Вы находитесь на странице: 1из 141

UNIVERSIDADE FEDERAL DO PAR INSTITUTO DE CINCIAS DA SADE PROGRAMA DE PS-GRADUAO EM CINCIAS FARMACUTICAS

Estudos de Pr-Formulao e Formulao de Heliotropium indicum (L.) DC (Boraginaceae).

Russany Silva Da Costa

Belm PA 2010

UNIVERSIDADE FEDERAL DO PAR INSTITUTO DE CINCIAS DA SADE PROGRAMA DE PS-GRADUAO EM CINCIAS FARMACUTICAS

Estudos de Pr-Formulao e Formulao de Heliotropium indicum (L.) DC (Boraginaceae).

Autor: Russany Silva da Costa


Orientador: Prof. Dr. Jos Otvio Carrra Silva Jnior.

Dissertao apresentada ao Programa de Ps-Graduao em Cincias Farmacuticas, rea de concentrao: Frmacos e Medicamentos, do Instituto de Cincias da Sade, da Universidade Federal do Par, como requisito para obteno do ttulo de mestre em Cincias Farmacuticas. rea de Concentrao: Frmacos e Medicamentos

Belm PA 2010

AUTORIZO A REPRODUO E DIVULGAO TOTAL OU PARCIAL DESTE TRABALHO, POR QUALQUER MEIO CONVENCIONAL OU ELETRNICO, PARA FINS DE ESTUDO E PESQUISA, DESDE QUE CITADA A FONTE.

Dados Internacionais de Catalogao na Publicao (CIP) Biblioteca Central da UFPA

Costa, Russany Silva da, 1985-

Estudos de pr-formulao e formulao de Heliotropium indicum (L.) DC (Boraginaceae) / Russany Silva da Costa ; orientador, Jos Otvio Correa Silva Jnior. 2010.

Dedicatria

Dissertao (Mestrado) - Universidade Federal do Par, Instituto de Cincias da Sade, Programa de Ps-Graduao em Cincias Farmacuticas, Belm, 2010.

1. Matria mdica vegetal Controle de qualidade. 2. Tecnologia farmacutica. I. Ttulo.

Dedicatria

minha famlia meus pais, meus avs e irmo pelo Apoio incondicional nos momentos que mais precisei.

minha me, Rosngela Costa, o melhor exemplo de dignidade, solidariedade, seriedade e fora, com sua experincia e sabedoria, cujos passos jamais hesitarei em seguir. Meu apoio e incentivo durante a elaborao deste trabalho. Obrigada por sempre acreditar em mim.

AGRADECIMENTOS minha me, Rosngela Costa, por est sempre disponvel nos momentos que precisei. Universidade Federal do Par, pela oportunidade oferecida para realizao deste trabalho. Ao orientador Prof. Dr. Jos Otvio Carrra Silva Jnior, meu agradecimento pela oportunidade em realizar esta pesquisa, amizade, orientao e confiana durante a realizao deste trabalho. Ao Prof. Dr. Jos Maria dos Santos Vieira, pelo incentivo e apoio quando mais precisei e pelos esclarecimentos nos ensaios da atividade antimicrobiana. Ao Prof. Dr. Wagner Luiz Ramos Barbosa, pela orientao tcnica e cientfica e oportunidade de realizao dos processos de extrao e cromatografia em seu Laboratrio de Fitoqumica. Ao Prof. Dr. Carlos Emmerson F. da Costa, pela orientao tcnica-cientfica na etapa das anlises termogravimtricas. Ao Prof. Dr. Flvio Vasconcelos, pela orientao sobre atividade txica da espcie estudada. Aos colegas de ps-graduao: Auriekson, Luana, Nbia, Hugo, Michelli, Jaqueline, Patricia, Christian, Sarah e Raimundo pela amizade, companheirismos e agradvel convivncia, to importante no perodo de durao do curso. Aos tcnicos dos laboratrios da Faculdade de Farmcia: Jalton, Joo e Lenita, pela ajuda oferecida sempre que solicitados.

farmacutica Carla Lcia pela valiosa contribuio nos ensaios da atividade antimicrobiana. Ao mestre em Cincias Farmacuticas, Mauro Srgio Alves, pelo apoio e ateno dedicados sempre que solicitei. amiga e doutoranda Kariane Nunes, pela ajuda oferecida em Ribeiro Preto. Ao qumico Jos Luiz Cardoso, pela valiosa contribuio no processo de liofilizao do extrato vegetal. Ao estagirio Charles Alberto do Laboratrio de Catlise e Oleoqumica do Instituto de Cincias Exatas e Naturais, Faculdade de Qumica, pela valiosa contribuio na anlise trmica. Prof. Dra. Roseanne Ribeiro pela oportunidade de utilizar o Laboratrio de Controle de Qualidade Fsico-Qumico. Aos meus amigos da UFPA (no citarei nomes pelo receio de cometer injustia) pela amizade e torcida. Coordenao de Aperfeioamento de Pessoal de Nvel Superior CAPES, pelo auxlio financeiro oferecido na forma de bolsa concedida para realizao do trabalho. Enfim, a todos as pessoas que contriburam direta ou indiretamente para realizao deste trabalho. todos vocs de forma muito especial e particular, Meu muito obrigada!

Resumo vi

RESUMO ESTUDOS DE PR-FORMULAO E FORMULAO DE Heliotropium indicum (L.) DC -BORAGINACEAE Heliotropium indicum L. (Boraginaceae) um subarbusto que atinge at 70 cm de altura, amplamente distribudo geograficamente. A espcie conhecida como fedegoso na regio norte e nordeste. Diante do potencial biolgico desta espcie este trabalho objetiva determinar parmetros de qualidade da droga vegetal at o produto final e avaliar a atividade antimicrobiana de suas folhas, com finalidade de se obter uma formulao fitoterpica semi-slida. Para isso utilizou-se parmetros de controle de qualidade fsico, qumico e fsico-qumico descritos na Farmacopia Brasileira e literatura pertinente. A droga vegetal foi classificada como p grosso, apresentou valores mdios de perda por dessecao e cinzas totais de 12,88% e 17,14%, respectivamente. A anlise termogravimtrica do p e do extrato liofilizado mostrou que ambos apresentaram boa estabilidade trmica at 180 C. Os espectros na regio do IV mostraram um aumento na intensidade das bandas de absoro do extrato liofilizado, que pode est relacionado extrao dos constituintes qumicos da matriz celular. A prospeco qumica do extrato confirmou a presena de classes de metablitos secundrios j relatados em literatura. A frao clorofrmica sugere a presena de alcalides pelo teste de precipitao com reagente de Dragendorff. A CCD e a CLAE mostraram uma possvel presena de uma mesma substncia nas fraes alcalodicas e hexnicas. O extrato bruto de H. indicum L. inibiu o crescimento de Staphylococcus aureus apresentando halos de 12,5 mm0,707 e 10,5 mm0,707 para as concentraes de 500 mg/mL e 250 mg/mL, respectivamente. As misturas fsicas do extrato com os adjuvantes farmacuticos, utilizados no desenvolvimento da formulao fitoterpica, no apresentaram incompatibilidade fsica e no houve modificaes significativas no perfil de absoro entre os compostos analisados. A formulao fitoterpica semi-slida manteve-se estvel aps sua preparao, aps a submisso do gel a fora centrpeta e aps ao do estresse trmico.

Palavras Chaves: Heliotropium indicum L. Controle de qualidade. Gel. Atividade antimicrobiana.

Abstract vii

ABSTRACT PRE-FORMULATION AND FORMULATION STUDIES OF Heliotropium indicum (L.) DC -BORAGINACEAE

Heliotropium indicum L. (Boraginaceae) is a shrub, reaches up to 70 cm high. It is known as fedegoso in the north and northeast of Brazil. Because of the biological potential of this species, this work aims to determine the quality parameters of the vegetable drug to the final product and evaluate the antimicrobial activity of the leaves of H. indicum L. The purpose of obtaining a phytotherapic formulation semisolid, we used the parameters of quality control physical, chemical and physicalchemical described in the Brazilian Pharmacopoeia and others literature. The vegetable drug was classified as coarse powder, showed values of loss on drying and total ash of 12.88% and 17.14%, respectively. The thermogravimetric analysis of the powder and the extract showed that both had good physical stability up to 180 The spectra in the region IR showed an increase in the intensity of the absorption C. bands of the extract, which may relates to the extraction of chemical constituents of the cellular matrix. The prospecting chemical extract confirmed the presence of classes of secondary metabolites already reported in literature. The chloroform fraction suggests the presence of alkaloids by precipitation test with Dragendorff reagent. The TLC and HPLC showed a possible presence of the same substance in the alkaloidal and hexane fractions. The crude extract inhibited the growth of Staphylococcus aureus with halos of 12.5 mm 0.707 and 10.5 0.707 mm for concentrations of 500 and 250 mg / mL, respectively. The physical mixtures of the extract with adjuvant pharmaceutical used to develop the phytotherapic formulation showed no physical incompatibility and no significant changes in the absorption profile of the compounds analyzed. The phytotherapic formulation semi-solid has a good stability after the preparation, after the submission of the gel by centripetal force and after the action of heat stress.

Keyword: Heliotropium indicum L, Quality Control, Gel, Antimicrobial activity.

Lista de Figuras viii

LISTA DE FIGURAS

Figura 1.

Fotografia da espcie Heliotropium indicum (L.) DC (Boraginaceae) mostrando aspectos gerais (A) e detalhe da folha e inflorescncia (B) Alcalides isolados da espcie H. indicum L. (A) heliotrina; (B) europina; (C) licopsamina; (D) heliosurpina; (E) helindicina; (F) indicina. Exsicata da espcie H. indicum L. (Boraginaceae) MG 145574. Esquema da partio lquido-lquido cido e bsico para obteno da frao hexnica (FH) e da frao alcalodica (FA). Determinao da distribuio granulomtrica do p das folhas de H. indicum L. Curva TG e DrTG do p das folhas de H. indicum L. obtida a 5C/min, sob atmosfera: N2, fluxo: 25,00 mL/min. Curva DSC do p das folhas de H. indicum L. obtida a 5C/min, sob atmosfera: N2, fluxo: 25,00 mL/min. Espectro na regio do IV do p das folhas de H. indicum L. Cromatograma da FA visualizado no UV a 254 nm ( esquerda) e revelado com Dragendorff e HCl 5% ( direita) obtido pelo sistema eluente CHCl3CH3OH (90:10), em atmosfera de NH4OH. Cromatograma da FH visualizado no UV a 254 nm ( esquerda) revelado com Dragendorff e HCl 5% ( direita) obtido pelo sistema eluente CHCl3CH3OH (90:10), em atmosfera de NH4OH. Perfil cromatogrfico por CLAE-UV/DAD a 250 nm do extrato bruto de H. indicum L. Cromatogramas: A- extrato bruto (1,60 min); Bfrao alcalodica (1,73 min), C- frao hexnica (1,73 min). Espectros no UV em 250 nm idntico ao pico com Rt=1,60 min (extrato) e Rt=1,73 min (frao alcalodica). Curvas TG e DrTG do extrato liofilizado de H. indicum L. obtida a 5C/min, sob atmosfera: N2, fluxo: 25,00 mL/min. Curva DSC do extrato liofilizado de H. indicum L. obtida a 5 C/min, sob atmosfera: N2, fluxo: 25,00 mL/min. Espectro na regio do IV do extrato liofilizado de H. indicum L. Espectros na regio do infravermelho da droga vegetal e do extrato liofilizado de H. indicum L.

26

Figura 2.

29

Figura 3. Figura 4. Figura 5. Figura 6. Figura 7. Figura 8. Figura 9.

54 65 75 76 77 78 81

Figura 10.

81

Figura 11.

82

Figura12. Figura 13. Figura 14. Figura 15. Figura 16.

83 84 85 86 87

Lista de Figuras ix

Figura 17.

Placa mostrando os halos de inibio do crescimento da cepa de S. aureus com discos contendo diferentes concentraes do EB de H. indicum L dissolvido em DMSO. Curvas TG correspondente ao extrato liofilizado de H. indicum L., mistura binria (extrato/HEC -1:1 p/p) e HEC. Curvas DTA correspondente ao extrato liofilizado de H. indicum L., a mistura binria (extrato/HEC 1:1 p/p) e a HEC Curvas DSC correspondente ao extrato liofilizado de H. indicum L., a mistura binria (extrato/HEC 1:1 p/p) e a HEC. Curvas TG correspondente ao extrato liofilizado, a mistura binria (extrato/metilparabeno 1:1 p/p) e metilparabeno. Curvas DTA correspondente ao extrato liofilizado, a mistura binria (extrato/metilparabeno 1:1 p/p) e metilparabeno. Curvas DSC correspondente ao extrato liofilizado, a mistura binria (extrato/metilparabeno 1:1 p/p) e metilparabeno. Curvas TG correspondente ao extrato liofilizado, a mistura binria (extrato/propilenoglicol 1:2 p/p) e ao propilenoglicol. Curvas DTA correspondente ao extrato liofilizado, a mistura binria (extrato/propilenoglicol 1:2 p/p) e propilenoglicol. Curvas DSC correspondente ao extrato liofilizado, a mistura binria (extrato/propilenoglicol 1:2 p/p) e propilenoglicol. Espectros na regio do IV do extrato liofilizado de H. indicum L., da mistura binria (extrato/HEC 1:1 p/p) e da HEC, analisados na faixa de absoro de 4000-500 cm-1. Espectros na regio do IV do extrato liofilizado de H. indicum L., da mistura binria (extrato/metilparabeno 1:1 p/p) e do metilparabeno, analisados na faixa de absoro de 4000-500 cm-1. Espectros na regio do IV do extrato liofilizado de H. indicum L., da mistura binria (extrato/propilenoglicol 1:2 p/p) e do propilenoglicol, analisados na faixa de absoro de 4000-500 cm-1. Valores de pH obtidos pelo teste do estresse trmico das amostras do gel de H. indicum L. submetido a estufa (45 2 e das C C) amostras do gel de H. indicum L. submetido a temperatura ambiente (25 2 n= 3. C C), Caractersticas da viscosidade da formulao contendo tintura de H. indicum L. Perfil reolgico da formulao contendo tintura de H. indicum L.

88

Figura 18. Figura 19. Figura 20. Figura 21. Figura 22. Figura 23. Figura 24. Figura 25. Figura 26. Figura 27.

89 90 91 92 93 93 95 96 96 98

Figura 28.

98

Figura 29.

99

Figura 30.

100

Figura 31. Figura 32.

101 101

Lista de Tabelas x

LISTA DE TABELAS Tabela 1. Tabela 2. Tabela 3. Tabela 4. Tabela 5. Tabela 6. Tabela 7. Tabela 8. Tabela 9. Determinao da perda por dessecao e teor de cinzas totais do p das folhas de H. indicum L. Perfil trmico (TG) do p das folhas de H. indicum L. com suas respectivas perdas de massa, em cada intervalo de temperatura ( C). Valores das entalpias apresentadas pelo p das folhas de H. indicum L. em diferentes temperaturas, analisadas por DSC. Determinao do pH, densidade aparente e resduo seco da tintura de H. indicum L. Prospeco qumica do extrato bruto de H. indicum L. Perfil trmico (TG) do extrato liofilizado de H. indicum L. com suas respectivas perdas de massa, em cada intervalo de temperatura ( C). Valores das entalpias apresentadas pelo extrato liofilizado de H. indicum L. em diferentes temperaturas, analisadas por DSC. Faixa de absoro das ligaes das molculas no extrato de H. indicum L. Valores mdios dos halos de inibio (mm) obtidos pelo mtodo de difuso em disco utilizado na anlise do extrato bruto de H. indicum L. em diferentes concentraes. Resultados termogravimtricos (TG) correspondente a perda de massa ( m) do extrato liofilizado de H. indicum L, da HEC e da mistura binria do extrato liofilizado e HEC (1:1 p/p). Resultados termogravimtricos (DTA e DSC) correspondente a variao de energia ( H) do extrato liofilizado de H. indicum L., da HEC e da mistura binria do extrato liofilizado e HEC (1:1 p/p). Resultados termogravimtricos (TG) correspondente a perda de massa ( m) do extrato liofilizado de H. indicum L., do metilparabeno e da mistura binria do extrato liofilizado e metilparabeno (1:1 p/p). Resultados termogravimtricos (DTA e DSC) correspondente a variao de energia ( H) do extrato liofilizado de H. indicum L., do metilparabeno e da mistura binria do extrato liofilizado e metilparabeno (1:1 p/p). Resultados termogravimtricos (TG) correspondente a perda de massa ( m) do extrato liofilizado de H. indicum L., do propilenoglicol e da mistura binria do extrato liofilizado e propilenoglicol (1:2 p/p). Resultados termogravimtricos (TG) correspondente a perda de massa ( m) do extrato liofilizado de H. indicum L., do propilenoglicol e da mistura binria do extrato liofilizado e propilenoglicol (1:2 p/p). 76 77 78 79 80 84 85 86 88

Tabela 10.

90

Tabela 11.

91

Tabela 12.

92

Tabela 13.

94

Tabela 14.

95

Tabela 15.

97

Lista de Quadros xi

LISTA DE QUADROS
Quadro 1. Componentes da formulao fitoterpica semi-slida e suas respectivas concentraes. 70

Lista de Abreviaturas xii

LISTA DE ABREVIATURAS

ABIFITO ATCC CCD CIM CG GC-MS GC-FID CLAE CLAE-DAD DMSO DSC DTA EB FA FH FTIR IBGE IV OMS/ WHO PNPIC PNPMF RDC Rf Rt RMN SUS TG TGA UFC UV

Associao Brasileira da Indstria de Fitoterpicos American Type Culture Colection Cromatografia em Camada Delgada Concentrao inibitria mnima Cromatografia gasosa Gas chromatography-mass spectrometry/Cromatografia gasosa acoplado a espectrmetro de massa Gas chromatography-flame ionization detector/Cromatografia gasosa acoplado a detectores de ionizao de chama Cromatografia Lquida de Alta Eficincia Cromatografia Lquida de Alta Eficincia com Arranjo de Diodo Dimetilsufxido Differential scanning calorimetry/Calorimetria exploratria diferencial Differential thermal analysis/Anlise trmica diferencial Extrato Bruto Frao Alcalodica Frao Hexnica Fourier transform infrared spectroscopy/Espectroscopia na regio do infravermelho com transformada de Fourier Instituto Brasileiro de Geogrfia e Estatsticas Infravermelho Organizao Mundial da Sade World Health Organization Poltica Nacional de Prticas Integrativas e Complementares Poltica Nacional de Plantas Medicinais e Fitoterpicos Resoluo da Diretoria Colegiada Retention factor/Fator de reteno Retention time/Tempo de reteno Ressonncia Magntica Nuclear Sistema nico de Sade Termogravimetria Anlise termogravimtrica Unidade Formadora de Colnia Ultravioleta

Sumrio xiii

SUMRIO

1 2 2.1 2.2 2.3 2.3.1 2.3.2 2.3.3 2.3.4 2.3.5 2.3.6 2.4 2.5 2.6 2.7 2.7.1 2.7.2 2.7.2.1 2.7.2.2 2.7.2.3 2.8 2.8.1 2.9 2.9.1 2.9.2 2.10 2.10.1 2.10.2 3 3.1 3.2 4 4.1 4.1.1 4.1.2 4.1.3 4.1.4 4.2 4.2.1 4.2.2 4.2.3 4.2.3.1 4.2.3.2 4.2.3.3 4.2.3.4 4.2.3.5

INTRODUO REVISO DE LITERATURA Plantas medicinais O gnero Heliotropium Heliotropium indicum L. Descrio botnica Dados taxonmicos Distribuio geogrfica Dados etnofarmacolgico Constituintes qumicos e atividade farmacolgica Toxicidade da espcie H. indicum L. Tinturas Extrato liofilizado Estudos de pr-formulao Tcnicas analticas utilizadas no desenvolvimento, avaliao e controle de qualidade de fitoterpicos Espectroscopia na regio do infravermelho Anlise trmica Termogravimetria (TG) Anlise trmica diferencial (DTA) Calorimetria exploratria diferencial (DSC) Estrutura e funes da pele Vias de permeao percutnea pelo estrato crneo Formulaes para uso tpico Gel Hidroxietilcelulose (Natrosol) Estudo de estabilidade das formulaes Avaliao preliminar da estabilidade Teste de estabilidade acelerada OBJETIVOS Objetivo Geral Objetivos Especficos MATERIAL E MTODOS Material Matria-prima vegetal Reagentes, solues e substncias utilizadas Equipamentos Cepas de micro-organismos utilizados Mtodos Obteno e identificao botnica do material vegetal Processamento do material vegetal Caracterizao fsica e fsico-qumica das folhas de H. indicum L. Determinao da distribuio granulomtrica do p. Determinao de perda por dessecao do p. Determinao do teor de cinzas totais do p. Obteno do perfil trmico por termogravimetria (TG, DSC) do p. Obteno do perfil espectroscpico na regio do IV do p.

16 19 20 23 24 24 26 27 27 28 32 33 35 35 36 36 38 39 40 40 41 42 44 44 46 46 47 47 49 50 50 51 52 52 52 52 53 53 53 54 55 55 56 56 56 57

Sumrio xiv

SUMRIO
4.2.4 4.2.4.1 4.2.4.2 4.2.4.3 4.2.4.4 4.2.5 4.2.5.1 4.2.5.2 4.2.5.3 4.2.5.4 4.2.5.5 4.2.6 4.2.6.1 4.2.6.2 4.2.7 4.2.7.1 4.2.7.2 4.2.8 4.2.8.1 4.2.8.2 Obteno e caracterizao qumica e fsico-qumica da soluo extrativa de H. indicum L. Obteno da tintura a partir das folhas de H. indicum L. Determinao do pH da tintura. Determinao da densidade aparente da tintura. Determinao do resduo seco da tintura. Abordagem fitoqumica da tintura. Obteno do extrato bruto a partir da tintura. Prospeco qumica do extrato bruto. Obteno da frao alcalodica (FA). Determinao do perfil cromatogrfico da frao alcalodica (FA) e da frao hexnica (FH) por cromatografia em camada delgada (CCD). Determinao do perfil cromatogrfico por CLAE Obteno do extrato liofilizado a partir da tintura Obteno do perfil trmico por termogravimetria (TG, DTA e DSC) do extrato liofilizado. Obteno do perfil espectroscpico na regio do IV do extrato liofilizado. Ensaio biolgico do extrato hidroalcolico de H. indicum L. Micro-organismos testados Avaliao da atividade antimicrobiana do extrato bruto. Estudos da formulao contendo a tintura padronizada de H. indicum L. Obteno da formulao Caracterizao fsico-qumica da mistura fsica do extrato liofilizado x adjuvantes farmacuticos empregados na formulao por Termogravimetria (TG), Anlise Trmica Diferencial (DTA), Calorimetria Exploratria Diferencial (DSC) e espectrometria na regio do infravermelho (IV) Preparo das amostras Termogravimetria (TG e DTA) dos excipientes da formulao e de suas misturas binrias com o extrato liofilizado. Anlise da calorimetria exploratria diferencial (DSC) Anlise espectrofotomtrica na regio do infravermelho dos excipientes da formulao e de suas misturas binrias com o extrato liofilizado. Avaliao preliminar da estabilidade da formulao Teste de centrifugao Teste do estresse trmico Determinao do valor do pH Avaliao do perfil reolgico da formulao RESULTADOS Estudos de pr-formulao Avaliao das caractersticas fsicas e fsico-qumicas da droga vegetal Determinao da distribuio granulomtrica do p. Determinao da perda por dessecao e do teor de cinzas totais do p de H. indicum L. Anlise do perfil trmico por TG do p. Anlise DSC do p. Perfil espectroscpico na regio do IV do p. 57 57 57 58 58 58 58 59 64 65 66 66 66 67 67 67 68 69 69 70

4.2.8.2.1 4.2.8.2.2 4.2.8.2.3 4.2.8.2.4 4.2.9 4.2.9.1 4.2.9.2 4.2.9.3 4.2.9.4 5 5.1 5.1.1 5.1.1.1 5.1.1.2 5.1.1.3 5.1.1.4 5.1.1.5

70 71 71 72 72 72 72 73 73 74 75 75 75 76 76 77 78

Sumrio xv

SUMRIO
5.1.2 5.1.2.1 5.1.3 5.1.3.1 5.1.3.2 5.1.3.3 5.1.4 5.1.4.1 5.1.4.2 5.1.4.3 5.2 5.3 5.3.1 Caracterizao fsico-qumica da tintura de H. indicum L. Determinao do pH, densidade aparente e resduo seco da tintura. Abordagem Fitoqumica da tintura. Prospeco qumica do extrato bruto. Determinao do perfil cromatogrfico da frao alcalodica (FA) e da frao hexnica (FH) obtido por cromatografia em camada delgada (CCD). Determinao do perfil do extrato bruto, da frao alcalodica e da frao hexnica de H. indicum L. por CLAE Caracterizao fsico-qumica do extrato liofilizado de H. indicum L. Anlise do perfil trmico por TG do extrato liofilizado Anlise DSC do extrato liofilizado. Perfil espectroscpico na regio do infravermelho do extrato liofilizado. Avaliao preliminar da atividade antimicrobiana do extrato bruto de H. indicum L. Estudo da formulao Determinao dos ensaios preliminares do extrato liofilizado de H. indicum L. com suas misturas binrias por termogravimetria (TG), anlise trmica diferencial (DTA) e calorimetria exploratria diferencial (DSC). Anlise espectrofotomtrica na regio do infravermelho do extrato liofilizado de H. indicum L. e suas misturas binrias. Formulao fitoterpica contendo tintura padronizada de H. indicum L. Avaliao da formulao semi-slida contendo a tintura de H. indicum L. Teste de Centrifugao Teste de estresse trmico Determinao do pH da formulao Avaliao do comportamento reolgico da formulao DISCUSSO CONCLUSO REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS 79 79 79 79 81 82 83 83 85 86 87 89 89

5.3.2 5.3.3 5.3.3.1 5.3.3.2 5.3.3.3 5.3.3.4 5.3.3.5 6 7 8

97 99 99 99 100 100 101 102 121 124

16

1. INTRODUO

Introduo 17

1.

Introduo

As plantas so consideradas uma valiosa fonte de substncias biologicamente ativas, que tm sido exploradas pelo homem desde os primrdios da humanidade. O maior nmero de espcies vegetais encontra-se nas regies equatoriais da Amrica do Sul, frica e sia. No Brasil encontra-se a maior diversidade vegetal, estimando-se em 20% as espcies vegetais e animais existentes (GUERRA, 2003). Devido riqueza da biodiversidade da flora brasileira, a ateno do mundo est voltada para a floresta amaznica, mata atlntica e cerrado (CARLOS, 2007). A floresta amaznica ocupa territrios do Brasil, Bolvia, Peru, Equador, Colmbia, Venezuela, Guiana, Suriname e Guiana Francesa, com uma rea de aproximadamente 6.000.000 km2 da Amrica do Sul, sendo constituda por diferentes tipos de vegetao. Cerca de 65% dessa regio coberta por um tipo florestal denominado floresta de terra firme, caracterizada principalmente pela elevada riqueza e diversidade de espcies (OLIVEIRA e AMARAL, 2004). A floresta amaznica um ecossistema que apresenta uma diversidade florstica muito elevada, maior que os demais ecossistemas florestais do mundo (LEITO FILHO, 1987). A descrio da utilizao de plantas brasileiras para fins medicinais relatada desde a poca da colonizao por exploradores europeus, atravs da observao do uso dos vegetais pelos ndios, conforme descrio de Gabriel Soares de Sousa, em sua obra denominada Tratado Descritivo do Brasil em 1587 (BRANDO, 2003). Atualmente, a utilizao de plantas medicinais e produtos fitoterpicos esto em expanso no Brasil e no mundo, o que tem impulsionado as indstrias farmacuticas e tambm o governo federal a investir em pesquisa, na forma de incentivos atravs das polticas pblicas para uso racional destes produtos, pois a oportunidade para produtos com possvel utilizao econmica aumenta com a diversidade das espcies (CARLOS, 2007). Com isso, h a necessidade cada vez maior de estabelecer parmetros de qualidade destes produtos, o que implica em um controle de qualidade desde a matria-prima vegetal, do produto intermedirio at a obteno do produto final.

Introduo 18

Nesse contexto, este trabalho pretende contribuir para estimular linhas de pesquisas em fitoterapia e ainda promover desenvolvimento tecnolgico, com base no uso tradicional de plantas medicinais da regio amaznica, priorizando as necessidades epidemiolgicas da populao. A espcie em estudo Heliotropium indicum L. apresenta aspectos econmicos, acadmicos e farmacolgicos que justificam sua escolha para investigao, pois uma planta de ocorrncia na regio amaznica muito utilizada na forma de cataplasma para tratamento de leses drmicas (AMOROZO e GELLY, 1988; DI STASI, 1996) e possuidora de atividade antimicrobiana (REINA et al, 1995; SINGH et al, 2002). Entretanto, diversos estudos fitoqumicos tm demonstrado que a espcie H. indicum L. apresenta alcalides pirrolizidnicos em todo o vegetal (PANDEY et al, 1982; SINGH et al, 2005) e estes possuem uma atividade hepatotxica (CHEEKE, 1988). Tendo em vista a conhecida atividade hepatotxica da espcie, este trabalho prope desenvolver uma formulao fitoterpica semi-slida para uso tpico contendo a tintura de H. indicum L. Assim, os alcalides pirrolizidnicos, responsveis pela atividade txica, no sofrero metabolismo de primeira passagem, no sendo, portanto, absorvido pelo fgado. Contudo, sabe-se que para se obter um produto com qualidade, segurana e eficcia preciso padronizar as etapas do desenvolvimento tecnolgico desde a coleta do material vegetal at a avaliao do produto final obtido, a fim de garantir uma eficcia e segurana ao usurio do fitomedicamento. Por isso, este trabalho prope a identificao e caracterizao dos marcadores qumicos presentes na tintura obtida das folhas de H. indicum L. e estudos de pr-formulao e formulao para a obteno do gel fitoterpico seguindo critrios para obteno de um produto final eficaz e seguro.

