DIVULGAO TCNICA Avaliao da viabilidade de culturas fngicas preservadas pelos mtodos de Castellani (gua destilada) e liofilizao.

AVALIAO DA VIABILIDADE DE CULTURAS FNGICAS PRESERVADAS PELOS MTODOS DE CASTELLANI (GUA DESTILADA) E LIOFILIZAO C.C. Aparecido1, C.T.M. Huang1*, M.M. Passador2, D. Finatti1**, M.B. Figueiredo1*** Instituto Biolgico de So Paulo, Centro de Pesquisa e Desenvolvimento de Sanidade Vegetal, Av. Cons. Rodrigues Alves, 1252, CEP 04014-002, So Paulo, SP, Brasil. E-mail christianeceriani@biologico.sp.gov.br
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RESUMO A Micoteca Mrio Barreto Figueiredo instalada no Laboratrio de Micologia Fitopatolgica do Centro de Pesquisa e Desenvolvimento de Sanidade Vegetal do Instituto Biolgico, So Paulo, foi iniciada em 1961 e conta, atualmente, com pouco mais de 600 culturas, a maioria de importncia fitopatognica. O presente trabalho teve como objetivo, avaliar a viabilidade de culturas preservadas pelos mtodos de Castellani e liofilizao. Para tanto, amostras de 145 isolados, pertencentes a diferentes gneros fngicos fitopatognicos foram transferidas para placas de Petri contendo meio batatagar-dextrose (BDA). Tais culturas encontravam-se preservadas por perodos entre 1 a 40 anos (mtodo de Castellani) e 15 a 21 anos (liofilizao). Passados 7 dias de incubao, foi observado o crescimento de 33 culturas preservadas pelo mtodo de Castellani e 17 mantidas por liofilizao. De todos isolados testados, apenas IB668 (Verticillium dahliae) apresentou amostras mantidas por ambos os mtodos viveis. Tais resultados permitem supor que o mtodo de Castellani (gua destilada) seja mais vantajoso para manter, em laboratrio, diferentes gneros e espcies de fungos. Pretende-se dar continuidade aos testes de viabilidade com outros isolados e, brevemente, realizar testes de patogenicidade, comparando a eficincia dos mtodos de preservao que apresentaram resultados positivos. PALAVRAS-CHAVE: Preservao em laboratrio, fungos fitopatognicos, viabilidade. ABSTRACT VIABILITY EVALUATION OF FUNGI CULTURES PRESERVED BY CASTELLANIS METHOD (DISTILLED WATER) AND LYOPHYZATION. The Micoteca Mrio Barreto Figueiredo installed in the Laboratrio de Micologia Fitopatolgica do Centro de Pesquisa e Desenvolvimento de Sanidade Vegetal do Instituto Biolgico, So Paulo State, Brazil, was initiated in 1961 and counts, currently, with about 611 cultures, the majority of phytopathogenic importance. The present work had as objective, to evaluate the viability of cultures preserved by Csatellanis method and liophylization. To this, samples of 145 different genera of fungi with phytopatogenic importance had been transferred to Petri plates contend potato-agar-dextrose (BDA) medium. Such cultures met preserved by periods between 1 to 40 years (Castellanis method) and 15 to 21 years (liophylization). After 7 days, it was observed the growth of 33 cultures preserved by Csatellanis method and 17 maintained by liophylization. Of all isolates tested, only IB668 (Verticillium dahliae) presented samples viable preserved for both methods. Such results allow to assume that

