CONSERVAS LOPEZ Y ASOCIADOS S.A.

LABORATORIO DE CONTROL DE CALIDAD

PROCEDIMIENTO PEE/CONLOSA/LBQF/02 ENSAYO DE HISTAMINA POR FLUROMETRIA

Versin N 1 Fecha de emisin: Enero de 2012

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CONTROL DE CAMBIOS Y MEJORAS. REVISIN N FECHA MODIFICACIONES CAUSA DE MODIFICACIONES

INDICE 1. 2. 3. 3.1 4. 4.1. 5. 5.1 5.2 5.3 5.3.1 5.3.1.1 5.3.1.2 5.3.2 5.3.3. 5.3.4. 5.3.5. 5.4 5.5 5.6 OBJETO ALCANCE REFERENCIAS DOCUMENTOS UTILIZADOS EN LA ELABORACION GENERAL PRINCIPIO DESCRIPCION MATERIALES Y EQUIPO REACTIVOS PREPARACION MUESTRA GENERALIDADES TOMA DE LA MUESTRA PREPARACIN DE EQUIPOS PREPARACIN DE LAS SOLUCIONES PATRONES Y DE TRABAJO PREPARACION DE MUESTRA CONTROL PREPARACION DE LA CURVA REALIZACION REPETIBILIDAD CRITERIOS DE ACEPTACION

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1. OBJETO. Describir la metodologa a seguir para la realizacin del ensayo de histamina por el mtodo de flurometria. 2. ALCANCE. El mtodo es aplicable para productos pesqueros en general. 3. REFERENCIA. 3.1. DOCUMENTOS UTILIZADOS EN LA ELABORACION Norma INEN 184:2009 requisitos de las conservas envasadas de atn. Norma INEN 458 mtodos de ensayos. 3.2. 4. GENERAL. 4.1. Principio. Este mtodo ha sido desarrollado para determinar el nivel de histamina presente en el tejido muscular de tnidos. Un amino cido llamado histidina est presente en todas las especies de atn. Su descomposicin por ciertos tipos de bacterias produce un compuesto orgnico, la histamina. Altos niveles de histamina en atn han sido asociados con descomposicin y desnaturalizacin de un tipo de envenenamiento por escmbridos. Las personas que han comido atn con niveles suficientemente altos de histamina reportan nuseas, contracciones, ampollas orales y sensacin de comezn, fuegos, ronchas con urticaria, diarrea, vmitos y palpitaciones. La muestra es tratada con diferentes reactivos hasta la formacin de un compuesto fluorescente capaz de ser detectado por el Fluormetro. 5. DESCRIPCION. 5.1. MATERIALES Y EQUIPO. Balanza analtica CCE-01 Fluormetro CCE-04 Columna cromatografa CCM-05 Cronometro CCE-05 Licuadora CCE-03 Tubos de ensayo. Matraz Erlenmeyer de 150 ml CCM-06 Vaso de precipitacin de 100 ml CCM-01 DOCUMENTOS A UTILIZAR CONJUNTAMENTE FP/LBQF/02 Formato de resultado de ensayo.

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Pipeta automtica. Papel filtro. Pipeta volumtrica de 10 ml CCM-04 Baln aforado de 50 ml de fondo plano y boca esmerilada CCM-07. 5.2. REACTIVOS. 1. Colocar 30 gr de la resina aninica en un vaso de 600 ml. 2. Aadir hidrxido de sodio 2N en un rango de 15 ml por gramo de resina. (La adicin del NaOH convierte la resina en catinica). En total aadir 450 ml de NaOH 2N. 3. Mezclar bien durante 3 minutos y dejar reposar durante 15 minutos. 4. Decantar el lquido sobrenadante y repetir los pasos 2 y 3. 5. Nuevamente decantar el lquido sobrenandante y lavar con agua destilada 2 o 3 veces para remover los residuos de NaOH 2N. Solucin de OPT al 0.1% CCQ-04, Pesar en la balanza analtica 0.1000 gramos de OPT, transferir a un matraz volumtrico de 100 ml y aadir 50 mililitros de metanol grado reactivo, tapar y agitar, enrasar hasta la seal con metanol grado reactivo hasta 100 mililitros, la solucin de OPT deber guardarse en refrigeracin en un recipiente mbar. cido fosfrico 3,57 N CCQ-05, pesar 122.5 ml de cido fosfrico al 85% usando una probeta y aadirlo a 500 ml de agua destilada en un matraz volumtrico de 1000 ml. Esperar que tome temperatura ambiente y enrasar con agua destilada, mezclar bien. siempre aada acido al agua. Hidrxido de sodio 1N CCQ-06, pesar 4 g de NaOH y aforar en un baln de 100 ml con agua destilada. cido clorhdrico 1N CCQ-07, tomar 8,3 ml de HCl concentrado (97%) y aforar en un baln de 100 ml. cido clorhdrico 0.1 NCCQ-08, Tomar 8.3 ml de HCl concentrado y enrasar a 1 litro. Soluciones de trabajo de 5 mg CCQ-09. Metanol grado analtico 75% CCQ-11, pesar 75 g metanol puro y aforar en un baln de 100 ml. Solucin de NaOH 2N CCQ-19, pesar 8 g de NaOH y aforar en un baln de 100 ml con agua destilada. Agua destilada. Resina de intercambio inico.

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5.3.

PREPARACION 5.3.1.1. Generalidades.