19

2. REVISO DE LITERATURA

Reviso de Literatura 20

2 Reviso de Literatura

2.1 Plantas medicinais

A magnitude da biodiversidade brasileira no conhecida com preciso tal a sua complexidade, calcula-se a existncia de mais de 2,0 milhes de espcies distintas de plantas, animais e micro-organismos. O Brasil o pas com a maior diversidade gentica vegetal do mundo. Cerca de dois teros das espcies se encontram nos trpicos, estimando que o Brasil detenha cerca de 75% de todas as espcies florestais nas suas duas principais formaes: a Floresta Tropical Atlntica e a Floresta Amaznica (DIAS, 1996). Das espcies catalogadas estas podem ser medicinais, aromticas ou apresentar outras utilidades. Entretanto essa biodiversidade encontra-se seriamente ameaada pelo ritmo atual de extino de plantas que j entre 50 e 100 vezes maior que as taxas mdias observadas no passado (GUERRA et al, 2003). As principais causas de perda da diversidade gentica tm sido associadas destruio e fragmentao dos ecossistemas e aos estresses ambientais como poluio e as mudanas climticas globais (BAUR e SCHMID, 1996). As plantas medicinais tm sido base dos principais produtos indicados para tratamento de diversas molstias desde a Antigidade. Praticamente todos os povos ou etnias do mundo usam plantas medicinais ou seus derivados de forma direta ou indireta para o tratamento de males que acometem o homem e/ou para atingir o estado de completo bem-estar fsico, mental e social (KOROLKOVAS, 1996). Por isso, o reconhecimento do valor delas como recurso clnico, farmacutico e econmico cresce progressivamente em vrios pases. Por conta disso, essas naes vm normatizando e legislando acerca dos diferentes critrios de segurana, eficcia e qualidade que devem envolver esses produtos (REIS et al, 2004; BRASIL, 2009). A utilizao de plantas medicinais tornou-se um recurso teraputico de grande aceitao pela populao e vem crescendo junto comunidade mdica, desde que sejam utilizadas plantas cuja atividade biolgica tenha sido investigada cientificamente, comprovando sua eficcia e segurana (YUNES et al, 2001). E o uso de plantas medicinais pela populao mundial tem sido bastante significativo, de

Reviso de Literatura 21

acordo com dados da Organizao Mundial de Sade (OMS) mais da metade dos habitantes do planeta, especialmente aqueles de pases pobres em desenvolvimento, fazem uso de algum tipo de erva na busca de alvio de sintomatologia dolorosa ou desagradvel. Desse total pelo menos 30% ocorre por indicao mdica (ESTRELA, 1995). H informaes de que os produtos naturais e as preparaes fitoterpicas so responsveis por 25% do receiturio mdico nos pases desenvolvidos e cerca de 80% nos pases em desenvolvimento, dados revelados pela OMS. Tal fato que pode ser exemplificado pelo oeste da frica, onde mais da metade das espcies so empregadas como plantas medicinais pela populao rural, estimando-se que as espcies encontradas neste continente muitas sintetizam compostos com atividades anti-carcinognica (MALO e ROY, 1996). Estima-se que no mercado mundial, cerca de 50% das plantas so usadas na alimentao, 25% em cosmticos, 20% pela indstria farmacutica e 5% em outras atividades e calcula-se em 10.000 o nmero de espcies vegetais medicinais (CAIGUERAL et al., 2003). No Brasil, alm das plantas medicinais serem comercializadas em feiras livres e mercados pblicos, nos ltimos anos elas tm sido componentes de produtos industrializados que so comercializados com indicaes teraputicas em estabelecimentos como farmcias, casas de produtos naturais e supermercados, como drogas vegetaisa ou/e fitoterpicosb. 1 Conforme a Associao Brasileira da Indstria de Fitoterpicos ABIFITO, o setor representa 5,5% do mercado de princpios ativos. Segundo pesquisas da Universidade de So Paulo, no territrio nacional, existem cerca de 200 fabricantes de medicamentos fitoterpicos. O mercado estima o crescimento de 6% ao ano, em 2010, com lucros anuais em torno de US$ 1 bilho. Como se pode verificar o mercado de produtos fitoterpicos continua em expanso no mundo inteiro. No Brasil, em 2001, a venda de medicamentos fitoterpicos atingiu US$ 270 milhes, representando 5,9% do mercado de medicamentos (CALIXTO, 2003). Nota-se,
a Droga vegetal - planta medicinal ou suas partes, aps processos de coleta, estabilizao e secagem, podendo ser ntegra, rasurada, triturada ou pulverizada (BRASIL, 2004); b Fitoterpico - todo medicamento obtido empregando-se exclusivamente matrias-primas ativas vegetais. caracterizado pelo conhecimento da eficcia e dos riscos de seu uso, assim como pela reprodutibilidade e constncia de sua qualidade. Sua eficcia e segurana so validadas atravs de levantamentos etnofarmacolgicos de utilizao, documentaes tcnico-cientficas em publicaes ou ensaios clnicos fase 3 (BRASIL, 2004);

Reviso de Literatura 22

tambm, um crescimento do mercado internacional movimentando cerca de US$ 50 bilhes, sendo que a Alemanha possui o maior mercado de fitoterpicos representando 10% do mercado farmacutico mundial (SIMES et al, 2001). O interesse atual pelas plantas medicinais e medicamentos delas derivados ocorre principalmente pela frustrao advinda da exagerada expectativa em torno de frmacos de origem sinttica, aos efeitos indesejveis e prejuzos causados tanto pelo uso incorreto como pelo uso abusivo destes, assim como tambm, ao reconhecimento de que vrios vegetais so importantes no desenvolvimento de novas substncias terapeuticamente ativas e a crescente ateno que vem sendo dada, pela comunidade cientfica, para produtos farmacuticos (SCHENKEL et al, 1985; AKERELE, 1992). Por isso, preciso considerar a contribuio das plantas medicinais como fonte natural de frmacos devido diversidade de constituintes qumicos presentes nelas. No entanto, inmeras plantas que so usadas em preparaes fitoterpicas carecem de um rigoroso controle de qualidade, j que a literatura cientfica indica que muitas delas podem apresentar substncias txicas ou composio qumica varivel (NOLDIN et al, 2003; SILVA JNIOR, 2006; ALVES, 2008; NUNES, 2009). Para aumentar a fiscalizao no uso racional das plantas medicinais e produtos fitoterpicos disponveis no comrcio brasileiro, o governo federal juntamente com os ministrios em exerccio aprovaram medidas voltadas garantia de acesso seguro e uso correto de plantas medicinais e produtos fitoterpicos pela populao utilizao sustentvel da biodiversidade brasileira e ao desenvolvimento da indstria nacional, atravs do Decreto n 5813 de 22 de junho de 2006, o qual instituiu a Poltica Nacional de Plantas Medicinal e Fitoterpico (PNPMF) e grupo de trabalho interministerial, para elaborar o Programa Nacional de Plantas Medicinais e Fitoterpico. Tal programa visa estabelecer linhas de ao prioritrias para o uso racional de plantas medicinais e fitoterpicos e tambm consolidar as iniciativas de relevncia no pas e as recomendaes nacionais e internacionais sobre o tema. A idia que se construa no Brasil uma rede de esforos para o desenvolvimento de medidas voltadas melhoria da ateno sade, ao fortalecimento da agricultura familiar, gerao de emprego e renda, incluso social e ao desenvolvimento industrial e tecnolgico de fitoterpicos. E ainda, ampliao das opes teraputicas ofertadas aos usurios do Sistema nico de Sade (SUS), com garantia de acesso a plantas medicinais, fitoterpicos e servios

Reviso de Literatura 23

relacionados fitoterapia, com segurana, eficcia e qualidade, na perspectiva da integralidade a ateno sade. Para isso, o ministrio da sade elaborou uma relao de plantas medicinais de interesse ao SUS. Nesta relao constam 71 espcies de plantas e est sendo divulgada pelo Programa Nacional de Plantas Medicinais e Fitoterpicos do Ministrio da Sade. A finalidade desta lista orientar estudos e pesquisas que possam subsidiar a elaborao da relao de fitoterpicos disponveis para uso da populao, com segurana e eficcia para o tratamento de determinada doena e para que os Estados possam ser estimulados a oferecer o servio com esse tipo de medicamento. So doze os estados brasileiros que j oferecem o servio de fitoterapia aos pacientes do SUS (PORTAL DA SADE, 2009).

2.2 O gnero Heliotropium O gnero Heliotropium consiste de aproximadamente 300 espcies, distribudas nas regies tropicais, subtropicais e temperadas; ocorrendo principalmente nas zonas ridas (GENTRY, 1993; FRTHER, 1998). considerado um dos maiores e mais complexos gneros da famlia Boraginaceae (AKHANI e FRTHER, 1994). Possui hbito em geral herbceo associado ao fruto seco. Foi nomeado por Tournefort em 1719, sendo efetivamente publicado por Carl Linnaeus em 1735. O gnero Heliotropium foi descrito por Carl Linnaeus e a etimologia de Heliotropium vem de hlios que significa sol e trepein que significa mudar, referindo-se ao fato de suas flores torcerem-se aps a exposio ao sol (DI STRATA e HIRUMA-LIMA, 2002). A primeira contribuio para o entendimento da sistemtica do gnero foi dada por De Candolle em 1845, baseado fundamentalmente na forma da antera e no tipo de estigma, props quatro sees: Heliotropium sect. Catimas A. DC., Heliotropium sect. Piptoclaina (G. Don) Endl., Heliotropium sect. Heliotropium A. DC. e Heliotropium sect. Orthostachys R.Br. Mais tarde, Bentham & Hoker (1876) trataram o gnero Heliophytum A. DC. como sinnimo de Heliotropium, propondo para este ltimo mais uma seo: Heliotropium sect. Heliophytum. O tratamento mais recente para as espcies sul-americanas de Heliotropium reconhece 73 espcies e as posicionam em 10 sees (MELO e SALES, 2004).

Reviso de Literatura 24

Apesar de bem representado no Brasil, com estimativa de mais de 25 espcies, os estudos sobre Heliotropium ainda so escassos. Os tratamentos sistemticos que incluem espcies brasileiras so, na maioria, obras clssicas e antigas, como a monografia de Fresenius (1857), na Flora Brasiliensi (MELO e SALES, 2004). Um grande nmero dessas espcies do gnero Heliotropium til como ornamental, e as espcies H. amplexicaule e H. europaeum so reconhecidamente medicinais (DI STRATA e HIRUMA-LIMA, 2002).

2.3 Heliotropium indicum L. 2.3.1 Descrio botnica uma pequena planta herbcea anual, ereta ou decumbente, ramificada, de textura um tanto carnosa, pubescente, podendo atingir 50 a 70 cm de altura (Figura 1A) (LORENZI e MATOS, 2002). A espcie possui ramos angulosos, fistulosos. Suas folhas so simples, alternadas e sub-opostas no mesmo indivduo, de superfcie bulada com nervuras do tipo eucamptdroma impressas na face superior e tamanho variando de 3 a 6 cm de comprimento (LORENZI e MATOS, 2002; MELO e SEMIR, 2008). As folhas so do tipo oval-elptica a oval-deltide, raramente rmbica, apresenta base truncada s vezes assimtrica estreitando-se para o pecolo e pice acuminado (Figura 1B). Na face abaxial pubescente, mais denso sobre as nervuras. A margem varia de erosa a plana, com face adaxial plana e pubescente com tricomas curtos entremeados por tricomas aciculiformes com uma base discide. O pecolo varia de 1,2 a 6,2 cm de comprimento, parcialmente alado e possui lmina de 3,4-12,2 x 1,7-9 cm de comprimento (MELO e SALES, 2004; MELO e SEMIR, 2008). A espcie caracterizada por inflorescncia escorpiide terminais de 15 a 20 cm de comprimento de cor azulada-clara, do tipo axilar e terminal, no bracteada, congesta no pice e pedunculada (Figura 1B) (LORENZI e MATOS, 2002). O pednculo varia de 1,5-4 cm comprimento. Suas flores tm aproximadamente 3-5 mm de comprimento, so ssseis. O clice tem aproximadamente 2,6-3,2 mm de comprimento, profundamente lobado, sendo maior que a metade do comprimento da corola e persistente no eixo da inflorescncia. Os lobos so de 2,2 - 2,6 x 0,2- 0,4

Reviso de Literatura 25

mm, estreitamente lanceolados, de tamanhos levemente diferentes, possui margem com tricomas aciculiformes esparsos. As corolas tm 3,5-4,5 mm de comprimento, do tipo hipocrateriforme e colorao variando de branca a arroxeada. Possui tubo de 2,5 - 4 mm de comprimento, subcilndrico, estreitando-se na fauce e lobos de 0,5-0,9 mm de comprimento (MELO e SALES, 2004; MELO e SEMIR, 2008). A espcie apresenta estames ssseis, inseridos de 0,8-1,5 mm acima da base do tubo da corola; as anteras tm de 0,8 a 1 mm de comprimento, so oblongoovais, possui pice discretamente apiculado, livres entre si, e base levemente cordada. O ovrio tem aproximadamente 0,5 mm de comprimento, longitudinalmente sulcado e glabro, possui estilete evidente de aproximadamente 0,2-0,4 mm de comprimento e estigma de 0,6 mm de comprimento. do tipo subcapitado. A espcie possui um vulo por lculo, curvo e achatado (MELO e SALES, 2004; MELO e SEMIR, 2008). Os frutos so do tipo mitriforme, com 2 a 3 mm de dimetro, possui quatro nculas agrupadas 2 a 2, com 2 ou 3 nervuras salientes na face dorsal e divergentes, com pices acentuadamente bidentado. As sementes so caracterizadas por unidade nas nculas, atingindo at 1,5 mm, com forma elipside, colorao esbranquiada e lisa (MELO e SALES, 2004; MELO e SEMIR, 2008). Esta espcie multiplica-se apenas por sementes (LORENZI, 2000). H. indicum foi primeiramente descrita por Linnaeus em 1753, com base em material procedente da ndia. uma espcie bem definida, a qual Johnston (1928) reconheceu sete sinnimos. Apesar de prxima de Heliotropium elongatum, pode ser facilmente identificada pela lmina foliar com a face adaxial plana e pelo ovrio 4locular, com um nico vulo por lculo e principalmente pelo fruto constitudo por 4 nculas (MELO e SALES, 2004).

Reviso de Literatura 26

2.3.2 Dados taxonmicos Reino: Diviso: Classe: Ordem: Famlia: Gnero: Espcie: Plantae Magnoliophyta Magnoliopsida Lamiales Boraginaceae Heliotropium Heliotropium indicum L.

Sub-Classe: Asteridae

(A)

(B)

Figura 1. Fotografia da espcie Heliotropium indicum (L.) DC (Boraginaceae) mostrando aspectos gerais (A) e detalhe da folha e inflorescncia (B). Fonte: http://www.plants.usda.gov

Reviso de Literatura 27

2.3.3 Distribuio geogrfica A espcie H. indicum L. a mais amplamente distribuda do gnero, ocorre nas Amricas, desde sudeste dos Estados Unidos at a Argentina, incluindo as Antilhas. encontrada tambm na frica Tropical, sia e Austrlia. No Brasil pode ser encontrada nas regies: Norte (AC, AM e PA), Nordeste (AL, BA, CE, MA e PE), Centro-Oeste (GO, MS e MT), Sudeste (ES, MG, RJ e SP) e Sul (PR) (FRHLICH et al, 1981). No estado de Pernambuco a espcie registrada apenas nas zonas do Litoral e da Mata e nas ilhas do arquiplago de Fernando de Noronha, habitando preferencialmente reas abertas, em geral prximas a cursos dgua e margens de estradas e algumas vezes em culturas (MELO e SEMIR, 2004). Devido sua ampla distribuio geogrfica a espcie recebe vrias denominaes populares sendo conhecida como: borragem-brava e cravo-de-urubu (MG); crista-de-galo (BA, MT); fedegoso (MG, PE, PA, AM); crista-de-peru (BA); gervo-branco (ES). Outras sinonmias so aguaraciunha-assu, aguaraquiunha, jamacanga e jacuacanga. (DI STASI e HIRUMA-LIMA, 2002; MELO e SEMIR, 2008), erva-de-so-fiacre, aguara, tureroque, turir, borracha-brava, grinalda-de-boneca (LORENZI e MATOS, 2002).

2.3.4 Dados etnofarmacolgico H. indicum L. uma espcie bastante utilizada pela medicina popular. A literatura etnofarmacolgica registra o uso de todas as partes desta planta na medicina caseira de algumas regies do pas. s suas razes, folhas e flores so atribudas propriedades diurticas e peitoral (LORENZI e MATOS, 2002). relatado, tambm, que na regio amaznica o macerado das folhas em gua indicado em preparaes tpicas contra hemorridas, afeces cutneas: incluindo lceras, abscesso, furnculos, picadas de inseto e tambm em casos de queimaduras (BRAGA, 1976; DI STASI, 2002). Amorozo e Gly (1988) referem que as folhas amassadas com folhas de mucuraca (Petiveria alliacea L.) so usadas para tratamento tpico de leses teciduais. O decocto das folhas, na forma de bochecho e gargarejo, utilizado para tratar aftas, estomatites, ulceraes da garganta e da

Reviso de Literatura 28

faringe (CORRA, 1984; LORENZI e MATOS, 2002). Na medicina tradicional salvadorenha, as folhas e razes maceradas so usadas como preparaes tpicas em regies inflamadas do corpo (GUERRERO, 1994).

2.3.5 Constituintes qumicos e atividade farmacolgica Estudos fitoqumicos mostraram que as folhas de H. indicum L. possuem alcalides, taninos e triterpenos, enquanto as razes, alm de alcalides e taninos, possuem tambm glicosdeos cardiotnicos (GUERRERO, 1994). Outros estudos relatam que j foram isolados os alcalides: heliotrina (Figura 2A) e lasiocarpina e compostos no-alcalodicos, como -sitosterol, lupeol, -amirina e sitosterolglucosdeo (PANDEY et al, 1982; SINGH et al, 2003). A espcie possui alcalides pirrolizidnicos em todas as partes do vegetal (PANDEY et al, 1982; SINGH et al, 2005; SOUZA, et al, 2005). Estes so considerados de grande interesse por suas atividades farmacolgicas e biolgicas (CATALFAMO, 1982; REDDY et al, 2002). Entretanto, outros estudos relatam que tais alcalides possuem uma significativa atividade hepatotxica (KUGELMAN et al, 1976; OHNUMA et al, 1982) . Tambm foram encontrados nas folhas e inflorescncias das espcies de H. indicum e H. angiospermum as aminas: putrescina, espermidina e espermina. Sendo que os teores dessas aminas diminuem com a idade do vegetal (BIRECKA et al, 1984). Alm dessas, a homospermidina foi identificada no eixo da inflorescncia de folhas jovens de H. indicum. Comprovando que os tecidos jovens exibiram nveis elevados de putrescina e alcalodes pirrolizidnicos (BIRECKA et al, 1984). Os alcalides pirrolizidnicos so derivados do acetato e tem origem biossitntica pelo ciclo do cido ctrico e precursor biogentico o aminocido Lornitina. Este alcalide formado por duas molculas do aminocido L-ornitina, a qual originar a estrutura do anel pirrolizdinico (Figura 2). A deteco de homospermidina nas plantas apia a teoria de que o agrupamento pirrolizidnico obtido a partir de duas molculas de putrescina com homospermidina como intermedirio da reao. Os metablitos secundrios, principalmente os alcalides e taninos, tm sidos isolados de uma enorme variedade de plantas, especialmente dos gneros

Reviso de Literatura 29

pertencente famlia Boraginaceae. E podem estar relacionados a uma possvel atividade antimicrobiana desta famlia (BIRECKA et al, 1980). Estudos demonstraram que j foram isolados trs alcalides pirrolizidnicos de todo vegetal: acetillasiocarpina, europina (Figura 2B), heliosupina (Figura 2D) (SINGH et al, 2005).

(A) (B)

N O H OH HO O H3C
(C) (D)

O CH3 CH3 CH3

H3C O H O O

CH3 CH3 CH3 OH OH

HO

H3C H O O

CH3 CH3 OH OH
H3C O H3C

HO H O O

CH3 CH3 CH3 OH OH

HO

(E)

(F)

H3C H3C H3C HO O O H O

H N
HO

H O O

H 3C

CH 3 OH

HO

CH 3

Figura 2. Alcalides isolados da espcie H. indicum L. (A) heliotrina; (B) europina; (C) licopsamina; (D) heliosurpina; (E) helindicina; (F) indicina.

Reviso de Literatura 30

Um novo alcalide denominado helindicina (Figura 2E) e o j descrito licopsamina (Figura 2C) foram isolados das razes de H. indicum L. O alcalide helindicina representa o primeiro relato de um alcalide contendo um anel lactnico no gnero Heliotropium, o qual demonstrou uma moderada atividade antioxidante (SOUZA, et al, 2005). O alcalide heliotrina (Figura 2A) foi isolado das sementes de H. indicum L., e responsvel por uma possvel atividade bloqueadora ganglionar. Porm, estudos realizando testes in vitro e in vivo no demonstraram possuir atividade no sistema nervoso central ou propriedade bloqueadora neuromuscular (PANDEY et al, 1982). Singh e col. (2002), utilizando a espcie Heliotropium subulatum, mostram que os alcalides heliotrina e retronecina, na dose de 5 g/kg/dia, apresentaram atividade inibitria de 41,7% e 38,6% contra Sarcoma 180, respectivamente. O extrato hexnico na concentrao de 3 g/mL e a heliotrina na concentrao de 10 g/mL e 5 g/mL revelaram citotoxicidade seletiva contra clulas de hamster chins V79. J o extrato bruto etanlico e o extrato bruto hexnico mostraram atividade antiviral para coxsackievrus, poliovrus e vrus do sarampo nas concentraes de 100 g/mL e 500 g/mL. Enquanto a heliotrina apresentou atividade contra poliomielite e estomatite vesicular na concentrao de 10 g/mL. Ensaios utilizando o extrato metanlico de H. indicum L para pesquisar componentes biologicamente ativos foram realizados e demonstraram significativa atividade antitumoral diante de carcinoma de Ehrlich e sarcoma em camundongos. Sendo o principal ativo isolado: N-oxido do alcalide indicina (Figura 2F) o responsvel pela atividade biolgica referida deste vegetal (KUGELMAN et al, 1976; DUTTA et al., 1987). Alm dessas propriedades, tambm atribudo aos alcalides as propriedade analgsica, anti-espasmdica e bactericida (OKWU, 2004). A espcie em estudo, alm de apresentar alcalides pirrolizidnicos, tambm apresenta outros componentes em menor quantidade como flavonides e compostos derivados geranil aromticos (SOUZA et al, 2005). Uma nova isoflavona glicosilada denominada heliosdeo, juntamente com 7hidroxiflavanona e 2)naringerina 5-Me tambm foram isolados de todo vegetal (SINGH et al, 2003). A estrutura de heliosdeo foi estabelecida como genistena 7-O-{-L-ramnosil-(1 [-D-glucosil-(1 3)]- -D-glucosideo} (PANDEY et al, 2007).

Reviso de Literatura 31

Os flavonides so constituintes qumicos naturais das plantas que possuem propriedades antialrgicas, anti-inflamatria, antiviral, anti-proliferativa e anticarcinognica, assim como exercem efeito no metabolismo dos mamferos (MIDDLETON e KANDASWAMI, 1993). Assim, atribudo aos flavonides a capacidade de proteo contra radicais livres, responsveis por dificultar a agregao plaquetria e de atuar contra o desenvolvimento de lceras e hepatotoxinas (FARQUHAR, 1996). Estudos a partir do extrato etanlico de H. indicum L. confirmaram a presena de polifenis e taninos (CASTILLO, 2004). Dois novos dihidroxi-esteris e um triterpenide foram isolados a partir das folhas da espcie estudada, e foram caracterizados como 14-metil-5-colesta-9,24-dieno-3,7-diol; e 14-Me-24metileno-5-colesta-9,24-dieno-3,7-diol e cido accico lactona (SRINIVAS et al, 2002). Andhiwal e col. (1985) trabalharam com extrato de ter de petrleo de H. indicum (Boraginaceae) e obtiveram nas fraes steres (C34-C58) composta principalmente de steres: n-hexacosanol e esteris (sitosterol 58.4%, estigmasterol 31.42%, chalinasterol 1.65% e campesterol 8.34%). Com isso, verificaram que o extrato inibiu em 40% a fertilidade na dose de 500 mg/Kg quando testadas em ratas albinas, enquanto que o extrato aquoso desta espcie no apresentou nenhuma atividade anticonceptiva. Reddy e col. (2002) estudaram a eficincia do extrato etanlico de H. indicum L. no processo de cicatrizao de leses teciduais em ratos. A atividade de cicatrizao foi estudada usando exciso e inciso de ferida em modelos de ratos utilizando o extrato para tratamento tpico. Com isso, foi possvel verificar que o extrato de H. indicum apresentou uma melhor atividade na fase de remodelao da cicatrizao, com aumento na porcentagem de cicatrizao da ferida e concluso de cicatrizao em at 14 dias, indicando uma rpida epitelizao e formao de colgeno no local lesado. Machan e col. (2006) isolaram por hidrodestilao um leo voltil marron claro das partes reas de H. indicum. A identificao do leo por cromatografia gasosa (GC-FID) e cromatografia gasosa acoplado a espectrmetro de massa (GC-MS) identificou a composio do leo: fitol (49,1%), 1-dodecanol (6,4%) e -linalol (3,0%). E ainda, este leo mostrou uma significativa atividade antimicrobiana contra

Reviso de Literatura 32

Mycobacterium tuberculosis H37Ra com uma concentrao inibitria mnima de 20,8 g/ml. Em outro trabalho utilizando o extrato bruto hexnico da parte area de H. indicum obtiveram dezesseis cidos graxos livres: cido 9,12-octadecadienico (39,7%), cido 9-octadecenico (32,4%), cido hexadecanico (14,2%) e cido octadecanico (5,1%), como os principais constituintes. E o extrato bruto hexnico mostrou uma moderada atividade antimicrobiana (CIM de 100 g/mL) contra Mycobacterium tuberculosis H37Ra (MACHAN et al, 2007).

2.3.6 Toxicidade da espcie H. indicum L. Muitas plantas contm substncias capazes de exercer ao txica contra organismos vivos. Segundo algumas teorias, essas substncias seriam formadas com a funo de defender a espcie contra seus predadores. Por isso, no de surpreender que muitas delas acumulem substncias de elevada toxicidade (SIMES et al, 2001). A espcie H. indicum L. possui alcalide pirrolizidnicos (AP), estes constituem um amplo grupo de alcalides contendo o ncleo pirrolizidnico em toda sua estrutura. Os APs representam uma grande classe de produtos naturais e mostramse os responsveis por uma atividade hepatotxica e carcinognica (CHEEKE, 1988), em alguns casos podem levar a uma atividade pneumotxica e at neurotxica (COOPER e HUXTABLE, 1999). Os alcalides pirrolizidnicos so metabolizados no fgado pelo sistema citocromo P-450 e convertidos em um intermedirio reativo dehidroalcalide, que podem produzir hepatotoxicidade (COOPER e HUXTABLE, 1999; WANG et al, 2007). Mais de 350 alcalides pirrolizidnicos foram identificados em mais de 6.000 espcies das famlias Boraginaceae, Asteraceae e Leguminosae. Cerca da metade dos alcalides pirrolizidnicos identificados so txicos e vrios tm sido demonstrado que so causadores de leses hepticas e cancergenos para os roedores (STEGELMEIER e EDGAR, 1999; CREWS e KRSKA, 2008). Essas espcies tm distribuio mundial e estes alcalides so responsveis por afetar a

Reviso de Literatura 33

pecuria, animais selvagens e at humanos. A intoxicao de humanos ocorre mais freqentemente e resultado da contaminao dos alimentos ou quando essas espcies vegetais so usadas para fins medicinais (STEGELMEIER e EDGAR, 1999). Foi relatado um caso de enorme mortalidade de eqinos que ocorreu provavelmente devido intoxicao por alcalide pirrolizidnicos de H. indicum L. Por mais de 4 anos, mais de 75% de uma populao de cerca de 110 cavalos em uma fazenda na Costa Rica morreu apresentando sintomas neurolgicos, com manifestaes clnicas aguda e crnica, ambos com um desfecho fatal (VAN WEEREN et al, 1999). As plantas que contm os alcalides pirrolizidnicos esto disseminadas pelo mundo e so em grande parte responsveis pela intoxicao de animais e seres humanos, entre elas as duas espcies da famlia Boraginaceae que mais causam danos hepticos so: Echium plantaguineum e Heliotropium europeaum. Outro membro importante da famlia Boraginaceae o confrei (Symphytum officinale), uma planta comumente cultivada como forragem e uma erva medicinal. O confrei contm pelo menos oito AP hepatotxicos (CULVENOR et al., 1980), alguns dos quais so conhecidas como cancergenos. Hirono e col. (1978) demonstraram que as folhas e razes de confrei so cancergenas para ratos. Por isso, atualmente o Ministrio da Sade proibiu o uso pela via oral do confrei, devido presena de alcalides pirrolizidnicos.

