Revista Colombiana de Fsica, vol. 41, No.

1, Enero 2009

Medida de la Actividad Antioxidante de la Cerveza Mediante Resonancia Paramagnetica Electrnica (EPR)

Jorge E. Muoz Bravo1, R. M. Garca2, Miguel J. Espitia R.3, O. Almanza1
Grupo de Fsica Aplicada Departamento de Fsica, Universidad Nacional de Colombia, Bogot, Colombia 2 Departamento de Qumica, Universidad Nacional de Colombia, Bogot, Colombia 3 Proyecto Curricular de Ingeniera Catastral y Geodesia, Universidad Distrital Francisco Jos de Caldas, Bogot, Colombia
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Recibido 22 de Oct. 2007; Aceptado 15 de Oct. 2008; Publicado en lnea 5 de Ene. 2009

Resumen
La actividad oxidativa de la cerveza fue determinada a partir de medidas realizadas con la tcnica de Resonancia Paramagntica Electrnica (EPR). Esta se hizo adicionando 0.1 ml de concentracin - fenil - N - ter - butil nitrona (PBN) a 5.1 ml de cerveza Club Colombia desgasificada obtenida con un tiempo de almacenamiento en el mercado de un mes y medio. El PBN acta como una trampa de espin. A partir de un ensayo de oxidacin forzada, a la temperatura de 60 C, se midi la intensidad relativa de la primera lnea en la seal espectroscpica de EPR, del aducto PBN radical, con el fin de evaluar el incremento en los radicales libres (radicales *OH) que se producen en la oxidacin de la cerveza. La medida del tiempo de retardo (lag time) en la generacin de los hidroxilos, es un indicador de la estabilidad del sabor de la cerveza. Palabras claves: EPR, PBN, Actividad antioxidante.

Abstract
The oxidative activity of beer was determined from measures made with the technique of Electron Paramagnetic Resonance (EPR). This was done adding 0,1 ml of concentration - phenyl - N - tert - butyl nitrone (PBN) to 5.1 ml of the desgasificated Club Colombia beer obtained on the market with a storage time for a half month. The PBN acts like a trap of spin. From a test of forced oxidation, to 60 C of temperature, the relative intensity of first line in the EPRs spectroscopic signal was measured, of PBN radical adduct, with the purpose to evaluate the increase in the free radicals (radical *OH) that take a place in beers oxidation. Lag times measurement is an indicator in the generation of the hidroxyls of beer flavors stability. Keywords: EPR, PBN, Antioxidant activity. 2009 Revista Colombiana de Fsica. Todos los derechos reservados.

1. Introduccin La cerveza ha sido una de las bebidas ms consumidas a lo largo de la historia y en determinadas culturas forma parte de la dieta humana, por lo que en los ltimos aos las cerveceras del mundo se han preocupado considerablemente por la estabilidad de su sabor y calidad. Con frecuencia dicho producto es sometido a almacenamiento prolongado,

que propicia la degradacin oxidativa de los compuestos constituyentes en la que se genera la formacin de radicales libres y productos de oxidacin que se traducen en sabores rancios y que pueden ser perjudiciales para la salud del consumidor. Existen varios tipos de anlisis para determinar de alguna manera la calidad o el grado de oxidacin de este producto.

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Jorge E. Muoz Bravo et al.: Medida de la Actividad Antioxidante de la Cerveza Mediante Resonancia Paramagnetica Electrnica (EPR)

Fig.1 Reaccin de captura de un radical libre con PBN (spin trap).

V. Fogliano ide mtodos para observar la actividad antioxidante [1] y se ha implementado para realizarse en la cerveza [2], pero debido a la toxicidad de los reactivos, el impacto ambiental, la duracin del anlisis y la obtencin de resultados reproducibles, se sugiere el anlisis directo por espectroscpica de Resonancia Paramagntica Electrnica (EPR), que permite la deteccin de radicales libres en el proceso de oxidacin, mediante captura y estabilizacin de espines por reaccin con compuestos diamagnticos liposolubles, tales como - fenil - N - ter - butil nitrona (PBN) [3]. El objetivo de este trabajo es medir el tiempo de retardo de una cerveza nacional por medio de Resonancia Paramagntica Electrnica, generada por el aducto de radicales hidroxilo y el PBN. 2. Aspectos Tericos La tcnica de EPR, mide la cantidad de energa E que toman los electrones desapareados o paramagnticos en un campo magntico H r midiendo la absorcin de microondas , para los momentos dipolares magnticos de espin y orbtales. La condicin de resonancia esta dada por la ecuacin [4]. h ge H r (1) Donde h es la constante de Plack, Land y es el magnetn de Bohr. La diferencia de energa entre el estado final y el inicial del sistema estn relacionados con la frecuencia de radiacin a travs de