Universidade Estadual Paulista, Faculdade de Cincias Agronmicas, Departamento de Produo Vegetal, Botucatu, SP, Brasil. *Bolsista Apoio Tcnico CNPq. **Bolsista Iniciao Cientfica. ***Pesquisador Aposentado, Instituto Biolgico de So Paulo, Centro de Pesquisa e Desenvolvimento de Sanidade Vegetal, So Paulo, SP, Brasil.
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the Castellanis method (or distilled water) either more advantageous to keep, in laboratory, different genera and species of fungi. It is intended to give continuity to the tests of viability with other isolates and, briefly, to carry through pathogenicity tests, comparing the efficiency of the preservation methods that had presented positive results. KEY WORDS: Laboratory preservation, phytopathogenic fungi, viability. A Micoteca Mrio Barreto Figueiredo do Laboratrio de Micologia Fitopatolgica do Centro de Pesquisa e Desenvolvimento de Sanidade Vegetal do Instituto Biolgico de So Paulo, foi iniciada em 1961 e conta atualmente com cerca de 600 culturas de fungos, sendo a maior parte de interesse fitopatolgico (FIGUEIREDO & PIMENTEL, 1977). Estes fungos so de vrias procedncias do Brasil e do Estado de So Paulo pertencendo, principalmente, aos Deuteromycota (fungos mitospricos) e Chromista (Oomycota) e, eventualmente, Ascomycota. Em menor nmero, encontramse, tambm, Basidiomycota - Corticiaceae como Rhizoctonia etc. Esta coleo de culturas tem por finalidade a pesquisa, o ensino e a manuteno de pequeno patrimnio biolgico de grande importncia para a Patologia Vegetal. A grande maioria dos fungos pertencentes a esta coleo foi isolada de plantas recebidas pela clnica do Instituto Biolgico como material a ser analisado, objetivando emisso de laudo contendo a identificao do agente causal, bem como medidas de manejo e controle. Uma pequena parte proveniente de colees de outros institutos de pesquisa nacionais ou do exterior. Estes fungos so preservados pelos mtodos de repicagens peridicas, Castellani (FIGUEIREDO, 1967), liofilizao, e uma pequena parte em leo mineral (Fig. 1). Resultados obtidos em inmeras pesquisas tm permitido supor que o mtodo de Castellani seja o mais eficiente no que se refere manuteno da viabilidade, capacidade de esporulao e patogenicidade de grande nmero de culturas pertencentes aos mais variados gneros (APARECIDO & FIGUEIREDO, 1997a, 1997b; APARECIDO et al., 2001; APARECIDO et al., 2006; PASSADOR et al., 2001a; PASSADOR et al., 2001b; APARECIDO et al., 1999; FIGUEIREDO et al., 2006). Portanto, com o objetivo de avaliar a viabilidade de culturas fngicas constantes da Micoteca do Instituto Biolgico e preservadas por longos perodos pelos mtodos de Castellani (gua destilada) e liofilizao, foi realizado o presente estudo. Para verificar a eficincia dos mtodos de preservao utilizados na Micoteca do Instituto Biolgico de So Paulo, no que se refere manuteno da viabilidade, 145 amostras de diferentes isolados (gneros e espcies) foram transferidas para placas de Petri contendo meio gar-batata-dextrose (BDA). Todas as placas foram mantidas em cmara do tipo BOD, com temperatura controlada (24 C), durante 7 a 10 dias. Aps este perodo, foram observadas as caractersticas morfolgicas de cada cultura. Passados sete dias de incubao, foi observado crescimento de 33 culturas preservadas pelo mtodo de Castellani, por perodos que variaram de 1 a 38 anos e, 17 mantidas por liofilizao, por 19 at 22 anos. De todos isolados testados, apenas a cultura IB668 (Verticillium dahliae) apresentou amostras viveis mantidas por ambos os mtodos. As Tabelas 1 e 2 registram os resultados obtidos. Os resultados obtidos permitem supor que o mtodo de Castellani (gua destilada) seja mais vantajoso para manter, em laboratrio, diferentes gneros e espcies de fungos. Resultados positivos vm sendo obtidos desde 1967 por diversos pesquisadores (F IGUEIREDO, 1967; F IGUEIREDO & P I M E N T E L, 1975; FIGUEIREDO et al., 1980; RUSSOMANNO et al., 1995; PICCININ & PASCHOLATI, 1996; APARECIDO & FIGUEREDO, 1997; EGYDIO & FIGUIEREDO, 1999; PASSADOR et al., 2000; APARECIDO et al., 2001). Alm de ser uma tcnica aplicvel a grande diversidade de gneros, tambm prtico, simples, de baixo custo, evita saltaes e alteraes morfolgicas e/ou fisiolgicas que poderiam vir a ocorrer nas culturas, como resultado da preservao atravs de repicagens peridicas (P I M E N T E L & FIGUEIREDO, 1989). Essas alteraes podem ser decorrentes da constante manipulao exigida pelo mto-

Fig. 1 Mtodos de preservao de culturas fngicas utilizados na Micoteca do Instituto Biolgico. A mtodo de Castellani (gua destilada); B Repicagens Peridicas; C Liofilizao.

