LABORATORIO 2 B&G

NORMAS PARA EL USO CORRECTO DEL MICROSCOPIO PTICO 1.-Quitar la funda protectora del microscopio. 2.-Enchufar/encender el microscopio. 3.-Colocar en primera instancia el objetivo de menor aumento para lograr un enfoque correcto. Este paso en muy importante y se debe realizar siempre, ya que permitir la observacin de una panormica del preparado y la ubicacin de reas de inters para su anlisis posterior. 4.-Subir el condensador utilizando el tornillo correspondiente. 5.-Colocar el preparado sobre la platina, con el cubre-objetos hacia arriba y sujetndola con las pinzas/guas. 6.-Enfoque el preparado mirando a travs del ocular y lentamente mueva el tornillo macromtrico. 7.-Recorra todo el preparado y haga sus observaciones. Elija el sitio donde debe seguir observando a mayor aumento. 8.-Cambie al objetivo de mediano aumento (20 X) y para lograr el enfoque siga moviendo lentamente el tormillo macromtrico. Al cambiar de objetivo, la imagen debe estar ligeramente enfocada gracias a que la mayora de microscopios son parafocales, es decir, una vez logrado el primer enfoque, al pasar al objetivo de aumento inmediato superior la imagen queda en un foco aproximado y solo se debe realizar un ajuste. 9.-Realice la observacin y haga sus anotaciones. Determine cul es la estructura que va a observar a mayor aumento y colquela en el centro del campo. 10.-Cambie al objetivo de mayor aumento. Si realiz el enfoque de manera correcta con el objetivo anterior, al colocar el objetivo de mayor aumento la imagen solo se debe enfocar girando nica y lentamente el tornillo MICROMTRICO. NUNCA se debe utilizar el tornillo macromtrico con los objetivos de mayor aumento, pues al estar ste muy cerca del preparado, se corre el riesgo de partirlo. 11.-Al lograr el enfoque con el objetivo de mayor aumento debe realizar la observacin moviendo constantemente el tornillo micromtrico para variar los planos de enfoque. De igual manera, abra o cierre el diafragma para regular la intensidad de la luz y mejorar el contraste. Haga sus observaciones.

LABORATORIO 2 B&G

12.-Una vez finalizada la observacin, aleje la platina y coloque nuevamente el objetivo de menor aumento. 13.-Retire la muestra. 14.-Limpie la lente objetivo si us medio de inmersin, apague la/s lmpara/s. 15.-Cubra el microscopio con la funda protectora.

Recomendaciones NUNCA daar, rayar, dejar caer las lentes u otros componentes pticos. NUNCA forzar los controles de foco. NUNCA tocar las superficies pticas. Durante la clase se discutir cul es el procedimiento para limpiar las lentes objetivos correctamente.

LABORATORIO 2 B&G

PARTE A: PROCEDIMIENTO PARA OBTENER ILUMINACIN KHLER

El sistema de iluminacin est constituido por las partes del microscopio que producen o captan, reflejan y regulan la intensidad de la luz que se utiliza para la observacin microscpica. Uno de los aspectos crticos a considerar en la microscopa ptica es la fuente de luz que se emplea para iluminar el espcimen. Si la muestra es iluminada de manera inadecuada, la calidad de la imagen que se obtiene se ver afectada, an cuando se disponga de un excelente sistema ptico. La iluminacin ptima debe ser brillante, sin resplandores y en lo posible debe dispersarse de manera uniforme en el campo de observacin. En el ao 1893, el profesor August Khler propuso un mtodo de iluminacin para optimizar la observacin microscpica y la microfotografa, que permite aprovechar al mximo las capacidades de las lentes (objetivos) iluminando la muestra en estudio con un campo de luz uniforme cuyo dimetro sea igual al del rea de captura del objetivo. Los microscopios modernos estn diseados para utilizar la iluminacin Khler.

