Inhoudsopgave

1 Introductie 2 Methodes 2.1 Celkweek en passaging-methode 2.2 Western Blot Methode . . . . . 2.3 PCR-methode . . . . . . . . . . 2.4 ELISA-methode . . . . . . . . . 3 Resultaten 3.1 Celculturen . . . . 3.2 Resultaten Western 3.3 Resultaten PCR . 3.4 Resultaten ELISA 4 Discussie 5 Referenties 3 6 6 8 11 16 19 19 20 21 24 27 30

. . . .

. . . .

. . . .

. . . .

. . . .

. . . .

. . . .

. . . .

. . . .

. . . .

. . . .

. . . .

. . . .

. . . .

. . . .

. . . .

. . . .

. . . .

. . . .

. . . Blot . . . . . .

. . . .

. . . .

. . . .

. . . .

. . . .

. . . .

. . . .

. . . .

. . . .

. . . .

. . . .

. . . .

. . . .

. . . .

. . . .

. . . .

. . . .

. . . .

. . . .

. . . .

. . . .

. . . .

. . . .

Epigenetic manipulation of the inammatory response of brain macrophages

I. Beijert A. Brandsma M. Coenen M. Ekkel E. Jutten H. Luiting F. van der Wal* Y. Von Brucken Fock Mentor: H. Boddeke
Department of Neuroscience, section: Medical Physiology *f.van.der.wal.4@student.rug.nl Mentor group number: 3

Samenvatting Microglia are brain macrophages which maintain brain homeostasis. Upon brain damage or infection microglia are activated and induce inammation. Pro-inammatory activation of microglia is mediated by epigenetic processes. Most likely histone modication, particularly acetylation is crucially involved. Histones are acetylated by histone acetylases (HATs) and deacetylated by histone deacetylases (HDACs). Recent research has shown that HDAC inhibitors suppress the inammatory eect of macrophages. Therefore, it could be that microglia are inuenced likewise. Possibly this anti-inammatory mechanism could be of therapeutic relevance for neurodegenerative diseases such as Alzheimers disease. As a measure for pro-inammatory microglia activation in vitro, the production of cytokines interleukin-6 (IL-6) and tumor necrosis factor (TNF- ) has been used. Pro-inammatory activation was induced in mouse microglia and the mouse microglia cell line BV2 by the bacterial cell wall component lipopolysaccharide (LPS; 100 ng/ml). HDAC inhibition was induced by treatment with trichostatin-A (TSA; 30 nM). PCR was used to measure cytokine production at RNA level and ELISA measurements were done to determine cytokine release. LPS induced a pro-inammatory cytokine (IL-6 and TNF-) production at RNA and protein level in both microglia and BV2 cells. This eect was inhibited by pretreatment with HDAC inhibitor (TSA). The results clearly show that the HDAC inhibitor TSA inhibits pro-inammatory activation of microglia. Future experiments are needed to investigate whether a similar eect is found in vivo. This would make HDAC inhibitors possibly applicable for further clinical research.

Introductie

Het zenuwstelsel van het menselijk lichaam wordt onderverdeeld in het centrale zenuwstelsel en het perifere zenuwstelsel. Gezamenlijk bestaat dit uit meer dan honderd miljard zenuwcellen, ook wel neuronen genoemd. Het centrale zenuwstelsel bestaat uit de hersenen en het ruggenmerg, waarin de neuronen (de zenuwcellen) worden ondersteund door zogenoemde gliacellen. Alle gliacellen tezamen worden ook wel de neuroglia genoemd. De gliacellen ondersteunen de neuronen zowel metabool als mechanisch en kunnen een rol spelen bij de impulsoverdracht. Het aantal gliacellen is tien keer groter dan het aantal neuronen. De neuroglia zijn onder te verdelen in astrocyten, oligodendrocyten, microglia en ependymcellen. Astrocyten spelen een rol bij de voeding van neuronen, ze prolifereren bij beschadiging van het zenuwstelsel (waarbij ze de lege ruimtes opvullen) en groeifactoren. Daarnaast hebben ze nog vele andere regulerende functies en ze kunnen onderverdeeld worden in breuze astrocyten, voorkomend in de witte stof en protoplasmatische astrocyten, met allerlei vertakte, korte uitlopers. Op guur 1 zijn breuze astrocyten te zien en op guur 2, afbeelding B protoplasmatische astrocyten, waarbij het pijltje wijst naar het hersenoppervlak.