2.4 Tinturas No se sabe ao certo quando o uso de tinturas extradas de vegetais, animais ou minerais comeou a ser utilizada como auxiliar no tratamento de doenas. Foi de Teofrasto Paracelso (1493-1541), mdico, antroplogo e telogo da Europa medieval, a descrio e produo de tinturas para fins teraputicos, descrevendo a formulao de diversas substncias, dotadas de indiscutvel valor farmacolgico. A primeira farmacopia a descrever as tinturas foi o Dispensatorium Valerii Cordi

Reviso de Literatura 34

(1666), que indicava o modo de obteno de algumas dessas preparaes, como a tintura da casca de laranja (PRISTA et al, 1990). A Farmacopia Brasileira IV (1988) define as tinturas como sendo preparaes alcolicas ou hidroalcolicas resultantes da extrao de drogas vegetais, minerais e animais no estado seco ou da diluio dos respectivos extratos. Entretanto, comum dar-se a mesma designao s solues extrativas preparadas com outros solventes, que no o lcool, como o ter, clorofrmio, acetona, etc. As tinturas so classificadas em simples e compostas, conforme preparadas com uma ou mais matrias-primas, exceto quando se encontra diferentemente, 10 mL de tintura simples correspondem a 1g da droga seca. O nome tintura provm de sua apresentao, pois as solues extrativas contm princpios ativos dotados de cor e vrios pigmentos (ex: clorofila, flavonas, quinonas, etc.). Na preparao de uma tintura deve-se observar o estado do frmaco, a escolha do lcool de graduao e o mtodo de extrao empregado. Habitualmente, utilizam-se as drogas vegetais para preparar tinturas, raras vezes se escolhe o uso de drogas animais ou minerais. Entre suas vantagens destaca-se a grande riqueza em princpios ativos, boa conservao face s invases microbianas e a facilidade de medio posolgica que apresentam (PRISTA et al, 1996). As drogas vegetais podem ter grande atividade ou ser pouco ativas, sendo classificada, portanto como droga herica e droga no herica, respectivamente. Dessa forma, utilizam-se trs processos para obteno das tinturas: macerao, percolao e dissoluo do extrato seco. A macerao o processo correntemente utilizado para preparar tinturas de drogas pouco ativas. Obtida as substncias atravs da macerao, a soluo alcolica filtrada. Dessa forma, quanto ao mtodo de extrao, a macerao o processo utilizado para preparar tinturas de drogas no hericas. (FARMACOPEIA BRASILEIRA II, 1959; PRISTA et al, 1996; GENARO, 2004). A percolao consiste em fazer passar o solvente atravs da camada da droga, at o seu completo esgotamento. A percolao simples compreende a extrao exaustiva da droga com solvente sempre renovado. Em pequena escala, a percolao conduzida em extratores, denominados percoladores, de corpo cilndrico ou cnico, provido de torneira na parte inferior, para regular o fluxo do solvente (SANTOS, 2000).

Reviso de Literatura 35

2.5 Extrato liofilizado A liofilizao um processo de estabilizao, no qual uma substncia previamente congelada e ento a quantidade de solvente reduzida, primeiro por sublimao e posteriormente por dessecao para valores tais que impeam atividade biolgica e reaes qumicas. A liofilizao freqentemente o mtodo de escolha para a desidratao de frmacos, vacinas, produtos de biotecnologia e diagnostico, devido s vantagens oferecidas em termos de estabilidade trmica e reteno de atividades durante o processo e durante o subseqente armazenamento do produto liofilizado (AYROSA, 2004; AYROSA et al, 2007). O processo de secagem por liofilizao um mtodo controlvel de desidratar materiais lbeis, atravs da dessecao sob presso reduzida que apresenta vrias vantagens quando comparado a outros processos de desidratao. A baixa temperatura, mantida durante todo o processo, evita qualquer alterao qumica das substncias sensveis ao calor e umidade. Por este motivo, um produto seco por esta tcnica mantm inaltervel a sua composio qumica original, a sua atividade teraputica e outras propriedades caractersticas. Se for acondicionado convenientemente, poder manter-se sem alterao por um longo perodo. Os produtos liofilizados apresentam facilidade na reconstituio devido estrutura porosa deixada pela sada da gua. Isto garante a reproduo fiel do produto original uma vez em contato com a fase lquida primitiva. A liofilizao reduz a tendncia que certos produtos tm para aglomerarem quando dessecados por outras tcnicas, alm de reduzir tambm a perda de constituintes volteis (AYROSA, 2004).

2.6 Estudos de pr-formulao O desenvolvimento de um novo medicamento requer estudos de prformulao. Esta fase de desenvolvimento caracterizada pela avaliao das propriedades fsico-qumicas do frmaco isolado ou associado a diversos adjuvantes (ARAJO, 2003). Cada frmaco possui caractersticas qumicas e fsicas importantes que precisam ser estudadas antes da sua incorporao em um veculo/excipiente farmacutico. Entre esses parmetros pode-se citar a solubilidade, coeficiente de partio, velocidade de dissoluo, forma fsica de

Reviso de Literatura 36

apresentao e estabilidade (ANSEL et al, 2000), podem ser avaliados atravs de metodologias como cromatografia lquida de alta eficincia (CLAE), espectroscopia na regio do infravermelho (IV) e anlises trmicas (TGA, DTA e DSC) (VILA JATO, 2001; SILVA JNIOR, 2006; ALVES, 2008; NUNES, 2009). O frmaco candidato ao medicamento, seja qual for via de administrao, deve ser solvel em alguma frao aquosa, ser absorvido e apresentar resposta teraputica. Muitos dos componentes do extrato aquoso ou hidroalcolico de plantas apresentam boa solubilidade em gua e fcil incorporao no veculo farmacutico. Ao se analisar extratos vegetais o estudo de pr-formulao torna-se mais difcil, pois os marcadores disponveis podem sofrem alteraes em funo do pH, polaridade de solventes, temperatura e interaes entre excipientes ou veculos utilizados. Portanto, ao formular produtos, contendo ativos naturais, fundamental a identificao padronizada de marcadores ou o desenvolvimento de mtodos que permitam a quantificao de grupos qumicos purificados antes, durante e aps o processo de obteno (SILVA JNIOR, 2006; ALVES, 2008). Com os resultados dos estudos de pr-formulao elabora-se um informe que definir a viabilidade da forma farmacutica proposta e a metodologia a ser seguida no desenvolvimento na fase de formulao e elaborao (VILA JATO, 2001).

2.7 Tcnicas analticas utilizadas no desenvolvimento, avaliao e controle de qualidade de fitoterpicos 2.7.1 Espectroscopia na regio do infravermelho (IV) Define-se espectroscopia na regio do IV como a medida da absoro, por parte de compostos qumicos analisados, de uma radiao eletromagntica em que o comprimento de onda se situa na faixa de 104 a 102 cm, sendo este espectro nico para cada substncia com exceo aos ismeros pticos que em soluo apresentam espectros idnticos (KOROLKOVAS, 1984). A espectroscopia no IV um tipo de espectroscopia de absoro a qual usa a regio do infravermelho do espectro eletromagntico. Como as demais tcnicas espectroscpicas, esta pode ser usada para identificar um composto ou investigar a

Reviso de Literatura 37

composio de uma amostra. A espectroscopia no IV se baseia no fato de que as ligaes qumicas das substncias possuem freqncias de vibrao especficas, as quais correspondem a nveis de energia da molcula (chamados nesse caso de nveis vibracionais). Tais freqncias dependem da forma da superfcie de energia potencial da molcula, da geometria molecular, das massas dos tomos e eventualmente do acoplamento vibrnico. Portanto, se a molcula receber radiao eletromagntica com 'exatamente' a mesma energia de uma dessas vibraes, ento a luz ser absorvida desde que sejam atendidos a determinadas condies. Para que uma vibrao aparea no espectro IV, a molcula precisa sofrer uma variao no seu momento dipolar durante essa vibrao (SILVERSTEIN et al, 2006). Logo, o espectro na regio do IV de uma substncia orgnica corresponde ao conjunto de bandas de absoro apresentadas pela amostra submetida radiao infravermelha e estas bandas correspondem s mudanas na energia vibracional dos compostos orgnicos. A energia absorvida da radiao IV provoca alteraes transitrias nas ligaes interatmicas, que podem sofrer estiramentos ou deformaes nos ngulos de ligao. As frequncias em que ocorrem as vibraes dependem da natureza das ligaes em particular, mas so tambm afetadas pela vizinhana qumica e pela molcula como um todo. A presena de insaturaes (conjugadas ou no), sistemas aromticos e grupos funcionais especficos pode ser verificada atravs da presena de bandas caractersticas que tm grande importncia na anlise estrutural. Se o espectro IV da substncia desconhecida superponvel com o espectro IV de uma amostra autntica conhecida, ento isso pode servir como uma prova de identidade, a qual muitas vezes preconizada para ideniticao de frmacos pelas farmacopias (FALKENBERG et al, 2001). A Espectroscopia no infravermelho com transformada de Fourier (FTIR) uma tcnica de anlise para colher o espectro infravermelho e acumular maior quantidade de dados. Pois, ao invs de se coletar os dados variando-se a freqncia da luz infravermelha a cada comprimento de onda, a luz IV (com todos os comprimentos de onda da faixa usada) guiada atravs de um interfermetro. Depois de passar pela amostra o sinal medido o interferograma. Realizando-se uma transformada de Fourier no sinal resulta-se em um espectro idntico ao da espectroscopia IV convencional (dispersiva). Esta tcnica espectroscpica complementar pode ser usada para identificar um composto ou investigar a composio de uma amostra. Atualmente a espectroscopia na regio do

Reviso de Literatura 38

infravermelho largamente usada tanto na indstria quanto na pesquisa cientfica pois ela uma tcnica rpida e confivel para medidas, controle de qualidade e anlises dinmicas (SILVERSTEIN et al, 2006). Os dados de anlise em infravermelho alm de fornecer caractersticas estruturais do material ativo, tambm auxiliam na seleo de componentes da formulao. Dependendo da natureza qumica da substncia em estudo, h vrias opes de instrumentos analticos que podem auxiliar no estudo de pr-formulao e doseamento como: cromatografia em camada delgada (CCD), cromatografia gasosa (CG), ressonncia magntica nuclear (RMN) de 1H e
13

C, anlise trmica, etc.

(SILVA JNIOR, 2006; ALVES, 2008; NUNES, 2009). Com isso, a espectroscopia na regio do IV auxilia nos estudos de pr-formulao, na qual as caractersticas qumicas de cada excipiente podem ser avaliadas isoladamente e/ou misturando com o componente da formulao (ALVES, 2008; NUNES, 2009).

2.7.2 Anlise trmica Anlise Trmica um termo que abrange um grupo de tcnicas nas quais uma propriedade fsica ou qumica de uma substncia, ou de seus produtos de reao, monitorada em funo do tempo ou temperatura. Enquanto a temperatura da amostra, sob uma atmosfera especfica, submetida a uma programao controlada, a amostra est sujeita a um esquema de temperatura que consiste de uma srie de segmentos pr-selecionados, nos quais esta (amostra) aquecida ou resfriada a uma razo constante ou mantida a temperatura constante (WENDTLENDT, 1986; GIOLITO e IONASHIRO, 1988). As tcnicas termoanalticas adquiriram importncia crescente em todas as reas de conhecimento na qumica bsica e aplicada. A utilizao dessa metodologia, dotada de grande potencialidade, foi favorecida pela disponibilidade de instrumentos controlados por microprocessadores, capazes de fornecer informaes quanto ao comportamento trmico dos materiais de forma precisa e num tempo relativamente curto. Tais mtodos esto sendo largamente utilizados no controle de qualidade de drogas naturais ou sintticas, pois fornecem, com rapidez, dados sobre a estabilidade do material analisado, em relao ao seu comportamento trmico. Alm de que dados preliminares sobre o material analisado levam a pensar que se

Reviso de Literatura 39

conhecendo o comportamento trmico do componente majoritrio de uma planta, pode-se identificar a autenticidade de um extrato bruto (GIOLITO e IONASHIRO, 1988). A anlise termogravimtrica para estudo de pr-formulao ou compatibilidade frmaco-excipiente vem ganhando importncia crescente no Brasil, pois vrios trabalhos tm sidos publicados nesta rea. Destacam-se, entre outros, aplicao da termogravimetria (TG) no controle de qualidade da milona (Cissampelos sympodialis Eichi.) Minispermaceae (ARAGO et al, 2002); estudo de compatibilidade termoanaltico de de zidovidina comprimidos com excipientes (ARAJO, 2003); estudo de revestidos contendo captopril atravs

termogravimetria e calorimetria exploratria diferencial (BAZZO e SILVA, 2005); estudo termoanaltico (TG, DTG e DSC) dos cafs in natura e processados (SCHNITZLER et al, 2005); determinao dos teores de umidade e cinzas de amostras comerciais de guaran utilizando mtodos convencionais e anlise trmica (ARAJO et al, 2006); avaliao fsico-qmica do extrato fluido e seco por nebulizao de Symphytum officinale L. (SILVA JNIOR et al, 2006); estudo termoanaltico e de compatibilidade frmaco-excipiente de rifampicina e alguns medicamentos utilizados na teraputica da tuberculose (ALVES, 2007); estudo de caracterizao fsica, qumica, fsico-qumica e de pr-formulao de Arrabidaea chica (H&B) Verlot (ALVES, 2008); caracterizao termoanaltica e estudo do perfil de dissoluo de comprimidos contendo metronidazol (RODRIGUES et al, 2008), caracterizao qumica e fsico-qumica e estudos preliminares de planejamento da formulao fitoterpica semi-slida contendo tintura de Calndula officinalis L. (NUNES, 2009).

2.7.2.1 Termogravimetria (TG) TG a tcnica na qual a mudana da massa de uma substncia medida em funo da temperatura enquanto esta submetida a uma programao controlada. Esta tcnica determina as perdas ou ganhos de massa de uma substncia em funo da temperatura ou do tempo (GIOLITO e IONASHIRO, 1988). Os experimentos para avaliar as variaes de massa de um material em funo da temperatura so executados atravs da termobalana, permitindo o trabalho sob as

Reviso de Literatura 40

mais variadas condies experimentais. As curvas geradas possibilitam a obteno de informaes quanto estabilidade trmica da amostra, composio e estabilidade dos compostos intermedirios e do produto final (ARAJO, 2003; ALVES, 2007). Nas curvas termogravimetricas convencional ou dinmica so registradas as massa da amostra (m) em funo da temperatura (T) ou tempo (t). Nessas curvas, os degraus em relao ao eixo das ordenadas correspondem s variaes de massa sofrida pela amostra e permitem a obteno de dados que podem ser utilizados com finalidades quantitativas.

2.7.2.2 Anlise trmica diferencial (DTA) A DTA a tcnica pela qual a diferena de temperatura ( T) entre a substncia e o material de referncia (termicamente estvel) medida em funo da temperatura, enquanto ambos so submetidos a uma programao controlada de temperatura. A temperatura medida por termopares conectados aos suportes metlicos das cpsulas de amostra e do material de referncia, ambos contidos no mesmo forno. As variaes de temperatura na amostra so devidas s transies entlpicas ou reaes endotrmicas ou exotrmicas. As curvas DTA representam os registros de T em funo da temperatura (T) ou do tempo (t), de modo que os eventos so apresentados na forma de picos. Os picos ascendentes caracterizam os eventos exotrmicos e os descendentes os endotrmicos (WENDLANDT, 1986; MACHADO e MATOS, 2004).

2.7.2.3 Calorimetria exploratria diferencial (DSC) DSC a tcnica na qual se mede a diferena de energia fornecida substncia e a um material de referncia, termicamente inerte em funo da temperatura, enquanto a substncia e a referncia so submetidas a uma programao controlada de temperatura (GIOLITO e IONASHIRO, 1988). De acordo com o mtodo de medida utilizado, h duas modalidades: calorimetria exploratria diferencial com compensao de potncia e a calorimetria exploratria diferencial com fluxo de calor. Na DSC com compensao de potncia,

Reviso de Literatura 41

a amostra e a referncia so aquecidas em compartimentos distintos, assim possvel mant-las em condies isotrmicas. Neste caso, a amostra sofre variaes de temperatura devido a eventos endotrmicos ou exotrmico em funo do aquecimento ou resfriamento, ocorre uma modificao na potncia de entrada do forno correspondente, proporcionando a anulao desta diferena (WENDTLENDT, 1986). Na DSC com fluxo de calor, a amostra e a referncia so colocadas em cadinhos idnticos, localizados sobre um disco termoeltrico e aquecidos por uma nica fonte de calor. Assim, o calor transferido atravs do disco para amostra e referncia, sendo que o fluxo de calor diferencial entre ambas monitorado por termopares localizados abaixo dos cadinhos. Dessa forma, a diferena no fluxo de calor da amostra e da referncia diretamente proporcional diferena de potncia das junes dos termopares (WENDTLENDT, 1986).

2.8 Estrutura e funes da pele A pele o maior e mais complexo rgo do corpo humano segundo sua histologia e contm pelo menos cinco diferentes tipos de clulas que contribuem para sua organizao estrutural, e demais tipos celulares, provenientes dos sistemas circulatrio e imunolgico (MENON, 2002; HADGRAFT, 2004). A funo primordial da pele a proteo contra processos de desidratao e micro-organismos agressores. Desta forma, ela se faz mais ou menos permevel s substncias qumicas e permite a passagem de medicamentos em certas condies, podendo ser considerada como uma interface teraputica. E mesmo que a pele represente uma barreira fsica penetrao de substncias, existem vrias formas farmacuticas de uso tpico que sofrem absoro, inclusive as de uso sistmico (LIRA, 2003). A estrutura geral da pele formada por um tecido estratificado disposto em quatro planos ou camadas, e dentre eles do plano interno para o plano externo: a derme reticular e a superficial ou papilar, a epiderme vivel e o estrato crneo (EC). Cada plano ou camada possui caractersticas fisiolgicas distintas e funes biolgicas prprias (BAUMANN, 2002). Abamba (1993), Foldvari (2000) e Baumann

Reviso de Literatura 42

(2002) acrescentaram um quinto plano ou camada, o tecido adiposo, subcutneo ou hipoderme que est situado abaixo da derme reticular. A epiderme a camada externa da pele, derivada da ectoderme e est em contato direto com o meio ambiente. avascular, possui em sua constituio o epitlio estratificado pavimentoso, terminaes nervosas livres e algumas clulas migratrias provenientes da derme (BENY, 2000; JUNQUEIRA e CARNEIRO, 2004). A derme o tecido conjuntivo em que se apia a epiderme e une a pele ao tecido celular subcutneo ou hipoderme (JUNQUEIRA e CARNEIRO, 2004). caracterizada como acelular, mas rica em vasos sanguneos, vasos linfticos e terminaes nervosas (FOLDVARI, 2000). J a hipoderme funciona como um amortecedor mecnico e barreira trmica, que sintetiza e estoca rapidamente substncias energticas prontamente disponveis (AUTON, 2005). O estrato crneo a barreira que limita a velocidade e restringe os movimentos de entrada e sada de substncias (LACHMAN, 2001). Na pele tambm so observadas estruturas anexas como glndulas sebceas e sudorparas (crinas e apcrinas), folculos pilosos e unhas (WILKINSON e MOORE, 1990; BARRY, 2002). A funo essencial da pele a proteo do organismo frente as diversidades do meio externo, como agentes fsicos, qumicos e biolgicos, poeira e gases, microorganismos patognicos e radiaes. A pele responsvel pela termorregulao, ou seja, regulao da perda e ganho de calor; atua como rgo sensorial, pois exerce a funo neuro-sensorial atravs do tato; tem a funo de percepo da temperatura e da dor; apresenta funes endcrinas, como: funo de ossificao, pela sntese da vitamina D; exerce influncia na reproduo humana e perpetuao da espcie (pela sntese de feromnios); por meio de sinais visuais ou expresses emocionais, um rgo que permite evidenciar a comunio no-verbal (ABAMBA, 1993; MENON, 2002).

2.8.1 Vias de permeao percutnea pelo estrato crneo A permeao percutnea de frmacos pelo estrato crneo (EC) at as camadas mais profundas da pele ocorre por difuso atravs de trs vias diferentes, a seguir discriminadas:

Reviso de Literatura 43

Via transcelular por difuso atravs das clulas (atravs dos cornecitos e matriz lipdica intercelular); Via intercelular por difuso entre as clulas (por entre os cornecitos e pela matriz lipdica); Via transanexal por difuso atravs dos folculos pilosos, glndulas sudorparas e sebceas e anexos pilosebceos (ANSEL et al, 2000).

Se a pele estiver intacta, a principal via de penetrao dos frmacos so as camadas epidrmicas e no os folculos pilosos ou ductos das glndulas, pois sua rea superficial bastante pequena em comparao com a da pele que no contm nenhum desses elementos anatmicos. Portanto, a absoro percutnea dos medicamentos resulta da penetrao direta do frmaco atravs do estrato crneo, passando aos tecidos epidrmicos mais profundo e atingindo a derme que vascularizada e onde o frmaco torna-se disponvel para absoro (ANSEL et al, 2000). O termo penetrao apresenta um conceito fundamentado na passagem dos(s) princpio(s) ativo(s) somente atravs do EC, enquanto que permeao est relacionada com a passagem dos(s) princpio(s) ativo(s) atravs da epiderme atingindo a epiderme vivel ou a derme. J o termo absoro faz referncia a passagem dos(s) princpio(s) ativo(s) para corrente sagunea (RIEGER, 1993). A eficcia de produtos farmacuticos ou cosmticos apresentando em sua composio princpios ativos funcionais dependente da penetrao limitada deste na pele. Os mtodos existentes que promovem aumento deste processo se fundamentam: no emprego de promotores de penetraa; no estudo profundo das caractersticas qumicas e fisico-qumicas das substcias ativas e a possibilidade do emprego de seus derivados quando estes forem desfavorveis; na interao das substncias ativas e componentes da formulao e material de acondicionamento; na utilizao de sistemas veiculados de liberao, como microemulso, ciclodextrinas, nanossomas, lipossomas e a ao de agentes atuantes como promotores fsicos de penetrao, como iontoforese, sonoforese e eletroporao (NAIK et al, 2000; MOSER et al, 2001).

Reviso de Literatura 44

2.9. Formulaes para uso tpico Os frmacos que tm administrao tpica (aplicados na pele) tanto podem agir no local de aplicao, como para produzir efeitos sistmicos. Entretanto, na maioria dos casos, o que se pretende com as preparaes farmacuticas aplicadas pele que tenham ao local e, para tanto, so formuladas para ter contato local prolongado com absoro mnima (ANSEL et al, 2000). Os frmacos aplicados pele para ao local so antisspticos, antifngicos, anti-inflamatrios, anestsicos locais, emolientes e protetores contra as condies ambientais, como o sol, vento, insetos e irritantes qumicos. E para essa finalidade, so administrados como formulaes semi-slidas como: as pomadas, gis, cremes, pastas; como ps secos, aerossis ou at preparaes lquidas, como as solues e loes (ANSEL et al, 2000).

2.9.1 Gel Gis so sistemas semi-slidos que consistem na disperso de molculas grandes ou pequenas em um veculo lquido que adquire consistncia semelhante gelatina pela ao de uma substncia a ele adicionada, como carboximetilcelulose (ANSEL et al, 2000). Existem duas classes de gis: gis hidrofbicos, nas quais suas bases (oleogis) geralmente consistem em parafina lquida com polietileno ou leos gordurosos gelificados com slica coloidal, sabes de alumnio ou zinco e gis hidroflicos (hidrossolveis, hidrogis), cujas bases geralmente consistem em gua, glicerol ou propilenoglicol gelificado com agentes gelificantes adequados como tragacanto, amido, celulose, derivados, polmeros de carboxivinil e silicatos de magnsio-alumnio (GENNARO, 2004). Os gis hidrossolveis tm sido muito usados em produtos cosmticos e como base dermatolgica, pois apresentam fcil espalhamento, no so gordurosos e podem veicular princpios ativos hidrossolveis. Geralmente, as substncias formadoras de gis so polmeros, que quando dispersos em meio aquoso, assumem conformao doadora de viscosidade preparao. Polmeros so substncias de alto peso molecular, tambm chamados de macromolculas (CORRA et al, 2005).

Reviso de Literatura 45

O tipo de polmero empregado na formulao do gel pode influenciar o comportamento reolgico desta e, portanto, pode influenciar a estabilidade fsica do produto, assim como, o seu comportamento sobre a pele (liberao de ativos pelo veculo e formao de filme na pele) (CORRA et al, 2005). Apesar do estudo cientfico das macromolculas ter se iniciado h pouco tempo (cerca de 50 anos), seu desenvolvimento tem sido vertiginoso. Vrios polmeros vm sendo usados nas formulaes de gis de aplicao cosmticas e/ou farmacuticas, pois apresentam fcil espalhamento, no so gordurosos nem comedognicos e podem transportar princpios ativos hidrossolveis, lipossolveis, vetores carreadores de frmacos como lipossomas e nanopartculas. So mais indicados para pessoas que possuem pele oleosa e mista (FLORENCE e ATTWOOD, 2003; CORRA et al, 2005). Existe grande variedade de matrias-primas disponveis para a preparao de gis e a seleo adequada para o desenvolvimento destas formulaes, baseia-se nos requisitos necessrios para a estabilidade, liberao e eficcia do ativo que eventualmente ser incorporado na preparao. Segundo Aulton (2005) e Lopes e col. (2005), os numerosos agentes gelificantes podem ser divididos em trs classes: derivados da celulose (metilcelulose, hidroxietilcelulose, hidroxipropilmetilcelulose, carboximetilcelulose sdica); polmeros no-celulsicos naturais ou semi-sintticos (gomas, pectinas, gar, cido algnico); polmeros do cido acrlico (carbmeros carbopol). Partindo do pressuposto de que o frmaco no se liga ao polmero, tais gis liberam bem o frmaco. Os poros permitem a difuso relativamente livre de molculas menores (AULTON, 2005). Gennaro (2004) tambm comenta que os gis muitas vezes proporcionam uma liberao mais rpida da droga, independentemente da solubilidade da droga em gua, quando comparados com os cremes e pomadas. A formulao semi-slida gel muito utilizada, pois atua como transportadora para medicamentos que so topicamente administrados por meio da pele, crnea, tecido retal, mucosa nasal, vagina, tecido bucal, membrana uretral e revestimento externo da orelha. Devido ao seu comportamento reolgico, os semi-slidos (creme, pomada, pasta, gel) podem aderir superfcie de aplicao por perodos suficientemente longos at serem removidos. Tal propriedade ajuda a prolongar a liberao do medicamento no local de aplicao, apresenta facilidade de aplicao,

Reviso de Literatura 46

capacidade de liberao tpica de uma grande variedade de molculas medicamentosas (GUPTA e GARG, 2002).

2.9.2 Hidroxietilcelulose (Natrosol250) Este composto tem grupos hidroxetila ligado cadeia de celulose e tambm se encontra disponvel em diferentes graus de viscosidade. Hidroxietilcelulose tem a vantagem de ser solvel tanto em gua quente quanto na gua fria, no formando gel sob aquecimento (AULTON, 2005). Entre os gis de natureza no inica base de celulose, o de maior interesse para veiculao de ativos em dermatologia o gel de hidroxietilcelulose (HEC), pois solvel em gua fria ou quente, tolera bem pH cido e indicado para incorporao de ativos que levam a um abaixamento do pH final da formulao (FERREIRA, 2000).

2.10 Estudo de estabilidade das formulaes Os estudos de estabilidade de produtos cosmticos e farmacuticos procuram fornecer informaes que indiquem o grau de estabilidade relativa de um produto nas condies diversas de exposio a que possa estar sujeito, at o encerramento de seu prazo de validade. Geram subsdios para a orientao nos estudos de desenvolvimento, como: escolha dos componentes da formulao e do material de acondicionamento adequado; forma de apresentao; materiais de acondicionamento e embalagens alternativas e a confirmao do prazo de validade estimado (RIBEIRO et al, 1996). Primeiramente so avaliadas as caractersticas organolpticas (aspecto, cor e odor), o valor de pH e da viscosidade das formulaes. Estes parmetros so estudados comparativamente, considerando-se as caractersticas iniciais do produto e suas alteraes ao longo do tempo (BABY, 2005). Os estudos de estabilidade geram resultados que so avaliados comparativamente exigindo que os ensaios sejam conduzidos em paralelo com um produto de referncia. Este pode ser um produto de mercado, uma formulao

Reviso de Literatura 47

recm preparada ou uma amostra armazenada em condies de alterao reduzida, como refrigerador (5,0 2,0 ou temperatura ambiente ao abrigo de luz e C) umidade (25 2,0 que conhecidamente preserve as caractersticas fsicas, C) qumicas, microbiolgicas e toxicolgicas do produto (BRASIL, 2004). Vrios fatores influenciam a estabilidade das formulaes, dentre eles os extrnsecos, que envolvem condies externas s quais os produtos ficam expostos, como: tempo, temperatura, luz, oxignio, umidade, material de acondicionamento, microorganismos e vibrao; os intrnsecos que esto relacionados com a natureza da formulao e a interao de seus componentes. Geram, principalmente, incompatibilidades fsicas e qumicas que podem resultar em alteraes nas caractersticas organolpticas da formulao, separao de fases e reduo do teor da substncia ativa (VELASCO-DE-PAOLA, 2001).

2.10.1 Avaliao preliminar da estabilidade A avaliao preliminar da estabilidade envolve, comumente, nmero elevado de formulaes e testes que apresentam condies drsticas de temperatura, efeito de gravidade e umidade, aplicadas s preparaes, permitindo, portanto, selecionar as de melhor desempenho quanto estabilidade fsica e fsico-qumica. A avaliao preliminar da estabilidade permite que o formulador escolha, dentre as vrias frmulas da etapa de desenvolvimento do produto e em concordncia com os critrios estabelecidos para a aceitao ou rejeio, qual ou quais esto aparentemente estveis (RIBEIRO et al, 1996; BRASIL, 2004). As formulaes so sujeitas s condies de estresse trmico, visando acelerar o surgimento de possveis sinais de instabilidade. Aquelas que apresentarem modificaes aps o teste devero ser rejeitadas pelo estudo ou pesquisadas as possveis modificaes nos componentes das preparaes para melhoria da estabilidade. Aquelas que indicarem melhor desempenho devero ser submetidas ao teste de estabilidade acelerada.

2.10.2 Teste de estabilidade acelerada O teste de estabilidade acelerada orientativo na previso da estabilidade do produto em condies drsticas de armazenamento e de durao reduzida de

Reviso de Literatura 48

tempo. As formulaes so submetidas ao armazenamento em situaes de temperatura e luminosidade extremas e so avaliadas aps os ensaios, selecionando-se as de melhor desempenho ao teste. Os parmetros avaliados envolvem possveis alteraes fsicas e fsicoqumicas, como: aspecto, cor, odor, valor de pH e viscosidade. O material de acondicionamento possui papel relevante na estabilidade de formulaes cosmticas ou farmacuticas, pois pode proteger o produto da exposio luz, da umidade e dos gases atmosfricos, mas no pode evitar o efeito da variao da temperatura do ambiente onde armazenada (BABY, 2005).