Trayectoria de la luz en la iluminacin Khler. Modificado de Davison M, Abramowitz M. Optical Microscopy. Olympus Microscopy Resource Center

LABORATORIO 2 B&G

El condensador se desplaza verticalmente hasta obtener una imagen ntida del diafragma de campo. La iluminacin ideal se consigue cuando el condensador se encuentra lo ms cerca de la preparacin. El diafragma de campo regula el dimetro de la apertura de la iluminacin y al cerrarlo se incrementan los contrastes. Los pasos que deben seguirse para lograr la iluminacin Khler son los siguientes: 1- Subir el condensador hasta el tope, introduciendo la lente abatible del condensador para lograr la mxima concentracin de luz sobre la muestra a observar. 2- Enfocar el objeto con un objetivo de poca amplificacin, generalmente de 10x 3- Cerrar el diafragma de campo de la lmpara colectora, con lo que se ver proyectado ste sobre la muestra. 4- Bajar el condensador para enfocar el diafragma, de manera que su imagen se proyecte bien definida sobre la muestra. 5- Centrar la imagen del diafragma de campo con los tornillos para centrado del condensador. 6- Abrir el diafragma de campo, de manera que la imagen de sus bordes se abra y se ilumine todo el campo visual. 7- Ajustar el diafragma de apertura del condensador para lograr mejor contraste, profundidad de campo y poder de resolucin. 8- A cada cambio de lente objetivo, volver a enfocar la imagen con el tornillo micromtrico y ajustar el diafragma del condensador para mejorar el contraste. PARTE A DEL TRABAJO PRCTICO 1. Identificar las partes y familiarizarse con el funcionamiento del microscopio compuesto. 2. Ajustar los componentes para lograr la iluminacin Khler. Identificar y localizar las posiciones de los cuatro planos de apertura y de los cuatro planos de campo. 3. Por qu es errneo ajustar el brillo de la imagen usando el diafragma de campo o el de apertura?. Cmo debera hacerse?.

LABORATORIO 2 B&G

PASOS A SEGUIR PARA OBTENER LA ILUMINACIN KOEHLER

LABORATORIO 2 B&G

LABORATORIO 2 B&G

PARTE B: CALIBRACIN DE LA MAGNIFICACIN MTODO DE CALIBRACIN

Una vez familiarizado con la estructura y funcionamiento del microscopio compuesto, hay que considerar aquellos accesorios que conducen a una excelente prctica microscpica y que facilitan el trabajo, hacindolo ms rpido y efectivo o ampliando las capacidades del instrumento. Dentro de las posibilidades se puede medir y cuantificar. Consiste en la micrometra (morfometra) aproximada de los especmenes observados al microscopio. Para cuantificar longitudes, cantidades (nmero de clulas, ncleos, partculas), se emplean oculares de medicin con retculos (retculo ocular micromtrico) en combinacin con micrmetros especializados, patrones calibrados, cmaras de conteo y el vernier. Calibracin del Retculo Ocular Micromtrico: necesitamos los accesorios: Retculo ocular con graduacin en mm Micrmetro objeto para calibrar Pasos a seguir para calibrar el retculo ocular: a) Ver a travs del ocular y enfocar la imagen del micrmetro objeto usando la combinacin de lente objetivo 10x. b) Sobreponer el retculo ocular y el micrmetro objeto, haciendo coincidir uno de sus extremos de cada uno. c) La medicin deber ser consistente, desde el extremo en que coinciden ambas retculas hasta otra subdivisin coincidente, Fig. 1.
retculo ocular

Micrmetro objeto

d) La calibracin retculo ocular puede ser determinado dividiendo la longitud conocida del micrmetro objeto (Lp) entre el nmero de divisiones coincidente del retculo ocular (#dO).

LABORATORIO 2 B&G

Este clculo da por resultado el valor real de la longitud de cada subdivisin del retculo ocular (VR):

Ejemplo: Calibracin del Retculo Ocular a la amplificacin de cuatrocientos aumentos (400X). Para una configuracin dada de lentes en un microscopio ptico (ocular de 10X y objetivo de 40X), se determina la longitud por valor de divisin de un ocular micromtrico. Dos (2) subdivisiones de la retcula ocular (#dO = 2 subdivisiones) coinciden con la distancia conocida de 0,3 mm con respecto al micrmetro objeto (LP = 0,3 mm). La longitud por unidad de divisin (VRSub) puede ser calculada como sigue:

Esto significa que cada subdivisin nominal del la Retculo Ocular vale 0,15 mm vista con un lente objetivo de 40X. Nota: Para convertir el valor de milmetros (mm) a micrmetros (m) realizar el siguiente clculo:

Una vez determinado el factor de calibracin podemos medir longitudes en nuestra muestra. Para ello: a) Retirar el micrmetro y enfocar el objeto a medir.

b) Contar el nmero de intervalos del retculo que corresponden al tramo que se desea medir. c) Multiplicar el nmero de intervalos por el valor de calibracin.