5.3.1. Muestra. Todas las muestras que ingresen al Laboratorio de control de calidad tienen una codificacin que las identifica antes, durante y despus del ensayo, asignada por un inspector de calidad que se dedicara al muestreo. 5.3.1.2. Toma de la muestra Para la toma de muestra se seguir el procedimiento MU/CONLOSA/01. 5.3.2. Preparacin de equipo Encender la balanza analtica electrnica CCE-01. Encender y calibrar el Fluormetro CCE-04. 5.3.3. Preparacin de las soluciones patrones y de trabajo. Preparacin de la solucin stock: Se pesa 0.1691 gr de histamina dihydrochloride en balanza analtica y se diluye a 100 ml con HCl 0.1 N en matraz volumtrico. Almacenar en el refrigerador cuando no se est utilizando hasta un tiempo mximo de un mes. Preparacin de solucin intermedia: Para preparar la solucin intermedia de histamina (10 ug/ml) se pipetea 1 ml (con pipeta volumtrica) de la solucin stock y se diluye a 100 ml con cido clorhdrico 0.1 N. Almacenar en el refrigerador cuando no se lo est usando hasta un tiempo mximo de quince das. Soluciones de trabajo de histamina (estndares): Las soluciones de trabajo C1 (50.000), C2 (25.000), ppm se preparan pipeteando 1 y 0.5 ml respectivamente de la solucin intermedia en 2 matraces (de 100ml, cada uno) y se diluye cada una utilizando cido clorhdrico 0.1 N hasta completar los 100 ml. Almacenar en la refrigeradora cuando no se las use. Debern ser almacenadas, mximo por 1 semana, luego se la volver a preparar. Solucin control: Se pipetea 1 ml de la solucin stock de histamina en matraz volumtrico de 50 ml y se diluye a 100 ml con metanol puro. Almacenar en el refrigerador cuando no se la est utilizando hasta un mximo de quince das. Preparacin del Blanco Colocar en un tubo de ensayo, 15 ml de solucin de cido clorhdrico 0.1 N y agitar. Colocar 3 ml de hidrxido de sodio 1N y mezclar. Colocar 1 ml de solucin de OPT al 0.1%, colocar el cronmetro en 4 minutos y mezclar.

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Luego de exactamente 4 minutos aadir 3 ml de cido fosfrico 3.57N mezclar y dejar reposar por 15 minutos para lectura final. 5.3.4. PREPARACION DE MUESTRA CONTROL Extraer con una pipeta volumtrica, 1 ml de la solucin control y colocarla en la columna cromatografca de preferencia cuando se haya utilizado varias veces la columna, sin exceder las 12 pasadas. Colocar tubo plstico de fondo cnico de 50 ml debajo de la columna, conteniendo 5 ml de cido clorhdrico 1N. Aadir de agua destilada y abrir la llave de la columna para permitir que se filtre el destilado. Cuidar que no se seque la resina. Enrasar a 50 ml la extraccin. Mezclar. Tomar de la extraccin, una alcuota de 5 ml y transfiralo a un tubo de ensayo. Adicione 10 ml de cido clorhdrico 0.1N y agite. Adicione 3 ml de hidrxido de sodio 1N y agite. Adicione 1 ml de OPT al 0.1% y agite. Ajuste el controlador de tiempo en 4 minutos. Luego de exactamente 4 minutos adicionar 3 ml de cido fosfrico 3,57N y agitar. Dejar reposar por 15 minutos Colocar en un tubo de boro silicato, proceder a leer la muestra en el Fluormetro. 5.3.5. PREPARACION DE LA CURVA (Soluciones de calibracin) Pipetear por duplicado alcuota de 5 ml de las soluciones de trabajo (C1 Y C2) con diferentes pipetas volumtricas de 5 ml (1 para cada solucin de trabajo) y ponerlas en tubos de ensayo. Colocar 10 ml de cido clorhdrico 0.1 N y agitar. Pipetear 3 ml de hidrxido de sodio 1N y mezclar. Aadir 1 ml de solucin de OPT 0.1% y colocar el cronmetro en 4 minutos y mezclar. Luego de exactamente cuatro minutos aadir 3 ml de cido fosfrico 3.57N y mezclar. Dejar reposar por 15 minutos Colocar en los tubos de boro silicato y preparar la soluciones blanco y control antes de determinar la curva de calibracin cuyo resultado de coeficiente de calibracin 1.00 (+/-0.01), el blanco menor que 1 y la de control aproximadamente 5.00 (+/- 0.2). A continuacin leer los C1 Y C2 y registrar los resultados en el formato FP/LBQF/02. Esta calibracin se la realizara de forma diaria.

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5.4.

REALIZACION.

Pesar en la balanza, 10 g (+/- 0.01) gramos de la muestra. Licuar junto con 45 ml de metanol al 75%, luego de esto filtrar la muestra, Tomar un ml del filtrado y poner en la columna cromatografca. Colocar debajo de la columna un baln aforado de clorhdrico 1N. Completar a 50 ml utilizando agua destilada, cuidando permanentemente que no se seque la resina. Tomar de la extraccin, una alcuota de 5 ml y transfiralo a un matraz erlenmeyer. Adicione 10 ml de cido clorhdrico 0.1N y agite. Adicione 3 ml de hidrxido de sodio 1N y 1 ml de OPT al 0.1% y agite. Ajuste el cronometro en 4 minutos. Luego de exactamente 4 minutos adicionar 3 ml de cido fosfrico 3,57N agitar y dejar reposar por 4 minutos. Colocar en un tubo de Boro silicato. Preparar un blanco con todos los reactivos, sin la muestra. Proceder a leer en el Fluormetro. 5.5. 5.6. REPETIBILIDAD CRITERIOS DE ACEPTACION. Cada da de trabajo se realizar el anlisis de una muestra por duplicado. Se aceptara como limite mximo 5 mg/100g tanto en materia prima como en producto terminado. 50 ml, conteniendo 5 ml de cido

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