49

3. OBJETIVOS

Objetivos 50

3. Objetivos

3.1. Objetivo Geral

Desenvolver e avaliar uma formulao fitoterpica semi-slida (gel) para uso tpico contendo tintura padronizada de Heliotropium indicum L. (Boraginaceae) com atividade antimicrobiana.

3.2. Objetivos Especficos

Caracterizar atravs de parmetros fsico, qumico e fsico-qumico a droga vegetal e a tintura de H. indicum L. Obter os perfis cromatogrficos do extrato hidroalcolico e fraes da espcie em estudo, utilizando cromatografia em camada delgada CCD e cromatografia lquida de alta eficincia CLAE DAD; Caracterizar a tintura em funo de marcadores internos com fins de controle de qualidade; Avaliar a atividade antimicrobiana do extrato bruto da espcie vegetal investigada; Realizar estudos de planejamento da formulao fitoterpica semi-slida contendo a tintura de H. indicum L. Realizar estudos de formulao do extrato liofilizado de H. indicum L. com os adjuvantes farmacuticos empregados na formulao; Realizar estudos de estabilidade preliminar da formulao farmacutica fitoterpica; Analisar o comportamento reolgico do gel fitoterpico;

51

4.MATERIAL E MTODOS

Material e Mtodos 52

4 Material e Mtodos

4.1 Material 4.1.1 Matria-prima vegetal Material Vegetal: Heliotropium indicum L. Famlia: Boraginaceae Parte Utilizada: Folhas

4.1.2 Reagentes, solues e substncias utilizadas Reativo de Pascov, reativo de Fehling A, reativo de Fehling B, HCl P.A, H2SO4 P.A, lugol, soluo aquosa de ninhidrina a 1%, soluo alcolica de FeCl3 a 1%, metanol P.A, raspas de magnsio, soluo de HCl a 5%, reativo de Bouchardat, reativo de Dragendorff, reativo de Mayer, soluo de HCl 6N, H2O2 concentrado a 30%, soluo de NH4OH 6N, reativo de Kedde, soluo aquosa de vanilina a 1%, soluo alcolica de cloridrato de hidroxilamina a 10%, soluo metanlica de KOH a 10%, soluo de HCl a 1 N, clorofrmio P.A, anidrido actico P.A, reativo para azuleno, ter de petrleo, cido trifluoractico, ter etlico, soluo de NaOH a 1N, tolueno, soluo de NH4OH a 10%, soluo tampo fosfato pH 4,0 e pH 7,0, Sulfato de sdio anidro, DMSO, acetonitrila P.A., soluo HCl a 5%, hidroxietilcelulose - Natrozol 250 HHRP, propilenoglicol PA-ACS Qumica especializada Erich LDTA, metilparabeno mapric.

4.1.3 Equipamentos Estufa de circulao forada de ar - Quimis Aparelhos cientficos LTDA, modelo Q-314M222; moinho de facas tipo Willy; balana analtica Gehaka BH500; mufla; agitador eletromagntico para peneiras Bertel Indstria Metalrgica LTDA; evaporador rotativo de baixa presso Fisatrom, modelo 802; analisador trmico DTG-60, Shimadzu, analisador trmico DSC-60, Shimadzu, espectrofmetro de infravermelho potnciometro Thermo PHTEK Electron modelo Corporation PHs-EB; modelo IR100 espectrometer; Savant liofilizador Thermo

Material e Mtodos 53

MicroModulyo/115 com bomba a vcuo acoplada LP200-Thermo Savant, cromatgrafo lquido de alta eficincia Merck Hitachi LaChrom D-7000 com detector no ultravioleta e com arranjo de diodos, remetro marca Rheotet, modelo 2 (tipo cilindro).

4.1.4 Cepas de micro-organismos utilizados: Foram utilizadas as cepas de micro-organismos: Staphylococcus aureus ATCC 29913; Escherichia coli ATCC 25922; Pseudomonas aeruginosa ATCC 25853; Candida albicans ATCC 40175. As cepas de microorganismos foram provenientes do Instituto Oswaldo Cruz RJ.

4.2 Mtodos As anlises foram realizadas nos laboratrios de Processamento de Material Vegetal, Fitoqumica, Microbiologia, Controle de Qualidade Fsico-Qumico e Farmacotcnica da Faculdade de Farmcia do Instituto de Cincias da Sade, e no Laboratrio de Pesquisa e Anlise de Combustvel, Laboratrio de QumicaPesquisa do Instituto de Cincias Exatas e Naturais da Universidade Federal do Par.

4.2.1 Obteno e identificao botnica do material vegetal O material vegetal foi adquirido junto Associao Ver-as-Ervas (Feira do Ver-o-Peso), Belm PA, Brasil. O material foi coletado no ms de maio de 2008, s 18 horas, procedente do municpio de So Miguel do Guam, localizado no estado do Par a 150 km da capital Belm, com latitude de 0137'36" sul e longitude de 4729'00" oeste (IBGE, 2008). Houve o cuidado em separar uma amostra das partes areas do vegetal (com folhas, flores e vagens) e posteriormente a secagem, foi confeccionada a exsicata deste material (BARBOSA et al, 2001). A exsicata (Figura 3) foi submetida identificao botnica, confirmando, assim, a espcie de estudo: Heliotropium indicum (L.) DC, pertencente famlia Boraginaceae, com nmero de registro no herbrio do Museu

Material e Mtodos 54

Paraense Emlio Goeldi: MG 145574. A identificao botnica foi realizada pela Coordenao de Botnica do Museu Paraense Emlio Goeldi, sob cuidados tcnicos do Prof. Dr. Mrio Augusto Gonalves Jardim.

Figura 3. Exsicata da espcie H. indicum L. (Boraginaceae) MG 145574.


Fonte: Arquivo Pessoal

4.2.2 Processamento do material vegetal A planta fresca foi higienizada mediante lavagem em gua potvel e corrente para remoo de terra, insetos e outras impurezas. O material vegetal foi imerso em uma soluo alcolica a 70% v/v, com a finalidade de remover microorganismos presentes e interromper o metabolismo do vegetal, evitando a alterao dos compostos qumicos originalmente presentes. Posteriormente o

Material e Mtodos 55

material vegetal foi selecionado, separando-se as folhas, vagens (contendo as sementes), pecolo e raiz. A parte do vegetal utilizada neste estudo foi: folhas jovens e maduras de H. indicum L. As folhas foram secas em temperatura ambiente (por 48 horas) sobre bancadas do laboratrio de processamento de material vegetal da Faculdade de Farmcia (UFPA), as quais se encontravam previamente limpas, sanitizadas e revestidas com papel absorvente. A secagem das folhas foi realizada em estufa de circulao forada de ar mantida a temperatura de 40 durante quatro dias, tendo C, a massa de uma amostra das folhas rigorosamente monitorada at peso constante. Aps a retirada das folhas j secas (droga vegetal) da estufa, estas foram pulverizadas em um moinho de facas a fim de reduzir o material vegetal a fragmentos de pequenas dimenses.

4.2.3 Caracterizao fsica e fsico-qumica das folhas de H. indicum L. 4.2.3.1 Determinao da distribuio granulomtrica do p. O procedimento foi desenvolvido usando um agitador de tamises eletromagntico que produziu movimentos horizontais e verticais e utilizando-se tamises padronizados superpostos, partindo-se de maior ao menor dimetro. Exatamente 10g da droga seca e pulverizada foram submetidos srie de tamises com abertura de malha de 1700 m, 710 m, 355 m, 250 m, 180 m, 125 m; durante 30 minutos. O tamanho das partculas foi avaliado pela quantificao percentual de reteno de p de H. indicum L. em cada tamis (FARMACOPIA BRASILEIRA IV, 1988).

Material e Mtodos 56

4.2.3.2 Determinao de perda por dessecao do p. Exatamente 3 g da droga seca e pulverizada foram transferidas para pesafiltro. A amostra foi submetida a aquecimento em estufa a 105C durante 2 horas, seguida de resfriamento em dessecador e pesagem. Repetiu-se a operao at obteno de peso constante. Os resultados de trs determinaes foram avaliados em termos de porcentagem ponderal sobre a quantidade da amostra, utilizando a seguinte equao: (FARMACOPIA BRASILEIRA IV, 1988). % perda = Pu Ps/Pa x 100 Onde: Pa = peso da amostra (g) Pu = peso do pesa-filtro contendo a amostra antes da dessecao (g) Ps = peso do pesa-filtro contendo a amostra aps a dessecao(g)

4.2.3.3 Determinao do teor de cinzas totais do p. Exatamente 3 g da droga foram transferidos para cadinho de porcelana, previamente calcinados, resfriados e pesados. As amostras nos cadinhos foram aquecidas gradualmente at atingir 450 ento carbonizadas em chama direta e C, incineradas. Aps resfriamento em dessecador sob vcuo, as amostras foram pesadas em balana analtica, repetindo-se o procedimento at a obteno de peso constante. A porcentagem de cinzas foi calculada em relao droga seca (FARMACOPIA BRASILEIRA IV, 1988).

4.2.3.4 Obteno do perfil trmico por termogravimetria (TG, DTA, DSC) do p. As anlises termogravimtricas do p de H. indicum L. foram realizadas por TG, DTA e DSC. Tais anlises foram obtidas nas seguintes condies: utilizou-se uma massa de aproximadamente 8 mg de cada amostra e as transferiu para um cadinho de platina, logo aps, foram submetidas a uma faixa de temperatura entre

Material e Mtodos 57

25 a 600 C, sob atmosfera dinmica de nitrognio (25,00 mL/min) e razo de C aquecimento de 5 C/min. Os clculos de perda de massa foram realizados com auxlio do programa TA-60W da Shimadzu (SILVA JUNIOR, 2006; ALVES, 2008; NUNES, 2009). A determinao da curva DSC do p foi analisada na faixa de temperatura de 25 at 300 Para todos os outros parmetros seguiram-se os mesmos C C. critrios adotados para TG e DTA.

4.2.3.5 Obteno do perfil espectroscpico na regio do IV do p. Na anlise por espectroscopia na regio do IV as leituras foram realizadas na faixa de absoro de nmero de onda de 4000 cm-1 a 500 cm-1, com quantidade apropriada da amostra comprimida em cristal de seleneto de zinco (SILVA JUNIOR, 2006; ALVES, 2008; NUNES, 2009).

4.2.4 Obteno e caracterizao qumica e fsico-qumica da soluo extrativa de H. indicum L.: 4.2.4.1 Obteno da tintura a partir das folhas de H. indicum L. A extrao de ativos da espcie vegetal em questo foi realizada de acordo com o mtodo preconizado pela FARMACOPIA BRASILEIRA II (1959), seguindo o processo geral M para a obteno de tintura a partir do processo extrativo macerao. A tintura fitoterpica foi preparada por macerao (protegido da luz e sob temperatura ambiente), em soluo hidroalcolica a 70 GL, por 10 dias, com teor de 20% da droga (p/v).

4.2.4.2 Determinao do pH da tintura. A determinao do pH de H. indicum L. foi realizada em potencimetro previamente calibrado com solues tampo pH 4,0 e 7,0 e os resultados

Material e Mtodos 58

corresponderam mdia de trs determinaes independentes (FARMACOPIA BRASILEIRA IV, 1988).

4.2.4.3 Determinao da densidade aparente da tintura. A anlise da densidade aparente da tintura seguiu o mtodo do picnmetro. Um picnmetro com capacidade para 5 mL, previamente tarado, foi preenchido com o lquido padro (gua recm destilada e fervida) e pesado. Em seguida o picnmetro foi rinsado com a amostra e pesado. A relao entre o peso da amostra e do lquido padro, em um volume fixo, forneceu o valor da densidade aparente da tintura mdia de trs determinaes independentes (FARMACOPIA BRASILEIRA IV, 1988).

4.2.4.4 Determinao do resduo seco da tintura. Exatamente 1 mL da tintura foi pipetado e transferido para cpsulas de porcelana previamente taradas nas mesmas condies empregadas durante a anlise propriamente dita. As cpsulas foram colocadas em banho maria, no excedendo a temperatura de 40 at secura e, em seguida, levadas estufa a C, 110 C, at peso constante. Aps resfriarem em dessecador, as cpsulas foram pesadas, tendo a mdia de trs determinaes de resduo seco calculado (MACIEL et al, 2006).

4.2.5 Abordagem Fitoqumica da tintura. 4.2.5.1 Obteno do extrato bruto a partir da tintura. Um volume da tintura foi concentrado em evaporador rotativo a baixa presso, para remoo do solvente orgnico (soluo hidroalcolica a 70 GL) tendo o cuidado para que a temperatura de aquecimento no excedesse 40 C. Aps a evaporao do solvente o extrato foi levado estufa a 40 at total C,

Material e Mtodos 59

evaporao do resduo de solvente e para obteno do extrato bruto de H. indicum L.

4.2.5.2 Prospeco qumica do extrato bruto: A prospeco qumica do extrato bruto foi realizada com a finalidade de identificar a presena de classes de metablitos secundrios na espcie em estudo. Dessa forma, realizaram-se testes para: saponinas, cidos orgnicos, acares redutores, polisssacardeos, fenis e taninos, protenas e aminociodos, flavonides outras gerais, glicosdeos cardacos, catequinas, derivados de benzoquinonas, naftoquionas, fenantroquinonas, lactonas sesquiterpnicas e lactonas, alcalides, purinas, esterides, triterpenides, azulenos, carotenides, depsdios, depsidonas, derivados da cumarina e antraquinonas. Os testes foram realizados em triplicata e seguiram as condies estabelecidas no Manual para Anlise Fitoqumica e Cromatogrfia de Extratos Vegetais (BARBOSA et al, 2001). O procedimento experimental segue descrito:

a. Testes que utilizam como solvente gua destilada Foi preparada uma soluo-me com extrato bruto de H. indicum L. para realizar os testes que utilizam gua destilada como solvente. Para isso, foram pesados 140 mg de EB e dissolvidos em 28 mL de gua destilada. Em seguida esta soluo foi levada ao banho de ultrassom a fim de dissolver todo soluto. Posteriormente, a soluo foi filtrada em papel de filtro Whatman qualitativo, reservando o filtrado e obtendo-se a soluo-me. Saponinas espumdicas: Foram transferidos 5 mL da soluo-me para tubo de ensaio (triplicata), sendo diluda em 15 mL. Em seguida, a soluo foi agitada vigorosamente por 2 minutos em tubo fechado. Se a camada de espuma permanece estvel por mais de meia hora, o resultado considerado positivo. cidos orgnicos:

Material e Mtodos 60

Foram transferidos 2 mL da soluo-me j filtrada para uma placa escavada. soluo foi adicionada gotas do reativo de Pascov. Se houver descolorao do reativo, a reao positiva. Acares redutores: Foram transferidos 5 mL da soluo-me para tubo de ensaio. Em seguida, foram adicionados 2 mL do reativo de Fehling A e 2 mL do reativo de Fehling B e levados ao aquecimento em banho maria at ebulio por 5 minutos. O aparecimento de um precipitado vermelho tijolo, indica presena de acares redutores. Polissacardeos: Foram transferidos 5 mL da soluo-me para tubo de ensaio, adicionado de 2 gotas de lugol. O aparecimento de colorao azul indica resultado positivo. Fenis e taninos: Foram transferidos 5 mL da soluo-me para tubo de ensaio, adicionado de 2 gotas de soluo alcolica de FeCl3 a 1%. Qualquer mudana na colorao ou formao de precipitado indica reao positiva, quando comparado com o teste em branco (solvente+reativo). Uma colorao inicial entre o azul e o vermelho indicativa da presena de fenis. Precipitado escuro de tonalidade azul indica presena de taninos piroglicos, e verde, presena de taninos catquicos. Protenas e aminocidos: Foram transferidos 5 mL da soluo-me para tubo de ensaio, adicionado de 0,5 mL de soluo aquosa de nihidrina a 1% e aquecido em banho maria at ebulio. O aparecimento de colorao violeta persistente indica reao positiva.

b. Testes que utilizam como solvente metanol Foi preparada uma soluo-me com extrato bruto de H. indicum L. para realizar os testes que utilizam metanol como solvente. Para isso, foram pesados 120 mg de EB e dissolvidos em 24 mL de metanol. Em seguida esta soluo foi

Material e Mtodos 61

levada ao banho de ultrassom a fim de dissolver todo soluto. Posteriormente, a soluo foi filtrada em papel de filtro Whatman qualitativo, reservando o filtrado e obtendo-se a soluo-me. Flavonides: Foram transferidos 10 mL da soluo-me para tubo de ensaio (triplicata), em seguida foram adicionadas 5 gotas de HCl concentrado e raspas de magnsio. O surgimento de uma colorao rsea indica reao positiva. Glicosdeos cardacos: Foram transferidos 5 mL da soluo-me para tubo de ensaio. Esta foi separada em duas pores de 2 mL cada e adicionada gotas do reativo de Kedde. O aparecimento de colorao azul ou violeta indica reao positiva. Catequinas: Foram transferidos 3 mL da soluo-me para tubo de ensaio, adicionado 1 mL de soluo aquosa de vanilina a 1% e 1 mL de HCl concentrado. O surgimento de colorao vermelha intensa indica reao positiva. Derivados de benzoquinonas, naftoquinonas e fenantraquinonas: Foram transferidos 3 mL da soluo-me para tubo de ensaio, adicionado 2 gotas de Na2CO3 a 25%, 2 gotas de formaldeido a 4% e 2 gotas de odinitrobenzeno a 5%. Em seguida, a soluo foi aquecida em banho maria. O aparecimento de uma colorao violeta indica reao positiva. Sesquiterpenolactonas e outras lactonas: Foram transferidos 3 mL da soluo-me para tubo de ensaio, adicionado 12 gotas de soluo alcolica de cloridrato de hidroxilamina a 10% e 2 gotas de soluo metanlica de KOH a 10%. A soluo foi aquecida em banho maria durante 2 minutos. Em seguida, resfriada e acidulada com soluo de HCl a 1N, por fim foi adicionado 1 gotas de FeCl3 1%. O surgimento de uma colorao violeta indica reao positiva.

Material e Mtodos 62

c. Testes que utilizam como solvente clorofrmio Foi preparada uma soluo-me com extrato bruto de H. indicum L. para realizar os testes que utilizam clorofrmio como solvente. Para isso, foram pesados 75 mg de EB e dissolvidos em 15 mL de clorofrmio. Em seguida esta soluo foi levada ao banho de ultrassom a fim de dissolver todo soluto. Posteriormente, a soluo foi filtrada em papel de filtro Whatman qualitativo, reservando o filtrado e obtendo-se a soluo-me. Esterides e triterpenides: 10 ml da soluo-me foram filtrados sobre carvo ativado (triplicata). O filtrado foi transferido para um tubo de ensaio completamente seco, adicionado 1 mL de anidrido actico e agitado suavemente. Em seguida, foram adicionadas 3 gotas de H2SO4 concentrado e novamente agitado. O rpido desenvolvimento de cores que vo do azul evanescente ao verde persistente indicam resultado positivo. Azulenos: 2 mL da soluo-me foram transferidos para tubo de ensaio. Esta foi concentrada at 0,5 mL em banho maria e adicionada 2,5mL da soluo de reativo de azuleno. Em seguida, a soluo foi aquecida em banho maria durante 5 minutos. Aps resfriar, o contedo do tubo de ensaio foi transferiu para um funil de decantao e adicionado 10 mL de ter de petrleo. Este foi agitado e quando as duas fases estavam distintas, a fase aquosa foi observada. Quando h presena de proazulenos, a fase aquosa adquire colorao azul, porm, quando estes esto em pequena quantidade, a colorao observada esverdeada. Carotenides: 3 ml da soluo-me foram transferidas para tubo de ensaio, no qual foram adicionadas gotas de cido trifluoractico. O desenvolvimento de colorao azul indica reao positiva. d. Testes que utilizam como solvente ter etlico Foi preparada uma soluo-me com extrato bruto de H. indicum L. para realizar os testes que utilizam ter etlico como solvente. Para isso, foram pesados

Material e Mtodos 63

50 mg de EB e dissolvidos em 10 mL de ter etlico. Em seguida esta soluo foi levada ao banho de ultra-som a fim de dissolver todo soluto. Posteriormente, a soluo foi filtrada em papel de filtro Whatman qualitativo, reservando o filtrado e obtendo-se a soluo-me. Depsdios e depsidonas: 5 mL da soluo-me foram transferidos para um tubo de ensaio (triplicata) e evaporado em banho maria. Posteriormente, 3 mL de metanol foram adicionados ao resduo e agitado. Aps agitao, foram adicionadas 3 gotas da soluo de FeCl3 1%. O aparecimento de colorao verde, azul ou cinza indica reao positiva. Derivados da cumarina: 5 mL da soluo-me foram transferidas para um tubo de ensaio (triplicata), o solvente foi concentrado em banho maria at 0,5 mL. Em seguida, foi aplicada em um papel de filtro gotas da soluo etrea, de modo que se formou duas manchas de aproximadamente 1 cm de dimetro cada. A uma destas manchas foi adicionada 1 gota de soluo de NaOH 1N e a metade dela foi coberta com papel escuro, expondo a outra metade luz ultravioleta. Para leitura do resultado as manchas foram descobertas e comparadas. O aparecimento de fluorescncia azul na parte exposta da mancha indica reao positiva.

e. Outros testes realizados: Alcalides: 25 mg do extrato bruto de H. indicum L. foram dissolvidos em 5 mL de soluo de HCl 5% e filtrados. Foram separadas quatro pores de 1 mL em cada cavidade de uma placa escavada e 1 mL do branco e adicionado em cada cavidade gotas dos reativos de Bouchard, Dragendorff, Mayer e Bertrand. Precipitao ou turvao em pelo menos uma cavidade indicativa de resultado positivo. Purinas:

Material e Mtodos 64

5 mg do extrato bruto, 3 gotas de soluo de HCl 6N e 2 gotas de H2O2 a 30% foram reunidas em uma cpsula de porcelana e levadas ao banho maria at formao de um resduo corado de vermelho. Posteriormente, 3 gotas de soluo de NH4OH 6N foram adicionadas a cpsula de porcelana. O surgimento de colorao violeta indica reao positiva.

4.2.5.3 Obteno da frao alcalodica (FA). A frao alcalodica foi obtida por partio lquido-lquido em meio cido e bsico, representado esquematicamente na figura 4. A partio consistiu no tratamento de 2,61 g do extrato bruto com 50 mL de HCl 5%. Em seguida, a soluo cida foi filtrada em papel de filtro qualitativo - Whatman. O filtrado cido obtido foi transferido para funil de decantao e tratado com alquotas n-hexano (5 x 10 mL), recolhendo a frao hexnica cida. Aps a obteno da frao hexnica, a soluo aquosa foi transferida para um erlenmeyer e alcalinizada com NH4OH concentrado at pH 10. A soluo aquosa alcalina foi transferida para um funil de decantao para extrao dos alcalides, para isso foram utilizadas alquotas de clorofrmio (5 x 10 mL). A extrao dos alcalides foi monitorada atravs de spots tests sobre cromatoplaca e aspergida com reagente de Dragendroff. (SHARAPIN, 2000). frao clorofrmica total obtida foi reunida, transferida para funil de decantao e lavada com gua destilada, at neutralizao do clorofrmio. A frao clorofrmica neutra obtida foi filtrada utilizando sulfato de sdio anidro para remoo de gua residual. Em seguida, a frao alcalodica foi evaporada em evaporador rotativo sob baixa presso (no excedendo 35 e transferida para C) um frasco previamente pesado. O solvente residual foi evaporado temperatura ambiente e protegido da luz, obtendo a frao alcalodica.

Material e Mtodos 65

Figura 4. Esquema da partio lquido-lquido cido e bsico para obteno da frao hexnica (FH) e da frao alcalodica (FA).

4.2.5.4 Determinao do perfil cromatogrfico da frao alcalodica (FA) e da frao hexnica (FH) por cromatografia em camada delgada (CCD). As fraes FA e FH resultante da partio cido e bsico foram aplicadas na forma de barras sobre placas cromatogrficas de 5x10 cm utilizando como fase

Material e Mtodos 66

estacionria gel de slica Merck e fase mvel CHCl3/CH3OH na proporo de 90:10 em cuba cromatogrfica com atmosfera de NH4OH. Aps eluio dos solventes de polaridade crescente e separao das substncias, os cromatogramas foram observados sob luz visvel, luz ultravioleta (254 nm e 365 nm) e por fim revelados com reagente de Dragendorff. (soluo de BiONO3 e KI em cido actico diludo) e HCl 5% (WAGNER e BLADT, 2001). O resultado considerado positivo quando a reao leva ao aparecimento de uma mancha com colorao vermelho alaranjado. O Rf deu-se pela razo das distncias percorridas pela mancha e pelo eluente na cromatoplaca.

4.2.5.5 Determinao do perfil cromatogrfico por CLAE. Para a anlise da frao alcalodica e hexnica (3 mg/mL) na tintura de H. indicum L (20 mg/mL) empregou-se uma coluna Agilent LiChrospher 100, RP8 (5 mm e 250 x 3,0 mm) mantida a temperatura de 26 A fase mvel foi constituda C. de acetonitrila e metanol, em gradiente linear de 80% de acetonitrila e 20% de metanol, terminando com 99% de acetonitrila e 1% de metanol, com fluxo de 0,75 mL/min durante 18 min. O volume da amostra carregada foi de 50 L sendo 20 L injetados pelo sistema de injeo Rheodyne. A anlise foi realizada na faixa de absorbncia de 200 a 350 nm. 4.2.6 Obteno do extrato liofilizado a partir da tintura. O extrato liofilizado de H. indicum L. foi obtido aps a evaporao do solvente etanol em evaporador rotativo sob baixa presso e o extrato aquoso resultante foi resfriado a -70 e liofilizado. C

4.2.6.1 Obteno do perfil trmico por termogravimetria (TG, DTA e DSC) do extrato liofilizado. As anlises termogravimtricas do extrato liofilizado foram realizadas por TG, DTA e DSC. Tais anlises foram obtidas nas seguintes condies: utilizou-se uma massa de aproximadamente 8 mg de cada amostra e as transferiu para um

Material e Mtodos 67

cadinho de platina, logo aps, foram submetidas a uma faixa de temperatura entre 25 a 600 C, sob atmosfera dinmica de nitrognio (25,00 mL/min) e razo de C aquecimento de 5 C/min. Os clculos de perda de massa foram realizados com auxlio do programa TA-60W da Shimadzu (SILVA JUNIOR, 2006, ALVES, 2008, NUNES, 2009). A determinao da curva DSC do extrato foi analisado na faixa de temperatura de 25 at 300 Para todos os outros parmetros seguiram-se os C C. mesmos critrios adotados para TG.

4.2.6.2

Obteno do perfil espectroscpico na regio do IV do extrato

liofilizado.

O extrato liofilizado foi submetido anlise por espectroscopia de absoro na regio do IV. As leituras foram realizadas na faixa de absoro de nmero de onda de 4000 cm-1 a 500 cm-1, com quantidade apropriada da amostra comprimida em cristal de seleneto de zinco (SILVA JUNIOR, 2006, ALVES, 2008, NUNES, 2009).

4.2.7 Ensaio biolgico do extrato hidroalcolico de H. indicum L. 4.2.7.1 Micro-organismos testados: Os micro-organismos testados foram cepas padro ATCC (American Type Culture Colection) recomendadas para testes de suscetibilidade aos antimicrobianos (CLSI, 2003). Em resumo, os micro-organismos testados apresentam as seguintes caractersticas: Staphylococcus aureus (ATCC 29913): Cocos gram-positivos, amplamente encontrados na natureza, compem a microbiota normal da pele. Alguns so causadores de infeces de carter oportunistas no homem e nos animais. So responsveis por inmeras e variadas infeces e sndromes em humanos e com

Material e Mtodos 68

resistncia a vrias classes de antimicrobianos (TORTORA et al, 2003; LEVINSON e JAWETZ, 2005). Escherichia coli (ATCC 25922): Bacilos gram-negativos. Constituem a microbiota intestinal, tornando-se patognico em localizaes extra-intestinal ou mesmo intestinal. So agentes de infeco gastrointestinal e os principais responsveis por infeces urinrias em mulheres. Apresentam facilidade na aquisio e transferncia de plasmdeos de resistncia a antimicrobianos (TORTORA et al, 2003; LEVINSON e JAWETZ, 2005). Pseudomonas aeruginosas (ATCC 25853): Bacilos gram-negativos no

fermentadores. Podem ser encontrados na pele, fezes e garganta de indivduos normais. Este microorganismo causa infeces tipicamente oportunistas do tipo nosocomial e resistente a uma grande variedade de antimicrobianos (TORTORA et al, 2003; LEVINSON e JAWETZ, 2005). Candida albicans (ATCC 40175): Fungo leveduriforme. comensal no trato gastrointestinal e geniturinrio, porm o principal agente de infeces fngicas oportunistas, principalmente no trato vaginal e oral (TORTORA et al, 2003; LEVINSON e JAWETZ, 2005).

4.2.7.2 Avaliao da atividade antimicrobiana do extrato bruto.

Para a avaliao preliminar da atividade antimicrobiana do extrato bruto de H. indicum L., empregou-se o mtodo de disco-difuso em meio slido (BAUER et al, 1966, NCCLS, 2003a; KARTAL et al, 2003;SANTOS et al, 2007). Esta tcnica consiste na preparao dos inculos dos microorganismos a serem testados, tomando-se 3 a 4 colnias isoladas e diludas em soluo salina a 0,85% at atingir a turbidez correspondente ao tubo 0,5 da escala de Mac Farland [0,5 mL de cloreto de brio a 1,75% (p/v) + 99,5 mL de soluo de cido sulfrico a 1% (vv)] correspondendo a aproximadamente 1 a 2 x 108 UFC/mL de E. coli (BAUER et al, 1966; CLSI, 2003; KARTAL et al, 2003).