Figuur 1: Fibreuze astrocyten

Figuur 2: Protoplasmatische astrocyten, microgliacellen en oligodendrocyten

Oligodendrocyten zijn cellen die minder vaak voorkomen dan astrocyten. Ze zijn kleiner dan astrocyten en ze zijn minder vertakt. Ze liggen in rijen tussen axonbundels en dienen als isolatiemateriaal. Ze vormen myelineschedes doordat 3

uitlopers van de oligodendrocyten zich om de axonen wikkelen. Op guur 2, afbeelding D zijn enkele oligodendrocyten zichtbaar. De microgliacellen (guur 2, afbeelding C) zijn kleine cellen met een ovale kern en kleine uitlopers die her en der verspreid in het centrale zenuwstelsel aanwezig zijn. Ze bevatten talrijke lysosomen en op het moment dat er celverval is ronden zij zich af, worden beweeglijk en gaan fagocyteren (opeten). Ze ruimen degenerende cellen op, en ze scheiden ook allerlei ontstekingsmediatoren uit, zoals proteasen, cytokinen, chemokinen en oxidatieve radicalen.1 De microgliacellen zijn dus eigenlijk de afweercellen van het centrale zenuwstelsel. Activatie van macrofagen zoals de microgliacellen kan leiden tot de productie van allerlei pro-inammatoire enzymen en afweereiwitten, die kunnen leiden tot chronische inammatoire ziektes, zo liet een studie door Duitse onderzoekers zien dat microglia een rol spelen bij de ziekte van Alzheimer. 2 Microgliacelactivatie is over het algemeen ongungstig voor het hersenweefsel. De microgliacel kan ervoor kiezen om de zenuwcel te repareren of om de zenuwcel te doden en te fagocyteren. Bij het laatste komen er ontstekingsmediatoren vrij die het weefsel rondom kunnen beschadigen. Dat is in hersenweefsel natuurlijk geen gewenst gevolg. Een voorbeeld van een ongewenst gevolg is, zoals genoemd, de ziekte van Alzheimer. Verminderen van deze ontsteking zou dus wellicht een positief eect kunnen hebben op neurodegeneratieve ziekten zoals de ziekte van Alzheimer. DNA in de chromosomen is gecondenseerd, het zit strak in elkaar gewikkeld. Een chromosoom is eigenlijk een DNA-molecuul in een verpakking die tienduizend keer kleiner is dan de oorspronkelijke DNA-lengte. Het gecondenseerde DNA zit weer gewikkeld om nucleosomen, die weer uit histoneiwitten bestaan. Er ontstaat als het ware een kralenkettingstructuur. De histoneiwitten hebben uiteinden die naar buiten gericht zijn. Als deze gemethyleerd worden (histonmethylering), wordt de chromatine gecondenseerd. Gevolg is dat het DNA wordt uitgeschakeld.3 Histonacetylering is het proces waarbij een acetyl groep afsplitst van een acetyl-CoA intermediair en vervolgens bindt aan de histonstaarten. Deze reactie wordt gekatalyseerd door de HATS, histon-acetyltransferases. Die bindingen zorgen als het ware voor een gerelaxeerde structuur van het chromatine en dat zorgt voor een verhoogde binding van transcriptiefactoren aan DNA uit de kern en het verhoogt de kans op transcriptie. Deacetylering is het verwijderen van deze acetylgroepen en dit wordt dan ook gedaan door HDACs. Dit verlaagt dus de transcriptie van bepaalde fragmenten DNA. De HDACs van zoogdieren worden onderverdeeld in klasse I, II en III HDACs.4 Figuur 3 geeft een vereenvoudigde weergave van deze processen.

Figuur 3: HDACs en HATS

Remming van deze HDACs (door middel van HDAC-remmers als sodium butylaat, benzamides en cyclische peptides) zorgt voor een een toename van gehyperacetyleerde nucleosomen in de meeste gebieden van het chromosoom, maar heeft slechts eect op een kleine subset van die genen. Het zorgt dus voor een transcriptionele activatie van een aantal genen , maar zorgt daarbij voor onderdrukking van een gelijk of zelfs hoger aantal andere genen.5 De transcriptie zou dus af kunnen nemen door deze HDAC-remmers. Als gevolg daarvan zouden er minder cytokines geproduceerd kunnen worden waarna er dus een minder heftige ontstekingsreactie ontstaat. Dit eect is waargenomen in perifere macrofagen.6 In ons onderzoek bekijken we het eect van deze HDAC-remmers in microgliacellen en onderzoeken we of de ontsteking afneemt door toediening van deze HDAC-remmers.