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Tabela 1 - Amostras viveis de culturas fngicas fitopatognicas preservadas pelo mtodo de Castellani (gua destilada). Cultura IB156 IB186 IB235 IB239 IB247 IB262 IB268 IB288 IB328 IB443 IB643 IB668 IB669 IB741 IB752 IB760 IB789 IB791 IB829 IB917 IB7/75 IB1/78 IB3/83 IB1/93 IB4/95 IB3/00 IB2/01 IB9/01 IB31/04 IB50/04 IB55/04 IB02/05 IB03/05 Espcie Phytophthora capsicii Beauveria bassiana Ceratocystis fimbriata Cylindrocladium citri Verticillium dahliae Gloeosporium musarum Cylindrocladium iliciola Alternaria sp. Cylindrocladium scoparium Alternaria citri Mycosphaerella melonis (Dydimella bryonide) Verticillium dahliae Verticillium dahliae Ceratocystis fimbriata Verticillium dahliae Curvularia lunata Ascochyta phaseolorum Ascochyta sp. Verticillium dahliae Helminthosporium sp. Verticillium albo-atrum Bipolaris orizae Colletotrichum sp. Trichoderma viridii Verticillium dahliae Botrytis sp. Verticillium dahliae Verticillium dahliae Cylindrocladium sp. Volutela sp. Fusarium oxysporum f. dianthi Fusarium oxysporum Rhizoctonia sp. Hospedeiro Cacau (mudas) Milho parqasitado (nodonata) Mangueira (mudas) Berinjela Banana Eucalipto Rainha margarida (haste e folhas) Eucalipto Tangerina Mamo Tomateiro Berinjela Hypocryplalus Amendoim Arroz (folhas) Berinjela (planta hbrida) Couve-flor Berinjela Gengibre Batata Arroz (folhas) Citrus sinensis Plantao cacau (solo) Roseira Grbera Quiabo Jil Eucalipto (folhas) Alface dgua Dianthi caryophyllus (cravo) Ruta sp. (arruda) Diets sp. (moria) Tempo de preservao 12 anos e 7 meses 11 anos e 8 meses 11 anos 11 anos e 10 meses 5 anos e 8 meses 7 anos e 11 meses 5 meses 10 anos e 11 meses 10 anos e 11 meses 12 anos 11 anos e 11 meses 2 anos e 6 meses 4 anos e 9 meses 4 anos 11 anos 37 anos e 6 meses 11 anos e 11 meses 11 meses 11 anos e 6 meses 13 anos 12 anos 12 anos e 3 meses 22 anos 10 anos 12 anos e 11 meses 8 anos 5 anos 5 anos 2 anos e 3 meses 3 anos e 7 meses 3 anos e 4 meses 1 ano e 2 meses 2 anos e 9 meses

do, uma vez que a cada trs ou quatro meses pequena poro de fungo+meio deve ser transferida para um novo tubo, devido ao consumo do meio de cultura e/ou ao acmulo de metablitos excretados durante o desenvolvimento do microrganismo no substrato (FIGUEIREDO et al., 1980). Deve-se ressaltar tambm que, normalmente, as amostras mantidas por repicagens peridicas so armazenadas, normalmente, temperatura ambiente, estando expostas s alteraes que possam vir a ocorrer. Tais alteraes elevam a freqncia de mutaes e, como resultado, a cultura pode vir a ser perdida (A PARECIDO & FIGUEIREDO, 1997). Com relao liofilizao, embora j tenha sido constatado sucesso com grande nmero de culturas fngicas, freqentemente bem sucedida com espcies que esporulem, desde que possuam esporos de