Material e Mtodos 69

Para a inoculao das placas de teste utilizou-se um swab de algodo estril o qual foi imerso na suspenso ajustada, at 15 minutos aps ajustar a turbidez da suspenso do inculo. A superfcie da placa contendo gar Meller-Hinton foi inoculada atravs da tcnica da semeadura do swab em toda a superfcie estril do meio. Repetiu-se o procedimento semeando outras duas vezes, girando a placa aproximadamente 90 cada vez, a fim de assegurar a distribuio uniforme do inculo. Como passo final, passou-se o swab na margem da placa de gar. Posteriormente procedeu-se a aplicao dos discos nas placas, realizado por um conjunto predeterminado de discos de papel de filtro padronizados e estreis (Whatman - tipo n 3) com 6,0 mm de dimetro. Em cada disco de papel foram impregnados 10 L do extrato dissolvido em DMSO, nas concentraes de 500, 250, 125 e 62,5 mgmL. Os discos contendo o extrato em diferentes concentraes foram aplicados na superfcie da placa semeada, de maneira a assegurar contato completo com a superfcie do meio de cultura. As placas, contendo o inculo semeado e os discos controle (10 L de DMSO) e teste (10 L do extrato dissolvido em DMSO), foram armazenados em estufa a 35,5 1 C, C durante 24 horas. Aps a incubao das placas, procedeu-se a leitura dos resultados para a verificao e aferio da possvel formao de halos de inibio, em milmetros, ao redor dos discos contendo o extrato. O resultado final representa a mdia de duas determinaes e foi considerado como suscetvel halo igual ou superior a 8,0 mm de dimetro (PAREKH e CHANDA, 2007; SANTOS et al, 2007).

4.2.8 Estudos da formulao contendo a tintura padronizada de H. indicum L. 4.2.8.1 Obteno da formulao. Foi empregada uma base galnica de caracterstica hidroflica empregandose como polmero o hidroxietilcelulose (Natrozol 250) comumente empregado na farmacotcnica de formas farmacuticas semi-slidas, na qual foi incorporada a tintura de H. indicum L. na concentrao de 10%. Para o preparo da base, foram pesados cada componente da formulao separadamente (Quadro 1) O conservante metilparabeno foi diludo em gua e

Material e Mtodos 70

essa mistura foi levada a uma placa aquecedora sob temperatura de 55,0 C 2,0 C. Em seguida, acrescentou-se o polmero hidroxietilcelulose umedecido em propilenoglicol, agitando-se continuamente com basto de vidro at completa disperso desses componentes. Obtida a completa disperso dos componentes da formulao, a mistura foi retirada do aquecimento e deixada em repouso temperatura ambiente por 24 horas. Aps esse perodo a tintura foi incorporada base (NUNES, 2009). Todos os componentes empregados na formulao seguem descritos no quadro abaixo.

Quadro 1. Componentes da formulao fitoterpica semi-slida e suas respectivas concentraes.

Componentes da Formulao Tintura de Heliotropium indicum L. Hidroxietilcelulose (Natrosol250) Propilenoglicol Metilparabeno gua destilada q.s.p.

Concentrao (%) 10 1,5 5 0,2 100

4.2.8.2 Caracterizao fsico-qumica da mistura fsica do extrato liofilizado x adjuvantes farmacuticos empregados na formulao por Termogravimetria (TG), Anlise Trmica Diferencial (DTA), Calorimetria Exploratria Diferencial (DSC) e espectrometria na regio do infravermelho (IV).

4.2.8.2.1 Preparo das amostras. As misturas binrias foram preparadas por misturas fsicas do extrato liofilizado de H. indicum L com os excipientes da formulao nas seguintes concentraes:

Material e Mtodos 71

Extrato liofilizado/hidroxietilcelulose. (1:1 p/p) Extrato liofilizado/propilenoglicol /. (1:2 p/p) Extrato liofilizado/metilparabeno /. (1:1 p/p)

4.2.8.2.2 Termogravimetria (TG e DTA) dos excipientes da formulao e de suas misturas binrias com o extrato liofilizado.

Para obteno das curvas termogravimtricas (TG e DTA) dos excipientes e de suas misturas binrias com o extrato liofilizado, utilizou-se uma massa de aproximadamente 8 mg de cada amostra e as transferiu para um cadinho de platina, logo aps, foram submetidas a uma faixa de temperatura entre 25 a 600 C C, sob atmosfera dinmica de nitrognio (25,00 mL/min) e razo de aquecimento de 5C/min. Os clculos de perda de massa foram realizados com auxlio do programa TA-60W da Shimadzu (SILVA JUNIOR, 2006; ALVES 2008, NUNES, 2009).

4.2.8.2.3 Anlise da Calorimetria Exploratria Diferencial (DSC).

Para obteno das curvas DSC dos excipientes e de suas misturas binrias com o extrato liofilizado, utilizou-se uma massa de aproximadamente 8 mg de cada amostra e as transferiu para um cadinho de platina. Em seguida, foram submetidas a uma faixa de temperatura entre 25 at 300 C, sob atmosfera dinmica de C nitrognio (25,00 mL/min) e razo de aquecimento de 5C/min. Os clculos da diferena de temperatura ( H) foram realizados com auxlio do programa TA-60W da Shimadzu (SILVA JUNIOR, 2006; NUNES, 2009).

Material e Mtodos 72

4.2.8.2.4 Anlise espectrofotomtrica na regio do infravermelho dos excipientes da formulao e de suas misturas binrias com o extrato liofilizado.

As amostras dos excipientes da formulao e das misturas binrias do extrato liofilizado com seus excipientes foram submetidas anlise por espectroscopia de absoro na regio do infravermelho. As leituras foram realizadas na faixa de absoro de nmero de onda de 4000 cm-1 a 500 cm-1, com quantidades apropriadas das amostras comprimidas em cristal de seleneto de zinco (SILVA JUNIOR, 2006; ALVES 2008, NUNES, 2009).

4.2.9 Avaliao preliminar da estabilidade da formulao. 4.2.9.1 Teste de centrifugao.

Foram pesados 5,0 g do gel em tubos de centrfuga. O teste da centrifugao foi realizado em duplicata, nas seguintes condies experimentais: temperatura ambiente (25 C 2,0 C); velocidade de rotao de 3.000 rpm e tempo de teste de 30 minutos (BRASIL, 2004).

4.2.9.2 Teste do estresse trmico.

Foram utilizadas rplicas de 12 amostras do gel de 5,0 g do mesmo lote, as quais foram acondicionadas em vidros neutros. Seis amostras foram submetidas ao aquecimento em estufa temperatura de 45 C 2,0 C em 6 ciclos avaliados no intervalo de 24 h, enquanto as outras seis amostras permaneceram temperatura ambiente (25 C 2 C), as quais foram utilizadas como controle, pois esperado as menores alteraes nessas condies (BRASIL, 2004). Logo aps o trmino de cada ciclo, as amostras foram avaliadas pelos seguintes parmetros: caractersticas organolpticas (enfatizando possveis alteraes na aparncia, cor e odor. A homogeneidade, brilho e ausncia de grumos e precipitados tambm foram analisados) e determinao do valor de pH. Os resultados obtidos nos tempos t1 a

Material e Mtodos 73

t6 do ciclo da estufa foram comparados aos resultados das amostras de referncias (amostras que permaneceram temperatura ambiente) (BRASIL, 2004).

4.2.9.3 Determinao do valor de pH. O pH das amostras (t0 a t6) foi determinado nas disperses das amostras em gua recm destilada e na proporo 1:10 em trs determinaes e temperatura ambiente (25 C 2 C). As leituras de cada amostra foram realizadas em trs determinaes.

4.2.9.4 Avaliao do perfil reolgico da formulao. Aps 48 h de sua preparao, a formulao obtida foi avaliada quanto ao comportamento reolgico em remetro marca Rheotet, modelo 2 (tipo cilindro), utilizando o dispositivo AIICS 1. As leituras mensuradas foram realizadas a velocidade crescente e decrescente para obteno das curvas ascendentes e descendentes. A partir dos dados experimentais, as curvas de escoamento foram avaliadas graficamente pela velocidade versus tenso de cisalhamento e pela viscosidade aparente versus velocidade de cisalhamento.

74

5. RESULTADOS

Resultados 75

5 Resultados 5.1 Estudos de pr-formulao formulao 5.1.1 Avaliao das caractersticas fsicas e fsico qumicas da droga vegetal fsico-qumicas vegetal. 5.1.1.1 Determinao da distribuio granulomtrica do p p. Pela avaliao granulomtrica do p das folhas de H. indicum L. foi possvel classificar a droga vegetal como p grosso, sendo estabelecido pela FARMACOPIA BRASILEIRA IV (1988) como aquele cujas partculas passam em sua totalidade pelo tamis como abertura nominal de malha de 1700 m, e no mximo, 40% pelo tamis com abertura nominal de malha de 355 m (Figura 5). com

60 Massa Retida (%) 40 20 0 1700 0,4 710 355 20,81 12,59 9,22 4,26 5,35 250 180 125 Fundo 45,29

Abertura de malha do tamis (m)

Figura 5. Determinao da distribuio granulomtrica do p das folhas de H. indicum L.

Resultados 76

5.1.1.2 Determinao da perda por dessecao e do teor de cinzas totais do p de H. indicum L.


Tabela 1. Determinao da perda por dessecao e teor de cinzas totais do p das folhas de H. indicum L.

Testes Perda por dessecao Teor de cinzas totais


= n de amostras X = mdias dos resultados independentes DPR = desvio padro relativo

3 3

(%) DPR 12,88 0,046 17,14 0,726

5.1.1.3 Anlise do perfil trmico por TG do p. A curva termogravimtrica (TG) do p mostra que houve perda inicial de massa de 11,88% na faixa de temperatura de 25 a 110 Observou-se que da C C. temperatura de 240 at aproximadamente 330 houve perda de massa de C C 32,12% e de 390 at 600 houve uma perda de massa do material de 33,94%. C C Foi possvel verificar uma perda total de massa de 79,64% na faixa de temperatura analisada de 25 a 600 com resduo de 20,36% (Figura 6; Tabela 2). C C,

Figura 6. Curvas TG e DrTG do p das folhas de H. indicum L. obtida a 5C/min, sob atmosfera: N2, fluxo: 25,00 mL/min.

Resultados 77

Tabela 2. Perfil trmico (TG) do p das folhas de H. indicum L. com suas respectivas perdas de massa, em cada intervalo de temperatura ( C).

Amostra

25 110

240 330

Temperatura ( C) 390 570 Perda de Massa ( m) (%)

25 600

Resduo

P das folhas

11, 88

32,12

33,94

79,64

20,36

5.1.1.4 Anlise DSC do p. A curva DSC da droga vegetal mostra um evento endotrmico na faixa de temperatura de 29 a 140 com um consumo de energia de 369,43 Jg. O C C, processo de decomposio tem incio na temperatura de 250 C, sendo evidenciado por dois eventos exotrmicos consecutivos. O primeiro ocorre na faixa de temperatura de 275 a 365 ( H= 222,97 J/g) e o segundo de menor C C intensidade ocorre na faixa de temperatura de 558 a 594 ( H= 7,39 J/g) C C (Figura 7; Tabela 3).

Figura 7. Curva DSC do p das folhas de H. indicum L. obtida a 5 C/min, sob atmosfera: N2, fluxo: 25,00 mL/min.

Resultados 78

Tabela 3. Valores das entalpias apresentadas pela droga vegetal de H. indicum L. em diferentes temperaturas, analisadas por DSC. Temperatura ( C) 275-365 H (Jg) 222,97

Amostra
P das folhas

29-140
369,43

558-594
7,39

5.1.1.5 Perfil espectroscpico na regio do IV do p. A anlise espectromtrica na regio do IV do p das folhas de H. indicum L., teve a finalidade de obter informaes preliminares dos constituintes qumicos presentes na droga vegetal. As principais bandas de absoro em 3340 cm-1, 3270 cm-1, 3229 cm-1, 1599 cm-1, 1408 cm-1, 1010 cm-1 (Figura 8) correspondem aos grupamentos funcionais apresentados na tabela 8 (p.86).

Figura 8. Espectro na regio do IV do p das folhas de H. indicum L.

Resultados 79

5.1.2 Caracterizao fsico-qumica da tintura de H. indicum L. 5.1.2.1 Determinao do pH, densidade aparente e resduo seco da tintura. Os valores do pH, densidade aparente e resduo seco da tintura de H. indicum L. esto descritos na tabela 4.

Tabela 4. Determinao do pH, densidade aparente e resduo seco da tintura de H. indicum L.

Testes pH Densidade aparente Resduo Seco


= n de amostras X = mdias dos resultados DPR = desvio padro relativo

3 3 3

(%) DPR 7,81 0,006 0,8953 0,001 1,44 0,199

5.1.3 Abordagem Fitoqumica da tintura. 5.1.3.1 Prospeco qumica do extrato bruto. A determinao dos constituintes qumicos relevantes para identificao de drogas vegetais faz parte da avaliao da matria-prima empregada. O perfil qumico indicou a presena das seguintes classes qumicas na tintura: acares redutores, fenis e taninos, esterides e triterpenides, carotenides e indicativo de proazulenos. A reao de precipitao do extrato bruto com Dragendorff no foi observada, entretanto a frao alcalodica apresentou reao com Dragendorff indicado pela presena de um precipitado vermelho alaranjado, sugerindo a presena de alcalide na espcie (Tabela 5).

Resultados 80

Tabela 5. Prospeco qumica do extrato bruto de H. indicum L. Metablitos Secundrios


Saponinas Acares redutores Polissacardeos Fenis Taninos Catquicos Protenas e Aminocidos Flavonides Glicosdeos cardacos Catequinas Derivados de Benzoquinonas, Naftoquinonas e fenantraquinonas Lactonas sesquiterpnicas e outras lactonas Alcalides Purinas Esterides e triterpenides Azulenos Carotenides Depsdios e Depsidonas Antraquinonas + positivo - negativo I = indicativo

Resultado
+ + + - (EB) + (FA) I I (proazulenos) + -

Resultados 81

5.1.3.2 Determinao do perfil cromatogrfico da frao alcalodica (FA) e da frao hexnica (FH) obtido por cromatografia em camada delgada (CCD).

As figuras 9 e 10 mostram os cromatogramas das FA e FH com os fatores de reteno das substncias separadas pelo sistema eluente CHCl3/CH3OH na proporo de 90:10 em atmosfera de NH4OH. A mancha com fator de reteno de 0,84 foi observada em ambos cromatogramas da FA e da FH, sugerindo se tratar da mesma substncia.

Figura 9. Cromatograma da FA visualizado no UV a 254 nm ( esquerda) e revelado com Dragendorff e HCl 5% ( direita) obtido pelo sistema eluente CHCl3CH3OH (90:10), em atmosfera de NH4OH.

Figura 10. Cromatograma da FH visualizado no UV a 254 nm ( esquerda) revelado com Dragendorff e HCl 5% ( direita) obtido pelo sistema eluente CHCl3CH3OH (90:10), em atmosfera de NH4OH.

Resultados 82

5.1.3.3 Determinao do perfil do extrato bruto, da frao alcalodica e da frao hexnica de H. indicum L. por CLAE. A CLAE foi utilizada para gerar o perfil cromatogrfico do extrato bruto de H. indicum L. e suas fraes (frao alcalodica e hexnica). A figura 11 mostra que o cromatograma A referente ao extrato bruto apresenta um pico com Rt=1,60 min e 0,9607 de pureza. Este pico foi reproduzido na frao alcalodica e na frao hexnica ambos com Rt=1,73 min e pureza de 0,9621 e 0,9147, respectivamente (Figura 11B e 11C)

Figura 11. Perfil cromatogrfico por CLAE-UV/DAD a 250 nm do extrato bruto de H. indicum L. Cromatogramas: A- extrato bruto (1,60 min); Bfrao alcalodica (1,73 min), C- frao hexnica (1,73 min).

Resultados 83

Quando comparado os espectros na regio do ultravioleta referente ao extrato bruto e a frao alcalodica idntico aos picos com Rt=1,60 min e Rt=1,73 min respectivamente, observado uma semelhana entre esses dois espectros, apresentando correlao de 0,9657 (Figura 12).

Figura 12. Espectros no UV em 250 nm idntico ao pico com Rt=1,60 min (extrato) e Rt=1,73 min (frao alcalodica).

5.1.4 Caracterizao fsico-qumica do extrato liofilizado de H. indicum L. 5.1.4.1 Anlise do perfil trmico por TG do extrato liofilizado. A curva TG do extrato liofilizado a partir da tintura de H. indicum L. mostra que houve perda inicial de massa de 5,3% na faixa de temperatura de 25 a 110 C Na temperatura de 200 at aproximadamente 330 houve perda de massa C. C C acumulada de 29,08%; a partir de 390 at 600 ocorreu perda de massa C C acumulada do material de 14,85%. Foi possvel verificar uma perda total de massa de 65,00% na faixa de temperatura analisada de 25 a 600 (Figura 13; Tabela C C 6).

Resultados 84

Figura 13. Curvas TG e DrTG do extrato liofilizado de H. indicum L. obtida a 5 C/min, sob atmosfera: N2, fluxo: 25,00 mL/min.

Tabela 6. Perfil trmico (TG) do extrato liofilizado de H. indicum L. com suas respectivas perdas de massa, em cada intervalo de temperatura ( C).
Amostra 25 110 200-330 Temperatura ( C) 390-600 Perda de Massa ( m) (%) 25 600 Resduo

Extrato liofilizado

5,3

29,08

14,85

65,00

35,00

Resultados 85

5.1.4.2 Anlise DSC do extrato liofilizado.


A curva DSC do extrato liofilizado demonstra um evento endotrmico, na

faixa de temperatura de 80 a 160 com consumo de energia de 18,33 J/g. O C C, processo de decomposio tem incio na temperatura de 250 caracterizados por C eventos exotrmicos (Figura 14; Tabela 7).

Figura 14. Curva DSC do extrato liofilizado de H. indicum L. obtida a 5 C/min, sob atmosfera: N2, fluxo: 25,00 mL/min.

Tabela 7. Valores das entalpias apresentadas pelo extrato liofilizado de H. indicum L. em diferentes temperaturas, analisadas por DSC.
Amostra 80 - 160 250-350 Temperatura ( C) 400-450 H (Jg) Extrato liofilizado 18,33 179,69 99,22 25,71 531,70 520- 540 550-600

Resultados 86

5.1.4.3 Perfil espectroscpico na regio do IV do extrato liofilizado. Pela Figura 15 possvel verificar bandas de absoro de 3283 cm-1 caracterstica de grupamento funcional hidroxila fenlica, absoro em 2917 cm-1 e 2849 cm-1 caracterstico de C-H e 1573 cm-1caracterstico de carbonila (C=O) conjugadas.

Figura 15. Espectro na regio do IV do extrato liofilizado de H. indicum L.

Tabela 8. Faixa de absoro de ligaes das molculas no extrato de H. indicum L.


Faixa de absoro (cm-1) 3400-3200 2900-2820 1640-1540 1385-1380 1175- 1050 Tipo de ligao -OH C-H (aliftico) C=O CH2 C-O

Resultados 87

A figura 16 mostra um aumento na intensidade das bandas de absoro observadas no espectro na regio do IV do extrato liofilizado, quando comparado com o espectro na regio do IV da droga vegetal.

Figura 16. Espectros na regio do infravermelho da droga vegetal e do extrato liofilizado de H. indicum L.

5.2 Avaliao preliminar da atividade antimicrobiana do extrato bruto de H. indicum L. Os ensaios preliminares da atividade antimicrobiana in vitro do EB de H. indicum L. revelam uma inibio no crescimento das cepas gram-positivas (Figura 17; Tabela 9).

Resultados 88

Figura 17. Placa mostrando os halos de inibio do crescimento da cepa de S. aureus com discos contendo diferentes concentraes do EB de H. indicum L dissolvido em DMSO.

Tabela 9. Valores mdios dos halos de inibio (mm) obtidos pelo mtodo de difuso em disco utilizado na anlise do extrato bruto de H. indicum L. em diferentes concentraes.

Concentrao (mgmL) Cepas de microorganismos Staphylococcus aureus (ATCC 29913) Pseudomonas aeruginosas (ATCC 25853) Escherichia coli (ATCC 25922) Candida albicans (ATCC 40175) 500 + (12,5 0,707)
-

250 + (10,5 0,707)


-

125 -

62,5 -

+ positivo; (mdia do halo de inibio DPR) - negativo

Resultados 89

5.3 Estudo da formulao. 5.3.1 Determinao dos ensaios preliminares do extrato liofilizado de H. indicum L. com suas misturas binrias por termogravimetria (TG), anlise trmica diferencial (DTA) e calorimetria exploratria diferencial (DSC). As curvas TG, DTA e DSC do extrato liofilizado, hidroxietilcelulose (HEC) e suas misturas binrias (extrato/HEC 1:1 p/p) esto apresentadas nas Figuras 18, 19 e 20, respectivamente. Os resultados referentes aos seus percentuais de perda de massa e variao de temperatura esto descritos na Tabela 10 e Tabela 11, respectivamente.

Figura 18. Curvas TG correspondente ao extrato liofilizado de H. indicum L., mistura binria extrato/HEC (1:1 p/p) e HEC.

Resultados 90

Figura 19. Curvas DTA correspondente ao extrato liofilizado de H. indicum L., a mistura binria (extrato/HEC 1:1 p/p) e a HEC.

Tabela 10. Resultados termogravimtricos (TG) correspondente a perda de massa ( m) do extrato liofilizado de H. indicum L, da HEC e da mistura binria do extrato liofilizado e HEC (1:1 p/p).

Componentes da formulao Extrato liofilizado

Temperatura inicial ( C) 25 200 390 25 220 400 25 180 390

Temperatura final ( C) 110 330 600 110 370 595,76 110 370 600

Perda de massa ( m) (%) 5,3 29,08 14,85 7,71 64,09 4,89 6,6 49,53 13,83

HEC Extrato/HEC (1:1 p/p)

Resultados 91

Figura 20. Curvas DSC correspondente ao extrato liofilizado de H. indicum L., a mistura binria (extrato/HEC 1:1 p/p) e a HEC.

Tabela 11. Resultados termogravimtricos (DTA e DSC) correspondente a variao de energia ( H) do extrato liofilizado de H. indicum L., da HEC e da mistura binria do extrato liofilizado e HEC (1:1 p/p).

Componentes da formulao Extrato liofilizado

Temperatura inicial ( C) 80 220 550 25,92 80 25 210 530

Temperatura final ( C) 150 350 600 75,66 150 80 335 600

DTA H (J/g) 85,05 1023,90 761,61 239,8 111,71 1042,22 1204,22

DSC H (J/g) 18,33 93,13 82,55 -

HEC Extrato/HEC (1:1 p/p)

Resultados 92

As curvas TG, DTA e DSC do extrato liofilizado, metilparabeno e suas misturas binrias (extrato/metilparabeno 1:1 p/p) esto apresentadas nas Figuras 21, 22 e 23, respectivamente. Os resultados referentes aos seus percentuais de perda de massa e variao de temperatura esto descritos na Tabela 12 e 13.

Figura 21. Curvas TG correspondente ao extrato liofilizado, a mistura binria (extrato/metilparabeno 1:1 p/p) e metilparabeno.

Tabela 12. Resultados termogravimtricos (TG) correspondente a perda de massa ( m) do extrato liofilizado de H. indicum L., do metilparabeno e da mistura binria do extrato liofilizado e metilparabeno (1:1 p/p).

Componentes da formulao Extrato liofilizado

Temperatura inicial (C) 25 200 390 27 100 300,1 25 186 443

Temperatura final (C) 110 330 600 99 216 550,61 110 227 600

Perda de massa (%) 5,3 29,08 14,85 0,31 99,83 0,22 3,83 59,54 5,07

Metilparabeno

Extrato/Metilparabeno (1:1 p/p)

Resultados 93

Figura 22. Curvas DTA correspondente ao extrato liofilizado, a mistura binria (extrato/metilparabeno 1:1 p/p) e metilparabeno.

Figura 23. Curvas DSC correspondente ao extrato liofilizado, a mistura binria (extrato/metilparabeno 1:1 p/p) e metilparabeno.

Resultados 94

Tabela 13. Resultados termogravimtricos (DTA e DSC) correspondente a variao de energia ( H) do extrato liofilizado de H. indicum L., do metilparabeno e da mistura binria do extrato liofilizado e metilparabeno (1:1 p/p).

Componentes da formulao Extrato liofilizado

Temperatura inicial ( C) 80 80 220 550 80,12 125 160 165 225 80 80 112 145 160 251 558

Temperatura final ( C) 150 160 350 600 130,07 150 225 206 245 130 110 135 205 250 360 600

DTA H (J/g) 85,05 1023,90 761,61 240,24 238,61 548,26 94,05 271,67 395,50 393,26

DSC H (J/g) 18,33 147,16 60,78 58,99 33,15 10,53 72,35 -

Metilparabeno

Extrato/Metilparabeno (1:1 p/p)

As curvas TG, DTA e DSC do extrato liofilizado, propilenoglicol e suas misturas binrias (extrato/propilenoglicol 1:2 p/p) esto apresentadas nas Figuras 24, 25 e 26, respectivamente. Os resultados referentes aos seus percentuais de perda de massa e variao de temperatura esto descritos na Tabela 14 e 15.

Resultados 95

Figura 24. Curvas TG correspondente ao extrato liofilizado, a mistura binria (extrato/propilenoglicol 1:2 p/p) e ao propilenoglicol.

Tabela 14. Resultados termogravimtricos (TG) correspondente a perda de massa ( m) do extrato liofilizado de H. indicum L., do propilenoglicol e da mistura binria do extrato liofilizado e propilenoglicol (1:2 p/p).

Componentes da formulao Extrato liofilizado

Temperatura inicial ( C) 25 200 390 108 25 218 435

Temperatura final ( C) 110 330 600 140 140 269,45 461

Perda de massa (%) 5,3 29,08 14,85 99,95 62,79 10,3 3,86

Propilenoglicol Extrato/Propilenoglicol (1:2 p/p)

Resultados 96

Figura 25. Curvas DTA correspondente ao extrato liofilizado, a mistura binria (extrato/propilenoglicol 1:2 p/p) e propilenoglicol.

Figura 26. Curvas DSC correspondente ao extrato liofilizado, a mistura binria (extrato/propilenoglicol 1:2 p/p) e propilenoglicol.

Resultados 97
Tabela 15. Resultados termogravimtricos (TG) correspondente a perda de massa ( m) do extrato liofilizado de H. indicum L., do propilenoglicol e da mistura binria do extrato liofilizado e propilenoglicol (1:2 p/p).

Componentes da formulao Extrato liofilizado

Temperatura inicial ( C) 80 80 220 550 28 222 25 530 90

Temperatur a final ( C) 150 160 350 600 150 237 150 600 180

DTA H (J/g) 85,05 1023,90 761,61 823,46 1160,37 303,63 -

DSC H (J/g) 18,33 155,74 88,33

Propilenoglicol Extrato/Propilenoglicol (1:2 p/p)

5.3.2 Anlise espectrofotomtrica na regio do infravermelho do extrato liofilizado e suas misturas binrias. Os espectros na regio do IV do extrato liofilizado, da mistura binria (Extrato/Hidroxietilcelulose 1:1 p/p) e a hidroxietilcelulose esto apresentadas na Figura 27. As bandas de absoro do extrato liofilizado foram observadas na mistura binria com seus excipientes analisados, verificando uma compatibilidade do extrato com as misturas binrias dos excipientes farmacuticos utilizados na formulao.

Resultados 98

Figura 27. Espectros na regio do IV do extrato liofilizado de H. indicum L., da mistura binria (extrato/HEC 1:1 p/p) e da HEC, analisados na faixa de -1 absoro de 4000-500 cm .

Os espectros na regio do IV do extrato liofilizado, da mistura binria (Extrato/Metilparabeno 1:1 p/p) e o metilparabeno esto apresentados na Figura 28.

Figura 28. Espectros na regio do IV do extrato liofilizado de H. indicum L., da mistura binria (extrato/metilparabeno 1:1 p/p) e do metilparabeno, analisados na faixa de absoro -1 de 4000-500 cm .

Resultados 99

Os espectros na regio do IV do extrato liofilizado, da mistura binria (Extrato/Propilenoglicol 1:2 p/p) e o propilenoglicol esto apresentados na da Figura 29.

Figura 29. Espectros na regio do IV do extrato liofilizado de H. indicum L., da mistura binria (extrato/propilenoglicol 1:2 p/p) e do propilenoglicol, analisados na faixa de -1 absoro de 4000-500 cm .

5.3.3 Formulao fitoterpica contendo tintura padronizada de H. indicum L.

5.3.3.1 Avaliao da formulao semi-slida contendo a tintura de H. indicum L. Os aspectos primrios considerados na estabilidade de uma formulao cosmtica so os aspectos fsicos que devem conservar as propriedades fsicas originais como aspecto, cor, odor, uniformidade (BRASIL, 2004). Portanto, a formulao farmacutica fitoterpica obtida apresentou uma boa consistncia de gel, usando o polmero hidroxietilcelulose na concentrao de 1,5%, cor verde, caracterstico da tintura de H. indicum L. e odor tambm caracterstico da tintura. 5.3.3.2 Teste de Centrifugao.