2
2.1

Methodes
Celkweek en passaging-methode

Er worden in dit onderzoek gebruik gemaakt van cellen van het muizenbrein. De hersenen worden ge soleerd, jngesneden en in suspensie gebracht. Een protease verbreekt hierbij de weefselverbindingen tussen de cellen. Zo krijg je individuele microglia cellen. Door het mengsel door een spuit te persen, wordt de suspensie gelterd. Hierbij worden de microglia gescheiden van het celafval. Er worden twee soorten cellen gekweekt: microgliacellen en een reserve lijn die lijkt op macrofagen. De cellen worden in een medium gebracht. Dit medium is een voedingsbodem voor de cellen, want de cellen hebben voeding nodig om te kunnen proleren. Een medium bestaat uit een basaal en een meer gespecialiseerd medium dat geschikt is voor bepaalde type cellen. Het basale medium is ongeveer gelijk aan de interstitiele vloeistof omdat cellen hier goed in groeien. Het bevat onder andere de volgende componenten: Natriumchloride Aminozuren Suikers Vitaminen Groeifactoren Het meer gespecialiseerde medium is een DMEM 30-2006 (Dulbeccos modied eagles medium) compositie. Deze DMEM compositie bevat: 2,5 mM L-glutamine 15 mM HEPES 0,5 mM natriumperuviaat 1200 mg/L natrium bicarbonaat De 30-2002 DMEM bevat: 4 mM L-glutamine 4500 mg/L glucose 1 mM natriumperuviaat 1500 mg/L natrium bicarbonaat Het bicarbonaat wordt gebruikt als buer omdat bicarbonaat de voornaamste buer in ons lichaam is. Dit is om de pH constant te houden. De pH heeft invloed op het celmetabolisme, eiwitsynthese en groei. De bicarbonaatbuer gaat volgens de onderstaande reactie:
HCO3 + H + H2 CO3 CO2 + H2 0

Naast DMEM wordt een serum toegevoegd. Dit is een foetaal kalf serum (FCS). Dit serum voorziet het medium van groeifactoren en het blokkeert trypsine bij het kweken. Trypsine is niet gunstig voor de cellen omdat het eiwitten afbreekt. Om de pH van het serum goed in de gaten te houden, wordt een indicator toegevoegd. Deze is van nature roze/oranje bij een pH van 7,0. Wanneer de nutrinten door de cellen worden opgenomen, daalt de pH en wordt het medium e geel. Het medium moet dan vervangen worden. Ook kan de indicator naar roze/paars en dit betekent dat het serum alkalisch is geworden. De cellen gaan dan dood. Zodra de cellen ge soleerd zijn, wordt er alleen nog gewerkt in een zogenaamde owkast, zie guur 4. Hierin wordt steriele lucht geblazen zodat eventuele verontreinigingen niet bij de celkweek kunnen komen. Voordat er in de owkast gewerkt kan worden, moet alles worden gereinigd met 70% ethanol, of door een vlam worden ontsmet.

Figuur 4: Flowkast De celsuspensie wordt verspreid in een T-75 es (zie guur 5) waarin de cellen goed kunnen groeien in het medium. Een T-75 es is een 75 cm2 grote kweekes met een dop.

Figuur 5: T-75 es Elke dag moet het medium worden vervangen, anders wordt het zuur. Dit wordt gedaan met een afzuigpipet. Hiermee zuig je het oude medium op, en breng je een nieuw medium aan. De cellen groeien in een incubator (zie guur 6) bij 37 graden Celsius, 5,0% CO2 en 100% luchtvochtigheid. Er wordt gewacht tot er 80% conuentie is ontstaan. Dit houdt in dat het oppervlak voor 80% met cellen is bedekt. Dit is te zien onder de microscoop. De cellen moeten dan worden verdeeld over nieuwe T-75 essen, omdat er anders contactinhibitie optreedt en 7

de cellen doodgaan.

