=Vmax

Efectodelaconcentracindelsustratosobrelavelocidaddereaccin

LaE1:Kmpequea Altaafinidad

LaE2:Kmgrande bajaafinidad

RichardHarvey,PamelaChampe,2006

TRANSFORMACINDELAECUACINDEMM ENUNAECUACINLINEAL(y=mx+b)

Seinvierte

Sefactoriza

Sesimplifica

RepresentacindeLineweaverBurk

(y=mx+b)

Pendiente

K 1 1 M 1 = + v o V V max max [S]

y=1/Vo x=1/[s] b=1/Vmx m=Km/Vmx (pendiente) NelsonyCox,2001

Problemas:

Losdatosdevelocidady[S]quesemuestranacontinuacinfueronobtenidospara LareaccinSPcatalizadaporlaenzimaE
[S] (mol/L) 1,3x105 1,5x104 2,0x104 2,0x103 2,0x102 2,0x101 V (microm/min) 12 45 48 60 60 60

SedeseaconocerelvalordekmdelaenzimaEpor elsustratoS

v=

V [S] max K +[S] M

Despeje:km Km:5x105M/L

Tarea: Losdatosdevelocidady[S]quesemuestranacontinuacinfueron obtenidosparaLareaccinSPcatalizadaporlaenzimaE SedeseaconocerelvalordekmdelaenzimaEporelsustratoS

[S] (mol/L) 1/S V (microm/min) 1/V

5,0x106 1,3x105 1,5x105 3,0x105 5,0x105 1,0x104 2,0x104 4,0x104

5,4 12,0 14,0 22,8 30,0 40,0 48,0 53,3

K 1 1 M 1 = + v o V V max max [S]

Invertirlosvalores Buscarunaescala Graficar Verpuntosdecortey CalcularKmyVmax

Solucin
Invertirvalores:
1/s 200000 76923 66667 33333 20000 10000 5000 2500 1v 0,185 0,083 0,071 0,044 0,033 0,025 0,021 0,019

Graficar:

DOBLERECIPROCO
0,250 0,200 0,150 0,100

m:8x107 (pendiente)

b:0,0165
1/v 200000 100000

0,050

100000 0,050 0,100 0,150 0,200 1/s

200000

300000

Delagraficasesacanalgunosvalores,parameterlosenlasformulas

y=mx+b

K 1 1 M 1 = + v o V V max max [S]

y=1/Vo m=Km/Vmx (pendiente)

b =1/Vmx Vmx=1/b

m=Km/Vmx Km=Vmx x m

Resultado: x=1/[s] b=1/Vmx Km:5x105 Vmax:62.5

Resumen
LaecuacindeMichaelisMenten,ilustra entrminosmatemticoslarelacin entrelavelocidaddereaccininicialy laconcentracindesustrato. n Latransformacindedichaformula,en unaecuacindelarecta,facilitala determinacindelosvaloresdeVmaxy kmparaunaenzimadeterminada.
n

Bibliografa
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FundamentosdeBioqumica.VoetVoetPratt. 2edicin2007Capitulo12:Catlisisenzimtica. EditorialmedicaPanamerica Bioqumica.RichardHarvey,PamelaChampe.2006 Bioqumica.JuanC.DazZagoyayMarcoAntonioJarez Oropeza. era 1 edicin.2007.EditorialMcGraw Hill. era Bioqumica.Mathews.3 edicin.2005.Capitulo11:Enzimas: catalizadoresBiolgicos.Editorial Pearson. LehningerPrincipiosdeBioqumica.NelsonyCox.4taedicin. EdicionesOMEGA Bioqumica,AspectosEstructuralesyvasmetablicas.EditorialMc Graw Hill.1996. SeminarioEnzimas(2008,2009) BioquimicaIlustrada.Harper.28Edicin.Capitulo:Enzimas: Cintica.2010