Resultados 100

Aps a submisso do gel fora centrpeta visando acelerao de possveis processos de instabilidade, foi possvel observar a no ocorrncia de desestruturao da cadeia polimrica do gel contendo a tintura de H. indicum L., assim a formulao foi aprovada no teste de centrifugao, permitindo a continuidade dos testes de estabilidade do gel. 5.3.3.3 Teste de estresse trmico. Para realizao dos ciclos em estufa e temperatura ambiente foi verificada as seguintes caractersticas organolpticas: aspecto, cor e odor (BRASIL, 2004; LIMA et al, 2008). Aps 24 h do preparo da formulao, observou-se que o gel apresenta aspecto homogneo, cor verde e odor caracterstico da tintura de H. indicum L.. Essas caractersticas foram consideradas como padro para comparao com as amostras submetidas aos ciclos em estufa (45 C2 Aps a C). anlise macroscpica de cada amostra ao trmino dos ciclos no se observou quaisquer caractersticas apresentadas pela amostra padro. 5.3.3.4 Determinao do pH da formulao Os valores de pH obtidos por potencimetria direta em disperso aquosa das amostra do gel em estufa (45 C2 e das amostras que permaneceram C) temperatura ambiente (25 C2 esto representadas na figura 30. C),

9 8 Valor de pH 7 6 5 4 3 T0 T1 T2 T3 T4 Ciclo de estabilidade T5 T6 Amostra a 25C Amostra a 45C

Figura 30. Valores de pH obtidos pelo teste do estresse trmico das amostras do gel de H. indicum L. submetido a estufa (45 2 e das amostras do gel de H. C C) indicum L. submetido a temperatura ambiente (25 C 2 n= 3. C),

Resultados 101

5.3.3.5 Avaliao do comportamento reolgico da formulao A figura 31 mostra que a formulao apresenta perfil de material fluidificante. O comportamento de deformao da formulao obtida pode ser observado na figura 32. O gel apresentou uma pequena rea de histerese, ocorrendo uma sobreposio das curvas ascendentes e descendentes do processo.

Figura 31. Caractersticas da viscosidade da formulao contendo tintura de H. indicum L.

Figura 32. Perfil reolgico da formulao contendo tintura de H. indicum L.

102

6. DISCUSSO

Discusso 103

6. Discusso O Brasil um dos pases mais ricos em biodiversidade vegetal e um grande fornecedor deste tipo de matria-prima, porm o desenvolvimento tecnolgico de medicamentos fitoterpicos no pas ainda incipiente, necessitando de um controle de qualidade mais rigoroso e eficiente. Vrias empresas nacionais empregam matria-prima vegetal diretamente na elaborao de seus medicamentos. No Brasil 20% da populao responsvel por 63% do consumo dos medicamentos fitoterpicos disponveis (DI STASI, 1996). Essa alternativa utilizada tanto dentro de um contexto cultural, na medicina popular, quanto na forma de fitoterpicos. Por isso, os fitoterpicos vem sendo, no caso do Brasil e de muitos pases, o suporte da indstria farmacutica genuinamente nacional de pequeno e mdio porte (FARIAS et al, 1994). Vrias prefeituras municipais tm estruturado programas de uso de fitoterpicos, como a prefeitura municipal de Curitiba, que desde 1989, lanou um programa implantando a fitoterapia nas unidades de sade do municpio. Seguindo este exemplo alguns estados no pas vm realizando a implantao de programas de fitoterapia na ateno primria sade, com o objetivo de conhecer o perfil de utilizao e prescrio dos fitoterpicos (SIMES et al, 2001; PORTAL DA SADE, 2009). Atualmente, o uso de plantas medicinais tem despertado o interesse de rgos governamentais na tentativa de utilizar esses produtos como recurso teraputico, porm essencial que o medicamento fitoterpico passe por todo processo de avaliao da eficcia, toxicidade, testes microbiolgicos, ou seja, um rigoroso controle de qualidade para depois ser comercializado como produto teraputico. A utilizao de matrias-primas vegetais para obteno de uma formulao fitoterpica no apresentava os critrios definidos de aceitao da qualidade. Foi somente com a RDC n 17 de 2000 e RDC n 48 de 2004 (revoga anterior) que tais critrios passaram a ser definidos e exigidos. Assim, para desenvolver um medicamento fitoterpico preciso planejar e obter preparaes intermedirias para transformao da matria-prima vegetal em um produto acabado, o qual originar a apresentao farmacutica desejada. Tal processo importante porque o material inicial para estudo dever ser estvel de modo que garanta a reprodutibilidade do

Discusso 104

processo e suficientemente seco e pulverizado para que se consiga um bom rendimento no processo de extrao dos constituintes qumicos de interesse farmacuticos (SILVA JNIOR, 2006). Neste trabalho foi realizado o processo de caracterizao fsica, qumica e fsico-qumica da droga vegetal e da soluo extrativa (tintura) das folhas de H. indicum L. (Boraginaceae) em virtude da importncia que estas determinaes proporcionam na montagem de mtodos para controle de qualidade desde o processo da coleta do material vegetal at a obteno do produto intermedirio e final. Dessa forma, o material vegetal foi coletado, higienizado, seco, pulverizado e armazenado, tendo todas estas etapas devidamente padronizadas para garantir a reprodutibilidade do processo. A espcie foi coletada no ms de maio de 2008, s 18 horas. Informaes sobre poca e horrio de coleta so importantes, pois as espcies apresentam pocas especficas em que contm maior quantidade de princpios ativos no seu tecido, podendo variar tanto no perodo de um dia como em pocas do ano (MARTINS et al, 1995). Este critrio importante no que diz respeito qualidade qumica do produto, pois uma baixa concentrao da substncia ativa no material pode levar a uma desconfiana na pureza do produto. Logo, o conhecimento da poca correta de coleta do material desejado leva obteno de produtos de melhor qualidade. fundamental todo um aparato tcnico-cientfico no momento da coleta do vegetal, pois o conhecimento prvio de coleta e manuseio do vegetal at a secagem uma maneira de evitar danos s plantas. O recipiente de coleta do material colhido no dever danific-lo, a fim de evitar o esmagamento. E o material vegetal deve estar protegido da incidncia de raios solares, pois estes aceleram sua degradao. Assim, o material colhido deve ser imediatamente levado ao local de secagem para impedir reaes que destruam os princpios ativos das plantas (CORRA JNIOR et al, 1994). Quando se estuda plantas, a identificao da espcie e sua perpetuao como testemunho so os passos mais importantes para que qualquer investigao possa ser reproduzida. Por isso, a espcie vegetal em estudo foi devidamente

Discusso 105

identificada por profissional capacitado e depositada no herbrio do Museu Paraense Emlio Goeldi. Na preparao do material vegetal, visando uma maior estabilidade qumica e a fim de interromper os processos metablicos que ocorrem mesmo aps a coleta da planta, o material foi submetido a processo de estabilizao e secagem. Para a estabilizao do vegetal, este foi imediatamente tratado com soluo etanlica 70% (v/v) de forma a impedir a ao enzimtica e, assim, evitar a alterao dos compostos qumicos originalmente presentes no vegetal. Tal processo consistiu na desnaturao protica das enzimas celulares, atravs da destruio das estruturas quaternrias e tercirias, pela ao de um agente desidratante (etanol). A secagem do material teve por finalidade a retirada de gua e, com isso, impedir reaes de hidrlise e de crescimento microbiano. Aps secagem, o material vegetal seco foi submetido a processo de moagem para reduzi-lo, mecanicamente, a fragmentos de pequenas dimenses, preparando-o, assim, para a prxima etapa que consisti na extrao. A determinao da distribuio granulomtrica do p das folhas de H. indicum L. foi importante para determinar o grau de diviso do p expresso pela referncia abertura nominal da malha do tamis. A droga vegetal recebeu a classificao de p grosso pela FARMACOPIA BRASILEIRA IV (1988) (Figura 5, p.75). A determinao da distribuio granulomtrica da droga vegetal um parmetro da eficincia da extrao, porque partculas muito finas impedem a absoro do lquido extrator e diminuem a eficincia da extrao. J partculas de alta granulometria no apresentam grande superfcie de contato, o que tambm diminui a eficincia da extrao (PRTILE, 2007). A perda por dessecao um indicativo do teor de material voltil do vegetal e, indiretamente da umidade residual presente em drogas vegetais (COSTA, 1982). A perda por dessecao da droga vegetal em estudo inferior a 14% (Tabela 1, p.76), logo est dentro do parmetro estabelecido pela FARMACOPIA BRASILEIRA IV (1988). O conhecimento sobre perda por dessecao do material vegetal faz-se importante, pois ir influenciar no processo de conservao que aliado a um armazenamento adequado, manter a qualidade da espcie vegetal, a estabilidade e a preservao de suas propriedades teraputicas (BRAGA et al, 2007). A

Discusso 106

determinao do teor de gua residual presente nas drogas vegetais tambm garante um ndice da qualidade de sua preparao e da garantia de sua conservao (COSTA, 1982). Dessa forma, o valor encontrado para a droga vegetal em estudo encontra-se dentro dos valores estabelecidos pela Farmacopia Brasileira IV (1988), indicando uma boa conservao e uma secagem eficiente da matria-prima vegetal. A importncia da determinao da perda por dessecao est ligada tambm estabilidade microbiolgica da matria-prima vegetal, como expresso da sua suscetibilidade ao desenvolvimento de fungos e bactrias, e estabilidade qumica, representada especialmente pelos processos de hidrlise (WHO, 1992). Alm de representar riscos devido produo de substncias txicas, pode acarretar destruio e/ou alterao dos princpios ativos tornando-se assim o material vegetal imprprio ao consumo (AMARAL et al., 2003). A perda por dessecao pode, ainda, fornecer dados a cerca do rendimento de extrao, j que a secagem influi no estado de integridade das estruturas celulares, expondo-as mais ou menos ao contato com solventes (HARBORNE et al, 1975). Alm do que, sob o ponto de vista tecnolgico e de produo, importante conhecer quantitativamente o contedo de gua presente na matria-prima, para que este valor seja considerado nos clculos de rendimento (DE PAULA, 1996). A determinao de cinzas totais em material vegetal pode servir como mtodo para avaliar a pureza do material, detectando a presena excessiva de substncias aderentes. aplicada uma metodologia simples no controle de qualidade da droga vegetal, permitindo detectar adulteraes e evitar a exposio do consumidor ao risco real do uso de material vegetal inadequado (AMARAL et al., 2003). As cinzas resultantes da incinerao do material vegetal podem ser fisiolgicas (derivada dos componentes minerais da prpria planta) e no fisiolgicas (derivada da matria estranha, como solo, areia que adere superfcie da droga vegetal). Quando estas cinzas apresentam um teor superior ao indicado pela monografia, geralmente so referentes a procedimentos de colheita e ps-colheita inadequados (SHARAPIN et al, 2000). O resultado encontrado na determinao do teor de cinzas totais para o p das folhas de H. indicum L. indica a quantidade de substncia residual no-voltil no processo de incinerao (Tabela 1, p.76). Tal valor, apesar de relativamente

Discusso 107

elevado, corrobora com os valores encontrados na literatura para material vegetal referente famlia Boraginaceae (TOLEDO et al, 2003). Entretanto inmeros fatores podem alterar esse teor, como aqueles relacionados aos procedimentos de coleta, secagem e transporte dos materiais, ou mesmo devido s diferenas em termos da localizao geogrfica dos materiais analisados (SILVA JNIOR, 2006). A anlise trmica tem despertado grande interesse dos pesquisadores e tecnlogos, principalmente nos ltimos anos, devido utilizao deste grupo de tcnicas na caracterizao da droga de origem natural ou sinttica e tambm em alimentos. Pode ser aplicada a materiais como polmeros, frmacos e produtos cosmticos em geral (ARAGO et al, 2002; OLIVEIRA et al, 2004). Essa metodologia analtica visa substituir os atuais mtodos clssicos utilizados no controle de qualidade de produtos naturais, entre outros fatores por ser uma metodologia confivel e de rpida execuo (ARAGO et al, 2002). As tcnicas termoanalticas tambm so usadas na rea de frmacos e medicamentos para a aplicao e estudos de estabilidade trmica, compatibilidade frmaco-excipiente e para determinao da pureza (RODRIGUES et al, 2005; ALVES et al, 2006). Ressalta-se, ainda, que os resultados obtidos conduzem a parmetros relevantes no processamento industrial de frmacos e de medicamentos. E uma das potencialidades analticas da termogravimetria determinar o teor de umidade do material analisado, por isso, utilizada no controle biolgico para armazenamento. Pode ser utilizada, tambm, para determinao do teor de cinzas como indicador da qualidade de sais minerais e possveis adulteraes do material com compostos inorgnicos (FELSNER e MATOS, 1998). As anlises termoanalticas (TG, DTA e DSC) do p da planta e do extrato liofilizado foram analisadas na faixa de temperatura de 25 a 110 prximo da C C faixa de temperatura dos mtodos convencionais descritos pela Farmacopia Brasileira IV (1988), com finalidade de comparar as condies experimentais entre os mtodos convencionais e termogravimtricos. Deu-se preferncia pelo processo de liofilizao, pois mantida uma melhor estabilidade do material, conservando sua composio qumica e atividade biolgica (AYROSA et al, 2007). As curvas termogravimtricas (TG, DTA e DSC) obtidas em atmosferas de nitrognio mostram perdas de massa e variao de entalpia caracterizada pelos eventos de decomposio do material analisado. A figura 6 (p.76) mostra um

Discusso 108

primeiro estgio de perda de massa da droga no intervalo de temperatura de 25 a C 110 que est de acordo com o evento endotrmico ocorrido pela curva DSC da C, droga (Figura 7, p.77 e Tabela 3, p.78). Essa perda de massa inicial pode ser atribuda desidratao da droga vegetal e evaporao de constituintes volteis como os leos essenciais (WESOLOWSKI et al., 2003). A curva TG do p da planta (Figura 6, p.76) mostra eventos que tambm so observados na curva DSC (Figura 7, p.77) e correspondem perda de gua superficial ou de umidade da droga e/ou evaporao de compostos volteis. Com tais dados da anlise termogravimtrica e o resultado do ensaio gravimtrico de perda por dessecao do p das folhas de H. indicum L. possvel verificar que a anlise termogravimtrica fornece uma estimativa do contedo de gua residual presente no material aps seu preparo (SILVA JNIOR, 2006) (Tabela 1, p.76 e Tabela 2, p.77). No segundo estgio de decomposio que se inicia por volta de 240 C (Figura 6, p.76; Tabela 2,, p.77), ocorre uma significativa perda de massa, devido decomposio trmica de carboidratos e demais compostos orgnicos presentes na droga e ao incio da carbonizao do material vegetal (WESOLOWSKI et al.,2003; ARAJO et al, 2006) que refletida pela curva TG, enquanto ao mesmo tempo a curva DSC indica fortes eventos exotrmico nessa temperatura (Figura 7, p.77). A partir de 390 observa-se a terceira etapa de decomposio do material vegetal, C, referente queima de restos carbonizados da matria orgnica (Figura 6; Tabela 2) (FARIA et al, 2002). A curva TG referente ao extrato liofilizado (Figura 13, p.84) mostra uma perda de massa inicial de 5,3% (Tabela 6, p.84) na faixa de temperatura analisada de 25 at 110 Esta perda de massa simultaneamente acompanhada por um C C. evento endotrmico verificado pelas curvas DTA e DSC (Figura 14; Tabela 7, p.85). Tais valores podem ser atribudos desidratao do material vegetal e/ou evaporao de constituintes volteis, garantindo, assim, uma estabilidade trmica do extrato nesta faixa de temperatura. A partir de 200 observam-se eventos caracteristicamente exotrmicos C evidenciados pelas curvas DTA e DSC (Figura 14), com um consumo de energia caracterizando um processo de decomposio trmica do material (Tabela 7). As curvas TG e DSC na faixa de temperatura de 200 a 330 mostram uma perda C C de massa significativa e um consumo de energia elevado (Figura 13 e 14; Tabela 6 e

Discusso 109

Tabela 7, respectivamente) atribudo provavelmente queima de material orgnico presente no extrato liofilizado e acima de 400 foi evidenciada a formao de C cinzas do material (Figura 13; Tabela 6). Com isso, verifica-se por meio das anlises trmicas que tanto a droga vegetal quanto o extrato liofilizado de H. indicum L. apresentam uma boa estabilidade trmica at 180 (Figuras 6, p.76 e Figura 13, p.84). Esta informao C extremamente importante para os testes de estabilidade trmica e compatibilidade entre as misturas fsicas do extrato liofilizado e os adjuvantes farmacuticos utilizados no estudo de formulao para o desenvolvimento do gel fitoterpico. Os espectros de absoro na regio do IV referente droga vegetal e ao extrato liofilizado de H. indicum L., foram realizados com o objetivo de inferir informaes preliminares sobre os constituintes qumicos da planta e assim forneceram um agregado rico de bandas de absoro (Figura 8, p.78 e Figura 15, p.86). A anlise das bandas caractersticas de determinados grupos funcionais de uma molcula fornece, atravs de uma anlise do espectro e consulta a tabelas de dados, um conjunto de informaes sobre a estrutura da molcula a qual ser utilizada como uma ferramenta importante para o controle de qualidade do marcador qumico presente no extrato (BARBETTA e MAGINI, 2006). Entretanto, o espectro na regio do IV no diferencia normalmente uma amostra pura de uma no pura. Logo, uma amostra pura apresenta bandas de absoro bem agudas e resolvidas, j o espectro de um produto bruto que contm muitos tipos diferentes de molculas pode apresentar bandas de absoro arredondadas e mal resolvidas devido s diversas absores presentes (DYER, 1965). Pelos espectros da droga vegetal e do extrato liofilizado possvel verificar a presena de bandas largas na regio de 2900-2820 cm-1 sugerindo a presena de CH de alifticos. A absoro em 1599 cm-1 e 1573 cm-1, nos espectros da droga vegetal e no extrato liofilizado, respectivamente, sugere a presena de C=O conjugada de steres e a absoro em 1175-1050 cm-1 relativo a vibraes de estiramento C-O para anidridos acclicos (Figuras 8 e 15). Esta faixa de absoro relativo a grupamento teres sugere a presena de uma ampla classe de metablitos secundrios tais como: flavonides, cumarinas, antraquinonas, alcalides quinolnicos e quinolnicos e outros fenil propanides.

Discusso 110

Com isso, basicamente os mesmo grupamentos funcionais aparecem nos espectros das duas amostras (droga vegetal e extrato liofilizado) (Figura 16, p.87). A figura 8 (p.78) relativa ao espectro do p de H. indicum L. mostra que h absoro em 3340 cm-1, 3270 cm-1, 3229 cm-1. O espectro na regio do IV referente ao extrato liofilizado (Figura 15, p.86) mostra que tambm h absoro em 3283 cm-1. Esta faixa de absoro caracterstica de grupamento funcional hidroxila presente em muitos constituintes do extrato liofilizado e do etanol presente na soluo extratora. Entretanto, por no se disponibilizar neste trabalho de um padro de referncia dos alcalides pirrolizidnicos para comparar as bandas de absoro caractersticas dos grupamentos funcionais de sua estrutura molecular com o espectro do extrato liofilizado de H. indicum L. torna-se dificultada a interpretao da estrutura do marcador qumico no extrato, uma vez que o extrato de H. indicum L. composto de inmeras substncias orgnicas. Analisando os espectros da droga e do extrato (Figura 16, p.87) possvel verificar grupos funcionais presentes na droga vegetal, que tambm so observados no extrato. O espectro do extrato liofilizado mostra um aumento nos sinais de absoro quando comparados ao espectro da droga. Assim, observado um aumento na intensidade das bandas no intervalo de 3200-3400 cm-1, 2400-3200 cm1

, 1300-1450 cm-1 e 1010-1220 cm-1 do extrato liofilizado, que pode est relacionado A avaliao da qualidade de uma tintura inicia-se com a anlise da matria-

extrao dos constituintes qumicos da matriz celular. prima ou droga vegetal utilizada para sua obteno, atentando-se principalmente para identificao botnica ou zoolgica (DESMICHELLE, 1987). Aps o processo de produo, as tinturas devem passar por vrios ensaios, dentre eles: a identificao, observao de caractersticas organolpticas, determinao da densidade, do resduo seco e do teor alcolico e doseamento de compostos marcadores (FONSECA e LIBRANDI, 2008). Tais ensaios so importantes para assegurar a qualidade, atendendo a uma especificao pr-estabelecida. Seguindo este entendimento, na caracterizao e no controle de qualidade da tintura obtida a partir do p de H. indicum L. o valor da densidade aparente se manteve dentro do limite preconizado para tinturas fitoterpicas (0,87 a 0,98 g/cm3) (PRISTA et al, 1990). A tintura apresenta um carter neutro (Tabela 4, p.79), tal resultado determinante na escolha dos adjuvantes empregados na formulao fitoterpica,

Discusso 111

pois um fator que influencia na estabilidade de formulaes (MACIEL et al, 2006). A determinao do resduo seco um parmetro fundamental e preliminar quando se objetiva alcanar a eficcia de uma formulao fitoterpica, pois este ensaio implica na quantificao das substncias extradas da planta atravs da eliminao do solvente extrator, e um indicativo da concentrao da tintura de H. indicum L. (OLIVEIRA e BERRETTA, 2007). A prospeco qumica do extrato bruto revela a presena de classes de metablitos secundrios como fenis, taninos, carotenides e indicativo de esterides e triterpenides (Tabela 5, p.80). Estes resultados corroboram com as classes de metablitos encontrados na literatura para esta espcie (GUERRERO, 1994; PANDEY et al, 2007). Porm, o extrato bruto no apresenta reao de precipitao com os reagentes especficos para alcalides. Entretanto, a frao alcalodica revela a reao caracterizada pelo surgimento de um precipitado com colorao vermelha alaranjado aps adio do reagente de Dragendorff, indicando a presena de alcalides na espcie em estudo. Tambm pela prospeco qumica foi verificada a presena de taninos no extrato. Os taninos tm relevncia na utilizao da espcie por causa da sua propriedade cicatrizante relatada pela medicina tradicional, pois os taninos so responsveis pela formao de uma camada protetora (constituda por um complexo tanino-protena e/ou polissacardeo) sobre a pele ou mucosa danificada. A formao desta camada, portanto, favorece o processo de cicatrizao (SANTOS e MELO, 2004). Uma das principais tcnicas preliminares para separao de substncias presente no extrato vegetal a cromatografia em camada delgada, pois uma tcnica simples, rpida e de baixo custo (SIMES et al, 2001). O perfil cormatogrfico obtido por CCD mostrou a separao das substncias presentes na frao alcalodica (FA) e na frao hexnica (FH) e a reao destas fraes com reagente de Dragendorff (Figura 9; Figura 10, p.81), sugerindo se tratar de alcalides. O sistema eluente CHCl3:CH3OH na proporo 90:10 em atmosfera de NH4OH foi o que melhor separou as substncias da FA (Figura 9). A substncia com Rf de 0,84 apareceu em ambos os cromatogramas das fraes FA e FH. Para se obter um valor de Rf considerado timo de um extrato bruto ou frao bruta preciso adequar as condies cromatogrficas at poder visualizar a mancha

Discusso 112

escolhida numa altura superior a um quarto e inferior a um tero do caminho percorrido pelo eluente na cromatoplaca (BARBOSA, 2001). A cromatografia lquida de alta eficincia (CLAE) uma das tcnicas mais utilizadas para anlise e isolamento de produtos naturais a partir de matrizes complexas como, por exemplo, os extratos de plantas (QUEIROZ e HOSTETTMANN, 2006). Por isso, a CLAE tem sido utilizada de maneira rotineira como mtodo piloto para o isolamento em escala preparativa de produtos naturais pela otimizao das condies experimentais, pelo controle de diferentes fraes obtidas durante o isolamento e pelo controle de pureza final dos compostos isolados (KINGSTON, 1979; ARSLANIAN e STERMITZ, 1991; GRNICHER et al, 1994). Assim, a utilizao de cromatogramas como a impresso digital de uma determinada amostra, poder ajudar na identificao de amostras autnticas e auxiliar na identificao de possveis compostos utilizados em uma adulterao da mesma. Os cromatogramas obtidos atravs da CLAE permitem verificar que o pico com absoro mxima ocorreu em 250 nm e apresentou um tempo de reteno de 1,60 min referente ao extrato bruto e se repetiu na frao alcalodica e na frao hexnica com Rt=1,73 min (Figura 11, p.82). Portanto, a substncia que se apresenta na frao alcalodica tambm pode estar presente na frao hexnica, o que j havia sido observado pela CCD (Figura 9 e 10, p.81). Ao analisarmos os espectros na regio do ultravioleta referente ao extrato de H. indicum L. e sua frao alcalodica notvel a semelhana entre esses espectros, apresentando uma correlao de 0,9657 (Figura 12, p.83). Entretanto, pela falta de uma substncia de referncia ou uma substncia padro dos alcalodes pirrolizidnicos nesse trabalho, houve a impossibilidade em se fazer um estudo minucioso para validao desse marcador qumico presente na tintura. Na CLAE acoplada deteco ultravioleta (CL-UV) o nvel de informao estrutural obtido da substncia limitado pelo tipo de detector acoplado CLAE, pois os detectores baseados em absoro de luz ultravioleta, fluorescncia, ndice de refrao, difrao de luz e eletroqumica proporcionam uma boa deteco e sensibilidade, porm pouca ou nenhuma informao estrutural da substncia analisada (QUEIROZ e HOSTETTMANN, 2006). Por isso a introduo das tcnicas

Discusso 113

de acoplamento tais como CL/UV equipada com uma rede de deteco por fotodiodos (CL/UV-DAD) proporcionou um real avano na identificao estrutural de produtos naturais (LINDON et al, 1997). E os espectros no UV dos produtos naturais podem dar informaes teis sobre a classe de substncias presentes na amostra analisada. Embora as indstrias farmacuticas venham produzindo novos antibiticos e modificando algumas drogas j existentes, as estatsticas mostram que a resistncia a essas molculas pelos micro-organismos est em contnuo crescimento. Tal fato tem causado preocupao, pois cresce o nmero de pacientes em hospitais que tem a imunidade suprimida com concomitante surgimento de linhagens de bactrias e fungos as quais apresentam novos perfis de resistncias a antimicrobianos. Por isso, as buscas de novas substncias com potencial atividade antimicrobiana nas plantas vem crescendo consideravelmente nos ltimos anos. Segundo a OMS as plantas medicinais so a melhor fonte para se obter uma variedade de drogas e cerca de 80% da populao mundial usa a medicina tradicional na busca de alvio de alguma sintomatologia dolorosa ou desagradvel (NASCIMENTO et al, 2000; CAETANO et al, 2002; SANTOS et al, 2007)). Os ensaios da atividade antimicrobiana in vitro mostram que o extrato bruto das folhas de H. indicum L. inibiu o crescimento das cepas gram-positivas, mas no foi capaz de inibir as cepas gram-negativas. O extrato bruto inibiu o crescimento da cepa de S. aureus nas concentraes de 500 mg/mL e 250 mg/mL, mas no apresentou atividade frente as cepas de P. aerugiona, E. coli e C. albicans em nenhuma concentrao analisada (Figura 17; Tabela 9, p.88). A capacidade de inibio do crescimento bacteriano do extrato de H. indicum L. frente cepa grampositiva pode estar diretamente relacionada com a estrutura da parede celular destes micro-organismos, pois esta uma das principais caractersticas que separa os dois grupos de bactrias. Tambm pode ser devido presena da membrana externa das cepas gram-negativas, pois ela age como uma barreira para certos tipos de antibiticos, enzimas digestivas e metais pesados (TORTORA et al, 2003; SANTOS et al, 2007). O extrato hidroalcolico apresenta uma atividade antimicrobiana relativamente baixa que pode ser atribuda ao fato de trabalharmos com o extrato bruto, ou seja,

Discusso 114

uma mistura de substncias que podem estar contribuindo para esta atividade (e outras que no tm atividade antimicrobiana). Logo, estas substncias no devem estar numa quantidade suficiente para ser detectada uma tima atividade antimicrobiana da espcie. Em estudos com a espcie Heliotropium ellipticum foi verificado um amplo espectro e uma elevada atividade antimicrobiana, utilizando a frao hexnica do extrato etanlico, constatando que a substncia -amirina apresentou a maior atividade antimicrobiana, enquanto que o acetato de -amirina foi o mais ativo para atividade antifngica (JAIN et al, 2001). Como a espcie em estudo neste trabalho (H. indicum) tambm possui a substncia -amirina na sua composio (SINGH et al, 2003), sugere-se que esta substncia possa contribuir para a atividade antimicrobiana de H. indicum L. A importncia do extrato bruto de H. indicum L. em apresentar inibio no crescimento da cepa de S. aureus est relacionado principalmente ao fato dessa espcie de bactria ser responsvel por causar abscessos e vrias infeces piognicas em humanos e ainda, mais de 90% destes cocos gram-positivos contm plasmdeos que codificam -lactamase, uma enzima que degrada muitas penicilinas disponveis para tratamento (LEVINSON e JAWETZ, 2005). Hughes (1976) e Mason (1991), citado por Carlos, 2007 ao encontrarem apenas 15% de cepas sensveis, consideraram inadequada a terapia com penicilinas para este micro-organismo. Zavadinack-Netto e col. (2001) concluram que o S. aureus resistente s penicilinas in vitro, por isso estas no devem ser utilizadas como alternativas teraputicas. Os resultados referentes atividade antimicrobiana do extrato bruto de H. indicum frente s cepas de S. aureus demonstram, portanto, que a espcie em estudo apresenta atividade antimicrobiana, tornando relevante este estudo no que diz respeito ao uso de antimicrobianos para uso tpico. Os estudos de planejamento/formulao do gel fitoterpico contendo tintura de H. indicum L. foram realizados para avaliar a viabilidade do seu desenvolvimento tecnolgico. A escolha do gel base do polmero hidroxietilcelulose para incorporao do extrato liofilizado de H. indicum L. foi feita devido as propriedade fsico-qumicas do polmero, pois este de natureza no-inica, estvel em uma