El resultado es la longitud absoluta del tramo medido, en mm (micrmetros).

L = nmero de subdivisiones x VRsub

LABORATORIO 2 B&G

PARTE B DEL TRABAJO PRCTICO 4. Calibre la magnificacin del sistema lente objetivo/ocular usando el micrmetro objeto y el retculo ocular correspondiente al microscopio empleado. Determine cuntos micrmetros hay por unidad del retculo a diferentes magnificaciones.
a) Micrmetro objeto (Carl Zeiss cat. No. 474026), positive 5 + 100/100 y; D = 0.17 mm graduacin en +y-: 5 mm en 5 intervalos; graduacin en y-: 1 mm en 100 intervalos = 10 m Precisin 1 m b) Retculo ocular (Carl Zeiss cat. No. 454060), 14:140 / d = 26 mm longitud de la graduacin = 14 mm incrementos = 0.1 mm tolerancia <= 0.001 mm

5. Prepare una muestra de clulas epiteliales de mucosa bucal utilizando un hisopo. Para ello frote suavemente la mucosa bucal con un hisopo y luego transfiera la carga del mismo a un portaobjetos. Coloque un cubreobjetos sobre la zona del preparado y selle con esmalte para uas. 6. Determine el dimetro promedio y la desviacin estndar para las clulas epiteliales de la mucosa bucal y para sus ncleos (n= 10). Calcule la resolucin terica del microscopio. 7. Por qu es necesario calibrar la magnificacin? PARTE C: MICROSCOPA DE FLUORESCENCIA La microscopa de fluorescencia es una herramienta de inestimable valor para la investigacin cientfica, ya que permite alcanzar altos niveles de sensibilidad y resolucin microscpica, permitiendo una apreciacin diferente de la informacin que se puede obtener de los especmenes y que generalmente pasa desapercibida. En la clase terica discutimos: las caractersticas de las sondas fluorescentes, los tipos y su aplicacin; los requerimientos instrumentales como fuente de luz, filtros, lente objetivo; dificultades en la obtencin de las imgenes, as tambin como la naturaleza de la muestra que observaremos. El objetivo del trabajo prctico ser identificar las partes y sus funciones para la microscopa de fluorescencia. En una segunda etapa se observar la localizacin y distribucin de distintas molculas biolgicas componentes de estructuras celulares (actina, tubulina, etc).

LABORATORIO 2 B&G

10

PARTE C: MICROSCOPA DE FLUORESCENCIA Muestra biolgica: componentes del citoequeleto y ncleo, marcados con distintas sondas fluorescentes, de clulas endoteliales de arteria pulmonar bovina Actina: filamentos detectados con faliodina Texas Red-X (rojo) Tubulina: marcado con un anticuerpo primario contra -tubulina y visualizado con un anticuerpo secundario conjugado a BODIPY Fluoresceina (verde) Ncleo: marcado con DAPI (azul)

8. Identificar las partes y familiarizarse con el funcionamiento del microscopio de fluorescencia. 9. Proponga la configuracin de los cubos (filtro de excitacin, espejo dicroico y filtro de emisin) de acuerdo a cada fluorforo presente en la muestra. Compare la misma con los cubos que se utilizar en el TP. 10. Observe la muestra en los diferentes canales, identifique los componentes celulares marcados, su localizacin y distribucin. Adquiera una imagen de cada canal. 11. Discuta los resultados obtenidos.

LABORATORIO 2 B&G

11

LABORATORIO 2 B&G

12

LABORATORIO 2 B&G

13

DAPI

LABORATORIO 2 B&G

14

REFERENCIAS [1] Douglas B. Murphy, Fundamentals of light microscopy and electronic imaging. Eidtorial Wiley-Liss, Inc., 2001. [2] Axioskop 2 Routine Microscope, Operating Instructions. Carl Zeiss Mikroscopie. [3] Medicin, Manual de empleo de Leica Microsystems Ltd. [4] Jos L. Cabrera T., Jos A. Salas, Juan A. Guardado, Jos M. Jurez. Simposio de Metrologa 2008, Santiago de Quertaro, Mxico. [5] ASTM (American Society for Testing and Materials) Standards: E 1951 -02, Standard Guide for Calibrating Reticles and Light Microscope Magnifications. [6] Davison, M., Abramowitz, M. Optical Microscopy. Olympus Microscopy Resource Center. http://www.olympusmicro.com