vidrio iguales que sern sellados, con el fin de tener una nica atmsfera del origen de la degradacin (16.5 ml de aire) y evitar su evaporacin durante el ensayo de oxidacin forzada (forcing test) a la temperatura de 60 C, realizada dentro de un bao termostato BT40 UN con agitacin constante para garantizar una temperatura uniforme durante las 2 horas de monitoreo. Para una medida se aade 1 ml en la celda plana de lquidos del equipo y entre cada medida se realiza una limpieza rpida con aire a presin. Resonancia Paramagntica Electrnica: Los espectros EPR fueron adquiridos en un espectrmetro Bruker ESP 300, con una potencia de las microondas de 20 mW, amplitud de modulacin 0,195 G (Gauss), frecuencia de modulacin 100 kHz, constante de tiempo t = 327,68 ms y frecuencia de las microondas de = 9,77 GHz. 4. Resultados Despus de realizar el estudio por EPR, se detect la presencia de una seal que corresponde a la formacin del aducto PBN-radical, como se indica en la figura 2. La formacin del aducto tiene lugar por la adicin de especies radicales sobre el carbono en la posicin al grupo nitrosilo en la molcula de PBN, formando un radical ms estable como se muestra en la figura 1. En la figura 2 se observa seis absorciones que corresponde al acoplamiento entre el electrn desapareado de espin 1/2 con el hidrogeno ms cercano (1H, I=1/2) y el nitrgeno (14N, I=1), generando as un triple doblete de igual manera a [4], donde adems utilizan un patrn de Mn2+ para localizar la seal del aducto. Debido a que la intensidad de la seal obtenida para el aducto, es proporcional a la concentracin de espines, es decir, proporcional a la concentracin de radicales libres y como el ancho pico a pico de la seal no cambia en el tiempo, se sigui la variacin de la altura pico a pico en funcin del tiempo de oxidacin de la lnea de absorcin correspondiente a 3457 G. Una vez se inicia el proceso de maduracin se realiza una serie de medidas de EPR, con lo cual se mide el tiempo de retardo (lag time) en la generacin de los hidroxilos como se indica en la figura 3.

g e es el factor de

E E f Ei h .
3. Experimento Muestras y Reactivos: La cerveza es obtenida de una marca nacional comercial Club Colombia, obtenida con un tiempo de almacenamiento desde su embotellamiento de un mes y medio. El PBN fue adquirido de Aldrich. Tratamiento de las Muestras: Se prepara disolviendo 100 l de Etanol Absoluto (EtOH) con 100 l de agua desmineralizada, para luego adicionar 49 mg de PBN en 152 l de la primera solucin y tener una concentracin final de 0.14 M, cuando se agrega 5.1 ml de cerveza Club Colombia desgasificada, bajo agitacin magntica. Para disolver estas pequeas cantidades de disolucin se emplea un agitador de ultrasonido. Esto se hace para dos recipientes de

Fig.2 Espectro caracterstico del aducto PBN-radical de la cerveza a 120 minutos de maduracin

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M. Uchida, S. Suga y M. Ono, Journal American Society of Brewing Chemist 54(4), 205-211, 1996.

Fig.3 Comportamiento de los radicales libres detectados durante el forcing test a 60C del aducto PBN-radical, el cual tiene un lag time de 29 minutos.

Durante los primeros 29 minutos la seal es muy dbil, posteriormente surge la generacin de radicales libres comenzando un incremento drstico y aproximadamente lineal. El aumento de una gran produccin de radicales libres como resultado de la oxidacin es considerado por algunos autores [5-6] como la prdida de las propiedades organolpticas del producto. 4. Conclusiones y Sugerencias El tiempo de retardo de la cerveza Club Colombia obtenida en el mercado con mes y medio de almacenamiento es de 29 minutos durante el forcing test a 60 C. Este lapso de tiempo en las condiciones experimentales desarrolladas, es el significado de la actividad antioxidante endgena de la cerveza en estudio a 60 C, por lo cul el anlisis de la actividad antioxidante por Resonancia Paramagntica Electrnica puede llevarse acabo en diferentes condiciones medio ambientales de proceso y de almacenamiento para buscar mejorar la calidad y estabilidad del producto. AGRADECIMIENTOS Agradecemos al rea Curricular de Fsica, por permitir la realizacin de este trabajo. REFERENCIAS
[1] [2] V. Fogliano, V. Verde, G. Randazzo y A. Ritieni, Journal of Agricultural and Food Chemistry 47, 1035-1040, 1999. M. L. Gonzlez, P. Muiz y V. Valls, Actividad Antioxidante de la cerveza: estudios in Vitro e in vivo, (Cerveza y salud, Universidad de Burgos y Universidad de Valencia, Espaa, 2001). T. A. Vestad, ESR spin trapping. Tesis de Maestra, Departamento de Fsica, Universidad de Oslo, 1999. C. P. Poole y H. A. Farach, The Theory of Magnetic Resonance, (Jhon Wiley & Sons, University of South Carolina, Columbia, 1976). M. Uchida y M. Ono, Journal American Society of Brewing Chemist 54(4), 198-204, 1996.

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