paredes espessas e resistentes. Isto porque o processo realizado (congelamento e dissecao vcuo) bastante agressivo e, mesmo sendo empregadas substncias protetoras, na maioria das vezes as estruturas no suportam o mtodo (FIGUEIREDO & P IMENTEL, 1975; ASHCAR et al., 1988; PITTOMBO, 1989; SCHOELEIN-CRUSIUS et al., 1993). Talvez, por esse motivo, de todas as amostras testadas, somente algumas poucas se apresentavam viveis, podendo estas amostras serem mantidas agora, tambm, pelos demais mtodos utilizados para a preservao da coleo em laboratrio. Pretende-se dar continuidade aos testes de viabilidade com outros isolados e, brevemente, realizar testes de patogenicidade, comparando a eficincia dos mtodos de preservao que apresentaram resultados positivos, ou seja, amostras viveis.

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Tabela 2 - Amostras preservadas pelo mtodo de liofilizao. Cultura IB03 H IB04 H IB42 H IB67 H IB 71H IB33 IB334 IB352 IB355 IB373 IB446 IB448 IB454 IB4507 IB571 IB668 IB766 Espcie Ceratocystis fimbriata Ceratocystis fimbriata Pithomyces sp. Pithomyces sp. Pithomyces sp. Mucor plumbeus Aspergillus flavus Aspergillus flavus Aspergillus candidus Fusarium oxysporum Aspergillus flavus Actinomyces scabeis Aspergillus flavipes Aspergillus wentii Beauveria bassiana Verticillium dahliae Verticillium dahliae Hospedeiro Populus sp. Brachiaria decumbens Brachiaria decumbens Brachiaria decumbens Citrus sp. (laranja) Citrus sp. (laranja) Solanum tuberosum (batata) Fungo entomgeno Fungo entomgeno Lycopersicum sculentum (tomateiro) Solanum melogena (berinjela) Tempo de preservao 19 anos e 10 meses 19 anos e 10 meses 19 anos e 5 meses 20 anos e 10 meses 20 anos e 10 meses 20 anos e 11 meses 19 anos e 11 meses 21 anos e 10 meses 21 anos e 11 meses 20 anos e 10 meses 22 anos 20 anos e 11 meses 21 anos e 9 meses 21 anos e 3 meses 21 anos e 2 meses 20 anos e 9 meses 20 anos e 8 meses

REFERNCIA APARECIDO, C.C. & FIGUEIREDO, M.B. Manuteno das caractersticas originais de diferentes fungos fitopatognicos preservados por perodos superiores vinte anos. Arquivos do Institituo Biolgico, So Paulo, v.64, p.59, 1997a. Suplemento. APARECIDO, C.C. & FIGUEIREDO, M.B. Estudos sobre a manuteno da viabilidade de patogenicidade de Fusarium moliniforme var. subglutinans, agente causal da gomose em abacaxi, por trs diferentes mtodos. Revista do Ncleo de Pesquisas FCEE Universidade Mackenzie, v.1, n.1, p.148-151, 1997b. APARECIDO, C.C.; E GYDIO, A.P.M.; FIGUEIREDO, M.B. Eficincia do mtodo de Castellani (gua destilada) para a preservao de fungos fitopatognicos. In: REUNIO CIENTFICA EM CINCIAS AGRRIAS DO LAGEADO, 6., 1999, Botucatu, SP. Resumos. Botucatu: FCA-UNESP, 1999. p.42. APARECIDO, C.C.; E GYDIO, A.P.M.; FIGUEIREDO, M.B. Avaliao de trs mtodos para preservao de fungos fitopatognicos. Summa Phytopathologica, v.27, p.421-424, 2001. APARECIDO, C.C.; FINATTI, D.; F IGUEIREDO, M.B.; F IGUEIREDO, D.S.Y.; LESSIN, R.C. Viabilidade e patogenicidade de duas espcies de Fusarium mantidas em laboratrio por diferentes mtodos. Fitopatologia Brasileira, v.31, p.S 25, 2006. Suplemento. FIGUEIREDO, M.B. Estudo sobre a aplicao do mtodo de Castellani para conservao de fungos patgenos em plantas. Biolgico, So Paulo, v.33, p.9-13, 1967.

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Recebido em 7/1/07 Aceito em 25/3/07

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