Discusso 115

ampla faixa de pH e apresenta facilidade de aplicao e fcil espalhabilidade sobre a pele (MAIA CAMPOS, 2002; CORRA et al, 2005). A termogravimetria (TG) permite registrar as variaes de massa em funo do tempo do ciclo de aquecimento e arrefecimento e/ou temperatura, por isso, as curvas obtidas podem fornecer informaes referentes estabilidade trmica da formulao. Visto que, a estabilidade e a biodisponibilidade dos frmacos podem ocorrer devido a interaes entre frmacos e adjuvantes nas diferentes formas farmacuticas. A anlise trmica diferencial (DTA) associada termogravimetria (TG) bastante til nos estudos de formulao, na investigao e predio de incompatibilidades fsico-qumicas entre frmacos e adjuvantes farmacuticos (ALVES, 2007). As curvas TG dos excipientes hidroxietilcelulose, metilparabeno e

propilenoglicol comparadas com as curvas TG de suas misturas binrias com o extrato liofilizado de H. indicum L. apresentam comportamentos trmicos particulares observados pela perda de massa da amostra nos intervalos de temperatura analisados (25 a 600 (Figura 18, p.89, Figura 21, p.92 e Figura 24, 95). C C) Entretanto a DTA e DSC mostram que houve um evento endotrmico, at 180 C, em todas as curvas DTA e DSC do extrato e das misturas binrias (extrato/excipientes) (Figuras 19, p. 90; Figura 20, p. 91; Figura 22; Figura 23, p. 93; Figura 25 e Figura 26, p. 96). Nas curvas DTA do extrato liofilizado e das misturas binrias dos excipientes com extrato liofilizado (Figura 19, p. 90; Figura 22, p. 93 e Figura 25, p. 96) evidenciada a presena de um pico ascendente aps a temperatura de 500 C, caracterizando um evento exotrmico, confirmando a autenticidade do extrato nas preparaes e manuteno das suas propriedades fsicas. Tal evento pode funcionar como uma assinatura termodinmica, ou seja, uma caracterstica do extrato de H. indicum L. para controle de qualidade de produtos contendo-o em sua composio. A hidroxietilcelulose (HEC) um polmero gelificante formador de gel noinico, tem ponto de fuso entre 135 a 140 e decompem-se a temperatura de C C 205 a 210 (PHARMACEUTICAL EXCIPIENTS, 2001), til como veculo para C C diversos princpios ativos (CORRA, 2005). A curva TG da mistura fsica do extrato

Discusso 116

liofilizado com a HEC (1:1 p/p) mostra que no houve mudana significativa na faixa de temperatura de 25 a 110 (Figura 18, p.89), quando comparada com as C C curvas do extrato liofilizado e HEC isolados (Tabela 10, p.90). Os resultados obtidos inferem uma compatibilidade fsica entre a HEC e o extrato liofilizado, pois a mistura manteve um comportamento trmico semelhante dos compostos isolados. Comparando-se as curvas por DTA e DSC da hidroxietilcelulose e da mistura fsica (extrato/HEC 1:1 p/p) (Figuras 19 e 20, p. 90 e 91 respectivamente) possvel verificar que no h mudanas significativas nos eventos trmicos na faixa de temperatura de 25 a 110 pois os eventos trmicos ocorridos nesta faixa de C C, temperatura so caractersticos de uma deflexo inicial proporcional capacidade calorfera, seguida de evaporao da umidade da amostra (ALVES, 2008). O metilparabeno usado como conservante da formulao, um p cristalino, fino, branco e praticamente inodoro, muito usado como conservante fungicida (FARMACOPIA BRASILIERA III, 1977). um conservante bastante empregado em formulaes cosmticas e farmacuticas, possui um amplo espectro de ao contra bactrias gram-positivas, gram-negativas e fungos. Tem ponto de fuso em 125 a 128 e faixa de ebulio de 270 a 280 (FARMACOPIA C C C C BRASILIERA IV, 1988; PHARMACEUTICAL EXCIPIENTS, 2001). A curva TG da mistura fsica (extrato/metilparabeno 1:1 p/p) apresenta um comportamento trmico semelhante ao do extrato liofilizado, pois suas perdas de massa ocorrem em trs etapas (Figura 21, p.92). A primeira etapa de perda de massa da mistura fsica ocorre no intervalo de temperatura de 25 a 110 com C C, percentual de perda de massa 3,83% (Figura 21, Tabela 12, p.92). Este resultado revela uma melhora da estabilidade trmica do extrato liofilizado quando misturado fisicamente com o metilparabeno, pois o extrato quando analisado independentemente apresenta um percentual de termodecomposio de 5,3% na mesma faixa de temperatura (Tabela 12, p.92). As curvas DTA da mistura fsica (extrato/metilparabeno 1:1 p/p) (Figura 22, p.93) mostram a manuteno das caractersticas do extrato liofilizado quando misturado fisicamente com o metilparabeno. Entretanto, h uma alterao no valor de variao da temperatura de 240,24 J/g do metilparabeno para 94,05 J/g da mistura binria, na faixa de temperatura de 80 a 130 (Tabela 13, p.94). Os C C

Discusso 117

eventos trmicos que ocorreram nesta faixa de temperatura foram de pequenas alteraes, provavelmente devido s misturas fsicas, sugerindo que no h ocorrncia de interaes entre os mesmos (BAZZO e SILVA, 2005). O propilenoglicol um lquido incolor, viscoso e higroscpico, usado como adjuvante farmacutico, solvente, agente plastificante e umectante. O propilenoglicol muito usado em formulaes farmacuticas de uso externo, pois diminui a agressividade do lcool e ainda promove a hidratao da pele. Tem ponto de fuso de -60 e faixa de ebulio de 187 a 189 (FARMACOPIA BRASILEIRA IV, C C C 1988; PHARMACEUTICAL EXCIPIENTS, 2001). A curva TG da mistura fsica do extrato liofilizado com o propilenoglicol 1:2 p/p (Figura 24, p.95) mostra que na faixa de temperatura de 25 at 140 a mistura C C fsica (extrato/propilenoglicol 1:2 p/p) apresenta uma perda de massa inferior a perda de massa observada pelo propilenoglicol puro. Esta perda de massa do propilenoglicol puro ocorre em apenas uma etapa de termodecomposio (Figura 24; Tabela 14, p.95). As curvas DTA da mistura fsica do extrato com o propilenoglicol 1:2 p/p (Figura 25, p.96) mostram que ocorreu um evento descendente, caracterizando um evento endotrmico at a temperatura de 150 Este evento verificado nas trs C. curvas, referente ao extrato liofilizado, a mistura binria e ao propilenoglicol puro, sendo o pico com maior rea apresentado pelo propilenoglicol puro (Figura 25, p.96). verificada uma diferena no valor da variao de temperatura com aumento do valor de entalpia do propilenoglicol puro de 823,46 J/g para 1160,37 J/g para a mistura do extrato com o propilenoglicol (Tabela 15, p.97). Nas curvas DSC do extrato liofilizado e da mistura fsica observam-se eventos discretos e descendentes (Figura 26, p.96), que no ocorre na curva DSC do propilenoglicol puro, apresentando evento em menor quantidade aps 200 e com pico mais C acentuado. A anlise espectrofotomtrica na regio do IV, em conjunto a outras tcnicas analticas, importante para monitorar os estudos de pr-formulao auxiliando na seleo de componentes da formulao (ZARONI, 2006). Dessa forma, a aplicao desta tcnica analtica neste trabalho teve a finalidade de avaliar possveis

Discusso 118

incompatibilidades do extrato liofilizado de H. indicum L. com os componentes escolhidos na formulao proposta. Os espectros na regio do IV dos adjuvantes puros, quando comparados com os espectros obtidos de sua mistura fsica com o extrato liofilizado, revelam que no h modificaes significativas no perfil de absoro (Figuras 27, 28 , p.98 e Figura 29, p.99). Tambm notvel que as bandas de absoro presentes nos espectros dos adjuvantes puros e de suas misturas fsicas coincidem com as bandas de absoro presentes no espectro do extrato liofilizado, sugerindo a ausncia de interao entre os componentes da formulao (ZARONI, 2006). O estudo de estabilidade preliminar consiste na realizao do teste na fase inicial do desenvolvimento do produto, empregando-se condies extremas de temperatura (estresse trmico), com o objetivo de acelerar possveis reaes entre seus componentes e o surgimento de sinais de instabilidade que devem ser observados e analisados conforme as caractersticas especficas de cada tipo de produto (BRASIL, 2004; BABY et al, 2008; ISAAC et al, 2008). Aps 24 h do preparo da formulao, esta foi submetida avaliao preliminar da estabilidade, empregando-se os testes de centrifugao e do estresse trmico. Para Bilia e colaboradores (2001), o estudo de estabilidade representa uma parte indispensvel para o ensaio de produtos farmacuticos e cosmticos, pois a instabilidade das preparaes modifica os requisitos qualidade, eficcia e segurana. O teste de estabilidade preliminar serviu como orientao para o desenvolvimento da formulao, a qual foi submetida a centrifugao e a condies extremas de temperatura com o objetivo de acelerar possveis processos de instabilidade na formulao. A formulao desenvolvida foi analisada macroscopicamente. Aps 24 h de repouso, o gel macroscopicamente no apresenta alteraes fsicas e apresenta cor verde claro, com o odor caracterstico da tintura de H. indicum L. A aparncia clara do gel facilita a aceitabilidade dos pacientes ao tratamento com formulaes semislidas, pois pesquisas j demonstraram a preferncia dos pacientes em utilizar gis transparentes, uma vez que os gis com colorao escura do a idia de que podem manchar a pele (LIEBERMAN et al, 1996).

Discusso 119

O teste de centrifugao tem carter eliminatrio e foi realizado para avaliao da estabilidade preliminar da formulao. Assim, aps a amostra ter sido submetida a uma fora centrpeta de 3000 rpm por 30 minutos, esta manteve sua caracterstica fsica, ou seja, no houve qualquer sinal de instabilidade na formulao, que poderia ser observado pela desestruturao da cadeia polimrica do gel. Entretanto, a ausncia de sinais de instabilidade no gel nesse teste no assegura sua estabilidade, somente indica que o produto pode ser submetido, sem necessidade de reformulao, ao teste do estresse trmico (BRASIL, 2004; ISAAC et al, 2008; LIMA et al,2008). Durante o estudo de estabilidade, os resultados obtidos na avaliao da formulao foram considerados satisfatrios, pois a preparao semi-slida permaneceu estvel durante os dias de avaliao, visto que no se identificou sinais de instabilidade como sinrese, ou seja, separao espontnea de um sistema coloidal em duas fases: gel e lquido, alterao de cor, odor e da aparncia da homogeneidade. A determinao do pH foi o parmetro utilizado para avaliao do teste do estresse trmico, o qual foi submetido o gel contendo tintura de H. indicum L. Assim, verifica-se pela figura 30 que o gel apresenta uma variao inicial no valor de pH da amostra submetida temperatura ambiente e da amostra submetida estufa. A partir do segundo dia de experimento, as amostras apresentaram uma queda no valor do pH mantendo um valor em torno de 5,5 durante todos os dias at o final do experimento (Figura 30, p.100). Portanto, no houve alterao significativa no valor de pH do gel aps o teste do estresse trmico, assim, a base gelificante de HEC a 1,5% permaneceu estvel a mudanas de temperatura, caracterizando-a em mais um indicativo primrio de estabilidade da formulao. Tais estudos preliminares de estabilidade de uma formulao semi-slida ajudam a obteno de resultados satisfatrios para desenvolvimento de uma formulao estvel em um curto intervalo de tempo. Porque comum no desenvolvimento de uma formulao farmacutica semi-slida ocorrer incompatibilidades entre os princpios ativos e os excipientes da formulao (ISAAC et al, 2008; LIMA et al, 2008). Particularmente nas formulaes fitoterpicas do tipo gel as incompatibilidades podem ocorrer entre o polmero formador do gel e os

Discusso 120

outros constituintes da formulao, principalmente aps a incorporao de extratos ou tinturas gerando processos de incompatibilidades como: turbidez, precipitao, cristalizao, alterao de cor, alterao de odor, desestruturao da cadeia polimrica (ISAAC et al, 2008). A anlise reolgica vem sendo muito aplicada na rea farmacutica com particular interesse em preparaes semi-slidas, as quais sofrem fortes influncias quanto ao espalhamento e a aderncia na pele, extruso das embalagens e liberao de princpios ativos. O interesse em usar este parmetro analtico foi de avaliao do comportamento reolgico da formulao. A figura 31 (p.101) mostra que a formulao apresenta perfil de corpos fluidificantes devido a uma reduo de resistncia do material ao escoamento quando a velocidade aumentada. H relatos de que materiais com este perfil quando em repouso apresentam estruturas reticulares que podem ser constitudas por aglomerados de molculas que se atraem ou por uma rede de cadeias polimricas emaranhadas (ALMEIDA e BAHIA, 2003). As curvas ascendentes e descendentes do gel se sobrepem apresentando uma pequena rea de histerese (Figura 32, p.101), entretanto a recuperao da viscosidade inicial mais rpida o que sugere a presena de um componente viscoelastico na formulao. A literatura classifica a hidroxietilcelulose como agente doador de viscosidade em formulaes semi-slidas, com comportamento viscoelastico (MINER, 1993).

121

7.CONCLUSO

Concluso 122

7. Concluses Com os resultados obtidos no trabalho podemos concluir que: O material vegetal passou por procedimentos de colheita e ps-colheita adequados, garantindo a reprodutibilidade do processo e manuteno de sua estabilidade qumica. A droga vegetal foi classificada como p grosso, pois a maior quantidade de massa retida foi encontrada no tamis com abertura de malha de 355 m. A droga vegetal apresentou teor de perda por dessecao dentro dos parmetros estabelecidos pela Farmacopia Brasileira, indicando que os procedimentos de colheita e ps-colheita foram adequados e garantiram boa conservao e secagem eficiente da matria-prima vegetal. O resultado da determinao do teor de cinzas totais do p das folhas de Heliotropium indicum L. corrobora com os valores encontrados na literatura para material vegetal pertencente famlia Boraginaceae. Pela anlise trmica foi possvel constatar que a droga vegetal e o extrato liofilizado apresentaram boa estabilidade fsica at 180 e revelaram valores de C perda de umidade muito prximos ao valor obtido pelo mtodo gravimtrico de perda por dessecao. Os espectros de absoro na regio do infravermelho do p e do extrato liofilizado mostram que houve um aumento na intensidade das bandas de absoro e que pode est relacionado extrao dos constituintes qumicos da matriz celular. A prospeco qumica do extrato bruto mostrou reao negativa para a classe de alcalides. A frao alcalodica foi positiva para alcalides, indicando que o resultado do extrato bruto foi mascarado pela presena de corantes naturais ou encobertas por substncias majoritrias como cidos graxos. As CCD das fraes mostraram reao positiva aps revelao com reagente de Dragendorff e o sistema eluente que melhor separou as substncias foi CHCl3:CH3OH na proporo de 90:10 em atmosfera de NH4OH.

Concluso 123

O perfil cromatogrfico do extrato bruto e de suas fraes obtido por CLAE mostraram que o pico observado no extrato referente ao Rt=1,60 min. observado nas fraes alcalodica e hexnica com Rt=1,73 min. Sugerindo-se tratar da mesma substncia qumica. O extrato bruto das folhas de H. indicum L. apresentou inibio no crescimento da cepa de Staphylococcus aureus. Confirmando, portanto, que a espcie em estudo apresenta uma importante atividade antimicrobiana como foi relatado pelo uso tradicional. As anlises termogravimtricas e espectroscpicas na regio do infravermelho das misturas fsicas do extrato liofilizado com os adjuvantes farmacuticos utilizados no desenvolvimento da formulao fitoterpica no apresentaram incompatibilidade fsica e no houve modificaes significativas no perfil de absoro entre os compostos analisados. O gel fitoterpico manteve-se estvel aps sua preparao. No houve desestruturao da cadeia polimrica aps a submisso do gel a fora centrpeta e este permaneceu estvel aps sofrer ao do estresse trmico e apresentou caractersticas de corpos fluidificantes.

124

8. REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS

Referncias Bibliogrficas 125

8. Referncias Bibliogrficas ABAMBA, G. Skin preparation. In: BUTTLER, H. (Ed.) Pouchers perfums, cosmetics and soaps. 9 ed. London: Chapaman & Hall. 1993. ABIFITO Associao Brasileira da Indstria Fitoterpica. Uma legislao justa para produtos de origem natural. Disponvel em: <www.abifito.com.br>. Acesso em: Dezembro de 2008. AKERELE, O.; WHO: Guidelines for the assessment of herbal medicines. Fitoterapia, v.63, n.2, p.99-110, 1992. AKHANI, H. e FRTHER, H. The genus Heliotropium L. (Boraginaceae) in Flora Iranica Area. Sendtnera, vol. 2: 187-276, 1994. ALVES, M.S.M. Estudo de caracterizao fsica, qumica, fsico-qumica e de prformulao de Arrabidaea chica (H&B) Verlt. Dissertao (mestrado em Cincias Farmacuticas. rea de Concentrao: Frmacos e Medicamentos) Universidade Federal do Par, 2008. ALVES, R.; Estudo termoanaltico e de compatibilidade frmaco-excipiente de rifampicina e alguns medicamentos utilizados na teraputica da tuberculose. Dissertao (mestrado em Cincias Farmacuticas. rea de concentrao: Produo e Controle Farmacuticos), Universidade de So Paulo. So Paulo, 2007. ALVES, R.; SILVA, L.C.C.; NASCIMENTO JR. R.V.; MATOS; J.R. Aplicao da anlise trmica no estudo termoanaltico de amoxicilina triidratada. Anais do V Congresso Brasileiro de Anlise Trmica e Calorimetria V CBRATEC 2006. AMARAL, F.M.M.; COUTINHO D.F.; RIBEIRO M.N.S.; OLIVEIRA, M.A.; Avaliao da qualidade de drogas vegetais comercializadas em So Lus/Maranho. Revista Brasileira de Farmacognosia; vol. 13: 27-30. 2003. AMOROZO, M. C, GLLY, A. Boletim do Museu Paraense Emlio Goeldi, Srie Botnica, 4, n.l, 47-131, 1988. ANDHIWAL, C. K.; HAS, C.; VARSHNEY, R. P. Chemical and pharmacological studies of Heliotropium indicum. Indian Drugs . Vol. 22(11), 567-569, 1985. ANSEL, H.C., POPOVICH, N. G., ALLEN, L. V. Farmacotcnica: formas Farmacuticas & Sistemas de Liberao de Frmacos. 6 ed. So Paulo: Editorial Premier, 568p; 2000. ARAGO, C.F.S.; SOUZA, F.S.; BARROS, A.C.S.; VERAS, J.W.E.; BARBOSA FILHO, J.M.;. MACEDO, R.O. Aplicao da termogravimetria (TG) no controle de qualidade da milona (Cissampelos sympodialis Eichl.) Menispermaceae. Revista Brasileira de Farmacognosia, v. 12, supl., p. 60-61, 2002.

Referncias Bibliogrficas 126

ARAJO, A. A. S. Anlise trmica e determinao dos parmetros cinticos de preparaes farmacuticas e novas especialidades de zidovudina. 225f. Tese (Doutorado em Cincias Farmacuticas) Faculdade de Cincias Farmacuticas USP, So Paulo, 2003. ARAJO, A.A.S.; MERCURI, L.P.; SEIXAS, S.R.S.; STORPIRTIS, S.; MATOS, J.R. Determinao dos teores de umidade e cinzas de amostras comerciais de guaran utilizando mtodos convencionais e anlise trmica. Revista Brasileira de Cincias Farmacuticas. Vol. 42, n.2, 269-277, 2006. ARSLANIAN, R.L.; STERMITZ, F.R. High performance liquid chromatographic analysis of iridoid glycosides from Penstemon rydbergil varieties. Phytochemical Analysis, v.2, p.35, 1991. AUTON, M.E. Delineamento de Formas Farmacuticas. 2ed. Porto Alegre: Editora Artmed, 2005. AYROSA, A.M.I.B. Liofilizao: cincia ou arte? Revista de Engenharia da FAAP, So Paulo, 44-40, 2004. AYROSA, A.M.IB.; MAIZATO, M.J; POLAKIEWICZ, B.; BEPPU, M.M.; PITOMBO, R.N.M. Estudo do comportamento higroscpio do pericrdio bovino liofilizado. Matria (UFRJ), v.12.p. 313-321, 2007. BABY, A.R. Desenvolvimento e avaliao da estabilidade de formulaes cosmticas anticelulticas contendo o extrato vegetal comercial de Trichilia catigu Adr. Juss (e) Pthychopetalum olacoides benthan, padronizado em flavonides totais. 2005. 159f. Dissertao (Mestrado em Cincias Farmacuticas) Faculdade de Cincias Farmacuticas, Universidade de So Paulo, So Paulo. BARBETTA, C.M.; MAGINI, M.R. Espectros eletromagnticos na regio do infravermelho: utilizao na caracterizao de novos materiais. In: X Encontro Latino Americano de Iniciao Cientfica e VI Encontro Latino Americano de Ps-Graduao. So Jos dos Campos. Universidade Vale do Paraba. v 13, p.304-307, 2006. BARBOSA, W. L. R., Manual para anlise fitoqumica e cromatogrfica de extratos vegetais.19p,2001.Disponvel em:<http:\\www.ufpa.br/propesp/revistaic/textodidatico> Acesso em: 2008. BARNES, T.G. Fotografia da espcie Heliotropium indicum. Disponvel em: <http://plants.usda.gov/gallery/standard/hein_002_shp.jpg> Acesso em: abril de 2009. BARRY, B.W. Drug delivery routes in skin: a novel approach. Advanced Drug Delivery Reviews. Amsterdam. v.54, supl.1. p.S31-S40, 2002. BAUER, A.W.; KIRBY, W.M.M.; SHERRIS, J.C.; TURK, M. Antibiotic susceptibility testing by standardized single disk method. American Journal Clinical Pathology; 45493-6, 1966.

Referncias Bibliogrficas 127

BAUMANN, L.; WEISBERG, E. eds. Basic sciences of the epidermis. In.____.Cosmetic dermatology: principles and practice. New York: Mac Graw Hill, 2002. BAUR, B.; SCHMID, B. Spatial and temporal patterns of genetic diversity within species. In: GASTON, K.J. Biodiversity, a biology of numbers and differences. Oxford: Blackwell Science, p.169-201, 1996. BAZZO, G.C.; SILVA, M. A. S. Estudo termoanaltico de comprimidos revestidos contendo captopril atravs de termogravimetria (TG) e calorimetria exploratria diferencial (DSC), Revista Brasileira de Cincias Farmacuticas, vol. 41, n. 3, 2005. BENTHAM, G.; HOKER, J. H. Boraginaceae. In: G. Bentham & J. D. Hooker. Genera Plantarum. London, Lovell Reeve & Co., London. v. 2, p. 832-869, 1873/1876. BENY, M.G. Fisiologia da pele. Cosmetic and Toiletries. So Paulo, v.12, n.2.p.44-50, 2000. BILIA, A.R.;BERGONZI, M.C.; MORGENNI, R.; MAZZI, G.; VINCIERI, F.F. Evaluation of chemical stability of St. Johns wort commercial extract and some preparations. International Journal of Pharmaceutics. v.213, p.199-208, 2001. BIRECKA, H.; DINOLFO, T.E.;. MARTIN, W.B.; FROHLICH, M. W. Polyamines and leaf senescence in pyrrolizidine alkaloid-bearing Heliotropium plants. Phytochemistry, vol. 23, Issue 5, pages 991-997, 1984, BIRECKA, H.; FROHLICH, M.W.; HULL, L.; CHASKES, M.J.; Pyrrolizidine alkaloids of Heliotropium from Mexico and adjacent U. S.A. Phytochemistry, vol. 19. 421426. 24 spp., 1980. BRAGA, R.; Plantas do Nordeste, Especialmente do Cear, 3rd ed., Coleo Mossoroense: RN, p. 249, 1976. BRAGA, T.V.; OLIVEIRA, T.T.; PINTO, J.T.; DORES, R.G.R.; NAGEM, T.J. Determinao de massa fresca, massa seca, gua e cinzas totais de folhas de Cissus verticillata (L.) Nicolson & C. E. Jarvis subsp. verticillata e avaliao do processo de secagem em estufa com ventilao forada. Journal of Basic and Applied Pharmaceutical Sciences, v. 28, n.3, p. 287 - 290, 2007. BRANDO, M.G.L. (org.). Plantas medicinais e fitoterapia. Faculdade de Farmcia da Universidade Federal de Minas Gerais. Ed. Grfica O Lutador, Belo Horizonte, MG. 113p, 2003. BRASIL (a), Ministrio da Sade, Agncia Nacional de Vigilncia Sanitria. Resoluo da Diretoria Colegiada n de 24 de fevereiro de 2000. Aprova o 17 regulamento tcnico sobre registro de medicamentos fitoterpico. Dirio Oficial da Repblica Federativa do Brasil, Braslia, 2000.

Referncias Bibliogrficas 128

BRASIL (b), Ministrio da Sade, Agncia Nacional de Vigilncia Sanitria. Resoluo da Diretoria Colegiada n de 16 de maro de 2004 (revoga anterior. 48 Dirio Oficial da Repblica Federativa do Brasil, Braslia, 2004. BRASIL (c), Ministrio da Sade, Agncia Nacional de Vigilncia Sanitria. Decreto n 5813 de 22 de Junho de 2006. Aprova Poltica Nacional de Plantas Medicinais e Fitoterpicos. Dirio Oficial da Repblica Federativa do Brasil, Braslia, 2006. BRASIL. Ministrio da Sade. Agncia Nacional de Vigilncia Sanitria. Consulta Pblica n. 43, de 7 de julho de 2004. Determina a publicao do Guia para realizao de estudos de estabilidade de cosmticos Dirio Oficial da Unio, Braslia, DF, 7 de julho de 2004. Disponvel em http://www.anvisa.gov.br. Acesso em 11/08/2009. CAETANO, N.; SARAIVA, A.; PEREIRA, R.;CARVALHO, D.; PIMENTEL, M.C.B.; MAIA, M.B.S. Determinao de atividades antimicrobianas de extratos de plantas de uso popular como antinflamatrio. Revista Brasileira de Farmacognosia, vol. 12 (suplemento): pg. 132-135, 2002. CALIXTO, J.B. Biodiversidade como fonte de medicamentos. Revista da Sociedade Brasileira para o Progresso da Cincia, n.3, p. 37-9, 2003. CAIGUERAL, S.; DELLACASSA, E. BANDONI, A.L. Plantas medicinales y fitoterapia: Indicadores de dependencia o factores de desarrollo?. Acta Farmaceutica Bonaerense, v. 22, n.3, p. 265-278, 2003. CARLOS, L.A. Alcalides de Rauvolfia grandiflora e de Rouvolfia matteldiana (Apocynaceae). Tese (Doutorado em Produo Vegetal) Centro de Cincias e Tecnologias Agropecurias, Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro. Campos dos Goyatacazes, RJ, 2007. CASTILLO, J. Determinacion de Metabolitos Secundrios en Plantas Silvestres Del Parque Nacional Terepaima, Municipio Paravencino, Estado Lara, Tessis. Universidad Centro occidental Lisandro Alvarado, Venezuela. 103pp, 2004. CATALFAMO, J. L.; MARTIN JR., W. B.; BIRECKA, H.; Accumulation of alkaloids and their necives in Heliotropium curassaricum, H. spathulatum and H. indicum. Phytochemistry, vol. 21: 2669-2675, 1982. CHEEKE, P. R. Toxicity and Metabolism of Pyrrolizidine Alkaloids. Journal of Animal Science, vol. 66:2343-2350, 1988. CLSI, Performance Standards for Antimicrobial Disk Susceptibility Tests; Approved Standard Eighth Edition. CLSI document M2-A8 [ISBN 1-56238-485-6]. CLSI, 2003. COOPER, R.A.; HUXTABLE, R.J. The relationship between reactivity of metabolites of pyrrolizidine alkaloids and extrahepatic toxicity. Proceedings of the Western Pharmacology Society, vol. 42: 13-16, 1999.

Referncias Bibliogrficas 129

CORRA JNIOR, C.; MING, L.C.; SCHEFFER, M.C. Cultivo de plantas medicinais, condimentares e aromticas. 2 Ed. Jaboticabal: FUNEP, 162p. 1994. CORRA, M. P. Dicionrio das plantas teis do Brasil e das exticas cultivadas. Rio de Janeiro: IBDF, Ministrio da Agricultura, Imprensa Nacional, v.I a IV, 1984. CORRA, N.M.; CAMARGO JUNIOR, F.B.; IGNCIO,R.F.; LEONARDI, G.R. Avaliao do comportamento reolgico de diferentes gis hidroflicos. Revista Brasileira de Cincias Farmacuticas, So Paulo, v.41, n.1, 2005. COSTA, A. F. Farmacognosia. 2 ed. vol. III. Fundao Calouste Gulbenkian. Lisboa. 1982. CREWS, C.; KRSKA, R. Pyrrolizidine alkaloids. Bioactive Compounds in Foods, page 10-30, 2008. CULVENOR, C.C.J., M. CLARKE, J. A. EDGAR, J. L. FRAHN, M. V. JAGO, J. E. PETERSON AND L. W. SMITH. Structure and toxicity of the alkaloids of Russian comfrey (Symphytum Uplandicum Nyman), a medicinal herb and item of the human diet. Experentia 36: 377, 1980. DE CANDOLLE,A.P. Boraginaceae. In._____. Prodromus systematis naturalis regni vegetabilis. Paris: Treuffel e Wurtz, v.9,p.466-559, 1845. De PAULA, I.C. Desenvolvimento tecnolgico de forma farmacutica plstica contendo extrato seco nebulizado de Achyrocline satureioides (Lam.) DC. Compositae macela. Dissertao de Mestrado. Faculdade de Farmcia Universidade Federal do Rio Grande do Sul. Porto Alegre, 194 p, 1996. DESMICHELLE, G. O medicamento homeoptico: fabricao, controle, legislao. In: MERCIER, L. (ORG.). Homeopatia princpios bsicos. So Paulo: Organizao Andrei, p.143-149, 1987. DI STASI, L.C; HIRUMA-LIMA, C.H. Plantas Medicinais na Amaznia e na Mata Atlntica. 2 Ed. So Paulo: Editora UNESP, 592p, 2002. DI STATI, L.C. (org.) Plantas medicinais: arte e cincia. Um guia de estudo interdisciplinar. So Paulo: UNESP, 230p, 1996. DIAS, B.F.S. A implementao da conveno sobre diversidade biolgica no Brasil: desafios e oportunidades. Campinas: Andr Tosello.10p, 1996.

DUTTA, S.K; UTPAL, S.; CHAKRABORTI, S.K. A modified method of isolation of indicine N-oxide from Heliotropium indicum and its antitumor activity against Ehrlich ascites carcinoma and sarcoma 180. Indian Journal of Cancer Chemotherapy, v.9, n.2, p.73-7, 273-7, 1987.