Figuur 6: Incubator Het verdelen van de cellen over nieuwe esjes wordt gedaan door eerst weer het medium eruit te zuigen afzuigpipet. Vervolgens wordt een bueroplossing in de T-75 essen ingespoten en een trypsine oplossing die verdund is met PBS en EDTA. De trypsine wordt gebruikt om dode celresten en eiwitten te verwijderen. De PBS maakt cellen schoon en EDTA is een stof die calciumionen bindt. Dit alles zorgt ervoor dat de microgliacellen loslaten van de bodem van de T-75 es. De overige cellen blijven vastzitten. Daarna worden de microgliacellen overgebracht in zogenaamde Wells. Deze Wells worden dan in de incubator worden gezet en de cellen kunnen gaan groeien.

2.2

Western Blot Methode

Bij de Western Blot methode wordt aan de hand van bijvoorbeeld eiwitgewicht en lading specieke eiwitten gedetecteerd, hetzij semi-kwantitatief. Dit proces vindt plaats in een aantal stappen. Vernietiging van celwand Als eerste wordt de celwand vernietigd door middel van een techniek waarbij ultrasone geluidsgolven het membraan van de cel stukmaken. Hierdoor komen de eiwitten uit de cel vrij. Ze worden als het ware stuk geschud. Vervolgens vindt er een proces plaats waardoor de eiwitten uit hun oorspronkelijke 3D-structuur worden geknipt en op deze manier geprepareerd worden om de geleiding in de gel mogelijk te maken. Isolatie van eiwitten De eiwitten worden ge soleerd uit het mengsel door middel van gel elektroforese, waarbij ze gescheiden kunnen worden door een verschil bijvoorbeeld moleculaire grootte, elektrische lading of een combinatie van deze factoren, waarbij dit hoofdzakelijk gebeurt door een verschil in moleculaire grootte. In ons geval gebruiken we polyacrylamide gels en buers met natriumdodecylsulfaat, waarbij in acht genomen moet worden dat de eiwitten reeds zijn behandeld waardoor secundaire en tertiaire structuren verdwenen zijn. De polyacrylamide gel zorgt ervoor dat de eiwitten gedenatureerd blijven dus niet terugvallen in hun 3D-structuur. Ze worden vervolgens bedekt in het negatief geladen natriumdodecylsulfaat en 8

zullen vervolgens richting de positief geladen elektrode migreren. Kleinere, dus lichtere eiwitten doen dit sneller, waardoor er een scheiding ontstaat op basis van grootte en gewicht. Bij de gel elektroforese verplaatsen de eiwitten zich naar de positieve pool, die onderaan zit, waar dus de negatief geladen moleculen naartoe migreren. Hoe groter het molecuul, des te trager dit gaat. Deze gel bestaat uit de standaard acrylamidegel en de stacking gel. Deze stacking gel is bedoeld om de monsters mooi uit de slotjes te laten komen. Samenstellingen van deze gel: Acrylamide pH=8,8 4,7 ml 3,1 ml 4,6 ml 0,1 ml 62,5 l 6,25 l Acrylamide pH=6,8 1,3 ml 2,5 ml 6,1 ml 0,1 ml 50 l 10 l

Acrylamide 40% 1,5M Tris HCL, pH 8,8 of 6,8 Water 10% SDS APS 10% TEMED

Wanneer de gel basis is gemaakt, wordt de gel in een reservoir met bueroplossing gelegd, zie guur 7. Ter hoogte van de negatieve pool wordt het mengsel van eiwitten dat gescheiden moet worden ge njecteerd, waarna er een spanning wordt aangelegd. In guur 7 zijn deze zichtbaar als groene streepjes. Als je de spanning in het reservoir laag laat, zullen de snelste moleculen zich volledig banen door de gel. De eiwitoplossing is gekleurd en daardoor is zichtbaar waar de snelste eiwitten zich bevinden. De kleurstof is kleiner dan de kleinste eiwitten en zal daardoor als eerste aankomen bij de positieve zijde.

Figuur 7: De gel wordt in een reservoir met bueroplossing geplaatst

In totaal zijn er 8 slotjes gebruikt, hieronder de verdeling: Laan 1 2 3 4 5 6 7 8 Inhoud Leeg Eiwitmarker Controlegroep primaire microglia Primaire microglia + HDAC-remmers Controlegroep cellijn microglia Cellijn microglia + HDAC-remmers Controlegroep cellijn macrofagen Cellijn macrofagen + HDAC-remmers

Vervolgens worden er verscheidene stoen gebruikt om de moleculen zichtbaar te maken. De gescheiden eiwitten worden van de gel overgebracht op een nitrocellulosemembraan waar ze aanhechten, dit wordt blotten genoemd. Hieraan worden gelabelde specieke antilichamen toegevoegd zodat je kunt zien wanneer ze aan het juiste eiwit gebonden zijn. Zie guur 8.