Referncias Bibliogrficas 130

DYER, J.R. Applications of absorption spectroscopy of organic compounds. Editora Prentice Hall, Inc. Englewood Cliffs, N.J., 1965. ESTRELA, E. Tratado de Cooperao Amaznica Secretaria Protempore, Plantas medicinales Amaznicas: Realidad y Perpectativas, Lima: TCA, p.302, 1995. FALKENBERG, M.B.; SANTOS, R.I.; SIMES, C.M.O. Introduo anlise fitoqumica. Pg. 165- 181. In: SIMES C.M.O.; SCHENKEL, E.P.; GOSMANN,G. MELLO, J.C.P.; MENTZ, L.A.; PETROVICK, P.R. Farmacognosia: da planta ao medicamento. 3 Ed. Editora:UFSC, 832p., 2001. FARIA, E.A.; LEI, M.I.G., IONASHIRO M., ZUF T.O., ANTONIOSI FILHO, N.R. Estudos da estabilidade trmica de leo e gorduras vegetais por TG/DTG e DTA. Ecltica Qumica, vol. 27:1-9, 2002. FARIAS, M.R.; SIMES, C.M.O.; RECH, N.; BOFF,P.R.; STORB,B.H.; ROVARIS, D.A. Espcies vegetais empregadas na produo de fitoterpicos em Santa Catarina. In: Anais do Simpsio de Plantas Medicinais do Brasil, 12, 1994. Fortaleza, 125p. 1994. FARMACOPIA BRASILEIRA. 2 ed. So Paulo: Indstria Grfica Siqueira, 1265p, 1959. FARMACOPIA BRASILEIRA. 3. ed. So Paulo: Andrei, 1977. FARMACOPEIA BRASILEIRA. 4 ed. So Paulo: Atheneu, 1213p., 1988. FARQUHAR, J.N. Plant Sterols: Their biological effects in humans. In: OKWU DE, Emenike IN (2006) Evaluation of the phytonutrients and vitamin content of citrus fruits. International Journal of Molecular Medicine Adv. Science. 2(1): 1-6, 1996. FELSNER, M.L.; MATOS, J.R. Anlise da Estabilidade Trmica e Temperatura de Oxidao de leos Comestveis Comerciais por Termogravimetria. Anais da Associao Brasileira de Qumica, v.47, n.4, p. 308-318, 1998. FERREIRA, A.O. Guia Prtico da Farmcia Magistral. Boas Prticas de Manipulao. Juiz de Fora, p. 159-197, 2000. FLORENCE, A.T.; ATTWOOD, D. Princpios fsico qumicos em farmcia. So Paulo:Edusp, 732p, 2003. FOLDVARI,M. Non-invasive administration of drugs through the skin: challenges in delivery system designer. Pharmaceutical Science Technology Today. Oxford, v.3. n.12, p.417-425, 2000. FONSECA, P.; LIBRANDI, A.P.L. Avaliao das caractersticas fsico-qumicas e fitoqumicas de diferentes tinturas de barbatimo (Stryphnodendron barbatiman). Revista Brasileira de Cincias Farmacuticas. vol. 44, n. 2, p.271-277, 2008.

Referncias Bibliogrficas 131

FRTHER, H. Die infragenerische Gliederung der Gattung Heliotropium L. und ihre Sterllung innerhalb der subfam. Heliotropioideae (Schrad.) Arn. (Boraginaceae). Sendtnera 5: 35-241, 1998. FRESENIUS, G. Heliotropium. In: MARTIUS, C.F.P. VON; EICHLER, A.W. & URBAN, I. Flora Brasiliensis. Mnchen, Wien, Leipzig, v.8, part 1, p.3248,1857/1863. FRESENIUS,G. Cordiaceae, Heliotropiacea et Boragineae. In: MARTIUS, C.F.P.;EICHLER,A.G.; URBAN, I. (eds). Flora Brasiliensis. Lipsiae: Typographia Regia, v.9, p.1-60, 1857. FRHLICH, M. W., NASH, D. L., MORENO, N. P. Heliotropium. In: GMEZ POMPA, A. & MORENO, N.P. Flora de Veracruz. Xalapa, Instituto Nacional de Investigaciones sobre recursos Biticos, v. 18., 1981. GENNARO, A. R. Remington: A Cincia e a Prtica da Farmcia. Ed. 20. Editora Guanabara Koogan, p. 2208, 2004. GENTRY, A. R. A Field Guide to the families and genera of woody plants of the Northwest South America. Washington, DC. 1993. GIOLITO, I.; IONASHIRO, M. Nomenclatura em anlise trmica: Parte II. Cermica, So Paulo, vol. 34:163-164, 1988; GRNICHER, F.; CHRISTEN, P.; VUAGNAT, P. Rapid high-performance liquidchromatographic quantification of valepotriates in hair root cultures of Valeriana officinalis | var. sambucifolia mikan. Phytochemical Analysis, v.5, p.297, 1994. GUERRA, C.B. Biodiversidade e extino de PLANTAS MEDICINAIS In: BRANDO, M.G.L. (org.). Plantas medicinais e fitoterapia. Faculdade de Farmcia da Universidade Federal de Minas Gerais. Ed. Grfica O Lutador, Belo Horizonte, MG 37- 45p., 2003. GUERRERO, M.G.M. Obtencion y aprovechamento de extractos vegetales de Ia flora Salvadorena. 2.ed. San Salvador, El salvador: Ed. Universitaria, Universidad de El Salvador, 564p., 1994. GUPTA, P.; GARG, S. Avanos recentes nas formas de dosagem semi-slida para aplicao dermatolgica. Pharmaceutical Technology, v.6, n.3, 2002. HADGRAFT,J. Skin deep. European Journal of Pharmaceutical Biopharmaceutical. Amsterdam, v.58,n.2,p.291-299, 2004. and

HARBORNE, J.B.; MABRY, T.J.; MABRY, H. The flavonoids. New York: Academic, Part 1, p. 2-44, 1975. HIRONO, I., H. MORI AND M. HAGA. Carcinogenicactivity of Symphytum officinale. JOURNAL of the NATIONAL CANCER INSTITUTE, vol. 61:865, 1978.

Referncias Bibliogrficas 132

HUGHES, G.B. Staphylococci in community acquired infections: increased resistence to penicillin. Ann. Surg. Phyladelphia. vol. 183: 335-357, 1976. IBGE, Disponvel em: <http://www.ibge.gov.br>. Acesso em: maro de 2008. ISAAC, V.L.B.; CEFALI L.C.; CHIARI, B.G.; OLIVEIRA, C.C.L.G.; SALGADO H.R.N.; CORRA, M.A. Protocolo para ensaios fsico-qumicos de estabilidade de fitocosmticos. Revista de Cincias Farmacuticas Bsica e Aplicada, v. 29, n.1, p. 81-96, 2008. JAIN, S. C.; SINGH, B.; JAIN, R. Antimicrobial activity of triterpenoids from Heliotropium ellipticum. Fitoterapia. vol. 72, Issue 6, 666-668, 2001. JOHNSTON, I.M. Studies in Boraginaceae VII: The South American species of Heliotropium. Contributions from the Gray Herbarium of Harvard University, vol. 81: 3-73, 1928. JUNQUEIRA,L.C.;CARNEIRO,J. Histologia bsica. 10ed. Editora Guanabara Koogan, 2004. KARTAL, M.; YILDIZ S.; KAYA, S.; KURUCU, S.; TOPU, G. Antimicrobial activity of prpolis simples from two differents regions of Anatolia. Journal of Ethopharmacology, v. 86: 69-73, 2003. KINGSTON, D.G.I. High-perfomance liquid-chromatography of natural products. Journal of Natural Products, v.42, n.3, p. 237-260, 1979. KOROLKOVAS, A. A riqueza potencial de nossa flora. Revista Brasileira de Farmacognosia, v. 1, n.1, p.1-7, 1996. KOROLKOVAS, A. Anlise farmacutica. Rio de Janeiro: Guanabara Dois, 207 p., 1984. KUGELMAN, M., LIU, W.C, AXELROD, M., MCBRIDE, T.J., RAO, K.V. Indicine-Noxide: the antitumor principle of Heliotropium indicum. Lloydia. Mar-Jun; 39 (23):125-128, 1976. LACHMAN,L.; LIBERMAN, H.A.; KANG,J.L. Teoria e prtica na indstria farmacutica. Lisboa: Fundao Calouste Gulbenkian, 2001. LEITO FILHO, H.F. Consideraes sobre a florstica de florestas tropicais e subtropicais do Brasil. Instituto de Pesquisa e Estudos Florestais- IPEF, n.35, p.4146, abr.1987. LEVINSON, W.; JAWETZ, E. Microbiologia mdica e imunologia. Traduo: Jos Procpio M. Sena. 7 Ed. Porto Alegre: Artmed, 2005. LIEBERMAN, H.A; RIEGER,M.M.;BANKER,G.S. Pharmaceutical Dosage Forms Disperse systems. v.2, 2ed. Editor Marcel Dekker, p.399-421, 1996.

Referncias Bibliogrficas 133

LIMA, C.G.; VILELA, A.F.G.; SILVA, A.A.S.; PIANNOVSKI, A.R.; SILVA, K.K.; CARVALHO, V.F.M.; MUSIS, C.R.D.; MACHADO, S.R.P.; FERRARI, M. Desenvolvimento e avaliao da estabilidade fsica de emulses O/A contendo leo de babau (Orbignya oleifera). Revista Brasileira de Farmcia, v.80(3), p.239245, 2008. LINDON, J.C.; NICHOLSON, J.K.; SIDELMANN, U.G.; WILSON, I.D. Directly coupled HPLC-NMR and its application to drug metabolism. Drug Metabolic Review, v.29, n.3. p. 705-743, 1997. LINNAEUS, C. Species Plantarum. London, The Ray Society, v.1, p.130-131, 1753. LIRA,A.A.M.;SESTER,E.A.;ABREU,L.R.P.;SILVA,L.B.L.;WANDERLEY,A.G.;SANT ANA,D.P. Desenvolvimento preliminar de gel de lapachol: estudo de permeao in vitro. Revista Brasileira de Cincias Farmacuticas. Vol. 40, n.1, p. 36-41, 2004. LOPES, C.M.; LOBO, J.M.S.; COSTA,P. Formas Farmacuticas de liberao modificada: polmeros hidroflicos. Revista Brasileira de Cincias Farmacuticas, v.41, n.2. p. 143-145, 2005. LORENZI, H. Plantas Daninhas do Brasil terrestres, aquticas, parasitas e txicas. 3 Ed. Instituto Plantarum, Nova Odessa, SP, 2000. LORENZI, H.; MATOS, F.J.A. Plantas Medicinais no Brasil Nativas e Exticas. Instituto Plantarum, Nova Odessa, SP, pg. 161, 2002. MACEDO, M.; FERREIRA, A.R. Plantas medicinais usadas para tratamentos dermatolgicos, em comunidades da Bacia do Alto Paraguai, Mato Grosso. Revista Plantas, vol 1, 2004. MACHAN, T.; KORTH, J.; LIAWRUANGRATH, B.; LIAWRUANGRATH, S.; BARAMEE, A.; PYNE, S.G. Free fatty acids from the crude hexane extract of the aerial parts of Heliotropium indicum Linn. growing in Phitsanulok, Thailand. ACGC Chemical Research Communications, vol. 21, 9-12, 2007. MACHAN, T.; KORTH, J.; LIAWRUANGRATH, B.; LIAWRUANGRATH, S.; PYNE, S.G. Composition and antituberculosis activity of the volatile oil of Heliotropium indicum Linn. growing in Phitsanulok, Thailand. Flavour and Fragrance Journal Volume 21 Issue 2, p. 265267, 2006. MACIEL, R.L.; MOREIRA-CAMPOS, L.M.; SILVA, B.C.; BRANDO, M.G.L. Caractersticas fsico-qumicas e qumicas e estudo preliminar de estabilidade de tinturas preparadas com espcies de Arnica lychnophora em comparao com Arnica montana. Revista Brasileira de Farmacognosia. Vol. 16 (1): 99-104, JanMar, 2006.

Referncias Bibliogrficas 134

MAIA CAMPOS, P.M.B.G. Desenvolvimento de produtos cosmticos. Cosmetric & toiletries. Ed. Port., So Paulo, v.14, n.5, p.66-69, 2002. MALO, N.N.; ROY, R. Do medicinal plants have a place in todays medicine? Global Biodiversity, v.6, n.3, p.16-18, 1996. MARTINS, E.R.; DE CASTRO, D.M.; CASTELLANI, D.C.; DIAS, J.E. Plantas medicinais. Viosa: Universidade Federal de Viosa, 220p. 1995. MASON, P.R. Community acquired Staphylococcal skin infections in rural areas of Zimbabwe. Central African JOURNAL OF Medicine, vol. 37: 56-60, 1991. MATOS, J.R.; MACHADO, L.D.B. Anlise trmica Termogravimetria. In: CANEVAROLO JNIOR, S.V. Tcnicas de caracterizao de polmeros. So Paulo: Artliber, p. 209-228, 2004. MELO, J.I.M.; SALES, M.F. Heliotropium L. (Boraginaceae Heliotropioideae) de Pernambuco, Nordeste do Brasil. Rodrigusia , vol. 55 (84): 65-87. 2004. MELO, J.I.M.; SEMIR, J. Taxonomia do gnero Heliotropium L. (Heliotropiaceae) no Brasil. Acta botnica brasileira. vol. 22(3): 754-770, 2008. MENON, G.K. New insights into skin structure scratching the surface. Advanced Drug Delivery Reviews. Amsterdam. v.54, supl.1. p. S3-S10, 2002. MIDDLETON, E.; KANDASWAMI, C. The Impact of plant flavonoids on Mammalian biology: implications for immunity, inflammation and Cancer. In: Harbone JB (ed.) The Flavonoids: Advances in Research Since 1986. Chapman and Hall, London, 1993. MOSER,K.;KRIWER,K.;NAIR,A.;KALIA,N.;GUY,R.H. Passive skin penetration enhancement and its quantification in vitro. European Journal of Pharmaceutical and Biopharmaceutical. Amsterdam, v.52, n.2,p.103-112, 2001. MUNIRUZZAMAN, M.; CHOWDHURY,M.B.R. Sensitivity of fish pathogenic bactria to various medicinal herbs. BANGLADESH JOURNAL of VETERINARY Medicine. Vol. 2 (1): 75-82, 2004. NAIK, A.;KALIA,Y.N.;GUY,R.H. Transdermal drug delivery: overcoming the skins barrier function. Pharmaceutical Science Technology, Oxford, v.3,n.9,p.318-326, 2000. NASCIMENTO, G.G.F.; LOCATELLI, J.; FFREITAS, P.C.; SILVA, G.L.; Antibacterial activity of plants extracts and phytochemical on antibiotic-resistant bacteria. Brazilian Journal Microbiology, vol. 31: pg. 247-256, 2000. NATURAL RESOURCES CONSERVATION SERVICE. United States Department of Agriculture. Disponvel em:<http:\\www.plants.usda.gov>. Acesso em: maro de 2009.

Referncias Bibliogrficas 135

NCCLS (Clinical and Laboratory Standards Institute). Performance Standards for Antimicrobial Disk Susceptibility Tests; Approved Standards. NCCLS document M2-A8 [ISBN 1- 56238-485-6], Wayne, Pennsylvania, 2003a. NOLDIN, V.F; FILHO, V.C.; MONACHE, F.D.; BENASSI, J.C.; CHRISTMANN, I.L.; PEDROSA, R.C.; YUNES, R.A. Composio qumica e atividades biolgicas das folhas de Cynara scolymus L. (alcachofra) cultivada no Brasil. Qumica Nova, vol. 26,n.3,p.331-334, 2003.

NUNES, K.M. Caracterizao qumica e fsico-qumica e estudos preliminares de planejamento da formulao fitoterpica semi-slida contendo tintura de Calndula officinalis L. Dissertao (mestrado em Cincias Farmacuticas. rea de Concentrao: Frmacos e Medicamentos) Universidade Federal do Par, 2009. OHNUMA, T; SRIDHAR, K S; RATNER, L H; HOLLAND, J F. Phase I study of indicine N-oxide in patients with advanced cancer. Cancer treatment reports, vol. 66(7), 1509-1515, 1982. OKWU, D. E; OKWU, M. E.; Chemical compositions of Spondias mombin. ln. Plant parts. Journal of Sustained. Agriculture and Environmental, vol. 6: 140-147, 2004. OLIVEIRA, A.H.; BERRETA, A.A. Avaliao da qualidade de insumos farmacuticos a base de calndula e prpolis utilizados pelas farmcias magistrais. Revista Eletrnica de Farmcia, Vol. IV (2), 169-174, 2007. OLIVEIRA, A.N.; AMARAL, I.L. Florstica e fitossociologia de uma floresta de vertente na Amaznia Central, Amazonas, Brasil. Acta Amaznica. v. 34(1): 2134, 2004. OLIVEIRA, F.F.; PAOLA, M.V.R.; MATOS, J.R. Anlise trmica aplicada aos produtos cosmticos. Cosmeics &Toiletries, Carol Stream, v.16, n.3, p.52-54, 2004. PANDEY, D. P. et al. Oriental. Journal of Chemitral, v.12, n.3, p.321-2 (English) 1996. In: DI STASI, L.C; HIRUMA-LIMA, C.H. Plantas Medicinais na Amaznia e na Mata Atlntica. 2 Ed. Ver e ampl.- So Paulo: Editora UNESP, 592p., 2002. PANDEY, M.B; SINGH, A.K; PANDEY, D.P.; PANDEY, V.B. A new isoflavone glycoside from Heliotropium indicum. Journal of the Indian Chemical Society, vol. 84 (10), 1027-1028, 2007. PANDEY, V.B; SINGH, J.P; RAO, Y.V; ACHARYA, S.B. Isolation and Pharmacological Action of Heliotrine, the Major Alkaloid of Heliotropium indicum Seeds. American Chemical Society, vol 45(8), 229-233, 1982.

Referncias Bibliogrficas 136

PAREKH, J.; CHANDA, S.V. In vitro antimicrobial activity and phytochemical analysis of some Indian medicinal plants. Turk Journal of Biology, vol 31: 53-58, 2007. PRTILE, R. Isolamento e elucidao estrutural de compostos polares de Lippia Alba (Miller) N. E. Brown Ex Britt. & Wils. Dissertao de mestrado. Programa de ps Graduao em Farmcia. rea de concentrao: Frmacos e Medicamentos Universidade Federal de Santa Catarina. Santa Catarina: PGFAR, 2007. PHARMACEUTICAL EXCIPIENTS, CD-ROM, 2001. PORTAL DA SADE. MS elabora Relao de Plantas Medicinais de Interesse ao SUS. Disponvel em: <http:\\www.Saude.gov.br.> Acesso em: maro de 2009. PRISTA, L.N.; ALVES,A.C.; MORGADO, R.M.R Tcnica Farmacutica e Farmcia Galnica. Fundao Caloustre Gulbenkian, v. 2, 4 ed. Lisboa, 1996. PRISTA, L.N.; ALVES,A.C.; MORGADO, R.M.R. Tcnicas Farmacuticas e Farmcia galnica. Fundao Caloustre Gulbenkian: Lisboa. 3 Ed, v. II, p. 183207, 1990. QUEIROZ, E.F.; HOSTETTMANN, K. A importncia das tcnicas acopladas (CL/UV, CL/EM, CL/RMN) para procura de princpios ativos. Revista Fitos. v.2, n.3, 39-53, 2006. REDDY, J. S.; RAO, R. P.; REDDY, M. S.; J. Wound healing effects of Heliotropium indicum, Plumbago zeylanicum and Acalypha indica in rats. Journal of Ethnopharmacology, vol.79: 249-251, 2002. REINA, M.; MERICLI, A.H.; CABRERA, R.; GONZALEZ-COLOMA, A. Pyrrolizidine alkaloids from Heliotropium bovei. Phytochemistry, v.38, n.2, p.355-358, 1995. REIS, M.C.P.; LEDA, P.H.O.; PEREIRA, M.T.C.L.; TUNALA, E.A.M. Experiencia na implantao do programa de fitoterapia do municpio do Rio de Janeiro. Revista Divulgao em Sade para Debate, Rio de Janeiro, n. 30, p. 42-49, 2004. RIBEIRO, A.M.; KHURY, E.; GOTTARDI, D. Validao de testes de estabilidade para produtos cosmticos. In: 10 Congresso Nacional de Cosmetologia, 1996, So Paulo: Anais do 10 Encontro Brasileiro de Qumicos Cosmticos, So Paulo: Associao Brasileira de Cosmetologia, p. 349-375, 1996. RIEGER,M.M. Factors affecting sorption of topically applied substances. In: ZATZ, J.L. (Ed) skin permeation: fundamentals and application. Wheaton: Allured, cap.2,p.33-72, 1993. RODRIGUES, P.O.; CARDOSO, T.F.M.; SILVA, M.A.S.; MATOS, J.R. Aplicao de tcnicas termoanalticas na caracterizao, determinao da pureza e cinticas de degradao da Zidovudina (AZT). Acta Farmacutica Bonaerense. V.24(3): 383387, 2005.

Referncias Bibliogrficas 137

RODRIGUES, P.O; CARDOSO, T.M.;. SILVA, M. A.S.; MATOS, J.R. Caracterizao Termoanaltica e Estudo do Perfil de Dissoluo de Comprimidos contendo Metronidazol. Latin American Journal of Pharmacy, vol. 27 (4): 528-34, 2008. SANTOS, E.V.M. Extrao de matrias-primas vegetais. (2000) In: SHARAPIN, N. ROCHA, L.M., CARVALHO, E.S., LCIO, E.M.R.A, SANTOS, E.V.M., ALMEIDA, J.M.L. Fundamentos de Tecnologia de Produtos Fitoterpicos. Convnio Andrs Bello (CAB) e Programa Iberoamericano de Cincia e Tecnologia para o Desenvolvimento (CYTED), 248p, 2000. SANTOS, S.C., FERREIRA, F.S. ROSSI-ALVA, J. C, FERNANDEZ, L.G. Atividade antimicrobiana in vitro do extrato de Abarema cochliocarpus (Gomes) Barneby & Grimes. Revista Brasileira de Farmacognosia, vol. 17(2): 215-219, 2007. SANTOS, S.C.; MELO, J.C.P. Taninos. In: SIMES C.M.O.; SCHENKEL, E.P.; GOSMANN,G. MELLO, J.C.P.; MENTZ, L.A.; PETROVICK, P.R. Farmacognosia: da planta ao medicamento. 4 Ed. Editora: UFRGS/UFSC, 2004. SCHENKEL, E.P.; SIMES, C.M.O.; MENTZ, L.A.; IRGANG, B.E.; STEHMANN, J.R. O Espao das Plantas Medicinais e suas Formas Derivadas na Medicina Cientfica. Caderno Farmacutico, n (2), 1985. 1 SCHNITZLER, E.; PEREIRA, C. A.; CARVALHO FILHO, M. A. S. Estudo termoanaltico (TG, DTG e DSC) dos cafs in natura e processados. UEPG Ci. Exatas Terra, Cincias Agronmicas e de Engenharia, Ponta Grossa, 11 (1): 6166, 2005. SHARAPIN, N. ROCHA, L.M., CARVALHO, E.S., LCIO, E.M.R.A, SANTOS, E.V.M., ALMEIDA, J.M.L. Fundamentos de Tecnologia de Produtos Fitoterpicos. Convnio Andrs Bello (CAB) e Programa Iberoamericano de Cincia e Tecnologia para o Desenvolvimento (CYTED), 248p, 2000. SILVA JNIOR, J.O.C. Obteno e avaliao de forma farmacutica semi-slida fitoterpica contendo extrato seco por nebulizao de Symphytum officinale L. (confrei). Tese (Doutorado em Cincias Farmacuticas. rea de concentrao: Frmacos e Medicamentos) Faculdade de Cincias Farmacuticas de Ribeiro Preto, Universidade de So Paulo. So Paulo: USP-FCFRP, 2006. SILVA JNIOR, J.O.C; VIEIRA, J.L.F.; BARBOSA, W.L.R.; PEREIRA, N.L. Caracterizao fsico-qumica do extrato seco por nebulizao de Symphytum officinales L. Revista Brasileira de Farmacognosia, v.16 (supl.), 671-677, 2006. SILVA, M.I.G.; GONDIN, A.P.S.; NUNES, I.F.S.; SOUSA, F.C. Utilizao de fitoterpicos nas unidades bsicas de ateno sade da famlia no municpio de Maracana (CE). Revista Brasileira de Farmacognosia, v.16, n.14. Joo Pessoa, outdez, 2006. SILVERSTEIN, R.M.; WEBSTER,F.X.; KIEMLE,D.J. Identificao espectromtrica de compostos orgnicos. Editora LTC, 7ed., 508 pg., 2006.

Referncias Bibliogrficas 138

SIMES C.M.O.; SCHENKEL, E.P.; GOSMANN, G.; MELLO, J.C.P.; MENTZ, L.A.; PETROVICK, P.R. Farmacognosia: da planta ao medicamento. 3 Ed. Editora:UFSC, 832p., 2001. SINGH, B.; SAHU, P. M.; JAIN, S. C.; SINGH, S. Antineoplastic and antiviral screening of pyrrolizidine alkaloids from Heliotropium subulatum. Pharmaceutical Biology, vol, 40(8), 581-586, 2002. SINGH, B.; SAHU, P.M.; SINGH, S. Antimicrobial activityof pyrrolizidine alkaloids from Heliotropium subulatum. Fitoterapia, v.73, n.2, p.153-155, 2002. SINGH, J. P.; PANDEY, D. P.; PANDEY, M. B.; SINGH, A.; SINGH, R. Constituents of Heliotropium indicum. Oriental Journal of Chemistry, vol. 19(3), 723-724, 2003. SINGH, J. P.; PANDEY, D. P.; PANDEY, M. B.; SINGH, ANITA; SINGH, R Alkaloids of Heliotropium indicum. Indian Chemical Society, vol 82(2), 175-176, 2005. SOUZA, J.S.N; MACHADO, L.L; PESSOA, O.D.C.; BRAZ-FILHO, R. OVERK, C.R.; YAO, P.;CORDELL, G.A.; LEMOS, T.L.C. Pyrrolizidine Alkaloids from Heliotropium indicum. JOURNAL of Brazilian Chemical SOCIETY, VOL 16, NO 6B, 1410-1411, 2005. SRINIVAS, K.; RAO, S.S.; RAO, M.E.B.; RAJU, M.B.V. Chemical investigation on Heliotropium indicum. Indian Journal of Natural Products, vol. 18(1), 21-23, 2002. STEGELMEIER, B.L.; EDGAR, J. A. Pyrrolizidine alkaloid plants, metabolism and toxicity. Journal of Natural Toxins, vol. 8(1), 95-116, 1999. TOLEDO, A.C.O.; DUARTE, M.R.; NAKASHIMA, T. Anlise farmacognstica da droga e do extrato fluido das folhas de Symphytum officinale L. (Boraginaceae). Revista. Brasileira de Farmacognosia, v. 14, supl., p. 01-02, 2003. TORTORA, G.J.; FUNKE, B.R.; CASE, C.L. Microbiologia. Ed. Artimed. Porto Alegre-RS, 2003. TOURNEFORT, J. P. Institutiones Rei Herbariae. Paris, 1719. VAN WEEREN, P.R; MORALES, J.A; RODRGUEZ, L.L.; CEDEO, H.; VILLALOBOS, J.; POVEDA, L.J. Mortality supposedly due to intoxication by pyrrolizidine alkaloids from Heliotropium indicum in a horse population in Costa Rica: a case report. The veterinary quarterly, vol. 21(2):59-62, 1999. VELASCO-DE-PAOLA, M.V.R. Fatores que influenciam na estabilidade dos produtos cosmticos. In: Congresso Brasileiro de Cosmetologia, 15 2001. So , Paulo. Anais do Congresso, So Paulo: Associao Brasileira de Cosmetologia, p. 205-206, 2001.

Referncias Bibliogrficas 139

VILA JATO, J. L. Tecnologia farmacutica: formas farmacuticas. Madrid. Editorial Sintesis, v.1-2; 2001. WAGNER, H. e BLADT, S. Plant drug analysis: a Thin Layer Chromatography Atlas.2. Ed. Berlin: Springer, 2001. WANG, J.; WANG, C.H; WANG, Z.T. Advancement of investigation on cytotoxicity and mechanism of pyrrolizidine alkaloids. Guoji Yaoxue Yanjiu Zazhi, vol. 34(4), 246-249, 2007. WENDTLENDT, W. Thermal analysis. Jonh Wiley Song, New York. 200p., 1986. WESOLOWSKI, M., SUCHACZ, B.; KONIECZYNSKI, P. The Application of Artificial Neural Networks for the Selection of Key Thermoanalytical Parameters in Medicinal Plants Analysis. Combinatorial Chemistry & High Throughput Screening, vol. 6, 811-820, 2003. WILKINSON,J.B.;MOORE,R.J. Cosmetologia de Harry. Madrid: Diaz de Santos, p.10-11, 1990. WORLD HEALTH ORGANIZATION, Quality Control Methods for Medicinal Plant Materials. Geneve: WHO, p.3, 1992. YUNES, R.A.; PEDROSA, R.C.; FILHO, V.C. Frmacos e fitoterpicos: a necessidade do desenvolvimento da indstria de fitoterpicos e fitofrmacos no Brasil. Qumica Nova, v. 24, n. 1, p. 147-152, 2001. ZARONI, M. Polissacardeos no desenvolvimento de peletes de teofilina de liberao colnica. Dissertao de mestrado em Cincias Farmacuticas, Universidade Federal do Paran, 2006. ZAVADNACK-NETTO,M.; HERREIRO,F.; BANDEIRA,C.O.P.; ITO,Y.; CIORLIN,E.; SAQUETI,E.E.; ANSILEIRO,I.J.; GONSALVEZ,L.; SIQUEIRA,V. Staphylococcus aureus: incidncia e resistncia antimicrobiana em abcessos cutneos de origem comunitria. Acta Scientiarum, v.23, p.709-712, 2001.