Figuur 8: Western Blot transfer van scheidingsgel naar nitrocellulosemembraan. Aezen van de Western Blot In ons onderzoek wordt resultaat gemeten aan incubatie van het western blot met een substraat dat reageert met een enzym dat is gebonden aan een secundair antilichaam. Deze zijn uorescent gelabeld. In ons onderzoek zoeken wij naar de Acetyl-H3 groep. Als deze dus gebonden wordt door een primair antilichaam en dit primaire antilichaam vervolgens gebonden wordt aan een secundair antilichaam met uorescente eigenschappen zal dit eiwit oplichten bij detectie door een fotosensor. Er zal dan een streep zichtbaar zijn op de Western Blot en aan de hand van de eiwitmarker kun je het gewicht aezen en daarmee het soort eiwit, zie guur 9.

10

Figuur 9: Voorbeeld van een Western Blot. Links is de eiwitmarker te zien, aan de hand van deze marker zou je kunnen vaststellen of er een eiwit aanwezig is en in welke hoeveelheid.

2.3

PCR-methode

Toepassingen PCR Polymerase chain reaction (PRC) wordt gebruikt om vele kopien te maken van e DNA. Het multiceren van het DNA kan verschillende doeleinden hebben, zoals het aantonen van een stuk DNA of mRNA. Werking PCR Bij PCR wordt er DNA polymerase gebruikt om DNA templates te kopiren. e Door herhaling van dit proces kunnen grote hoeveelheden van DNA gesynthetiseerd worden. De polymerase wordt begeleid door primers die binden aan het begin en einde van het te kopiren DNA. De primers zorgen voor het 3 en 5 e begin voor de DNA polymerase zodat de replicatie kan beginnen. De nucleotide volgorde van het begin en eind moeten bekend zijn om de benodigde primers te produceren. Bij elke ronde van replicatie worden dubbel strengs DNA onafhankelijk gerepliceerd. Na vele rondes is het DNA exponentieel toegenomen, vaak loopt het aantal op tot in de miljoenen. PCR is zo gevoelig dat zelfs met een enkele DNA streng dit proces mogelijk is. Voorbereiding Cellen Bij een PCR zijn er cellen nodig om te onderzoeken. Deze cellen moeten nauwkeurig voorbereid worden. Voor het onderzoek zijn er BV2 cellen gebruikt. Dit is een cellijn die zeer lijkt op microgliacellen, maar verkorte uitlopers hebben. Dit onderzoek heeft 10 groepen die op verschillende manier zijn behandeld: 2x BV2 2x BV2 + LPS 2x BV2 + TSA 2x BV2 + LPS + TSA 2x Water

11

LPS is een stofje dat zeer lijkt op een bacteriewand en hierdoor een nietspecieke afweerreactie veroorzaakt. TSA is een HDAC remmer. We verwachten dat deze de afweerreactie remt. Om te zorgen dat het DNA zich exponentieel kan vermeerden is er een PCR master mix noodzakelijk. Deze master mix bevat alle stoen en enzymen om deze vermeerdering mogelijk te maken zodra het proces van PCR wordt gestart. De master mix bestaat uit het volgende, aan elke groep wordt eenmaal deze mix toegevoegd. 2.5 l 10x PCR buer 1.5 l 25 mM MgCl2 1.5 10 M primer mix (IL-6 en TNF-) 0,25 l 10 mM dNTPs 0.05 l 5 U/l Taq DNA polymerase 19.2 l water De totale mix heeft een volume van 25 l. In totaal worden 5x een master mix gevormd met de IL-6 primer en 5x met een TNF primer. Op deze manier wordt er op verschillende manieren gekeken of de afweerreactie ook daadwerkelijk plaatsvindt. Uiteindelijk worden dus de volgende mixen gevormd die gebruikt kunnen worden voor PCR door toevoeging van 1 l van de verschillende BV2 mixen: BV2 + MM (IL-6) BV2 + MM (IL-6) + LPS BV2 + MM (IL-6) + TSA BV2 + MM (IL-6) + LPS + TSA MM (IL-6) + Water BV2 + MM (TNF-) BV2 + MM (TNF-) + LPS BV2 + MM (TNF-) + TSA BV2 + MM (TNF-) + LPS + TSA MM (TNF-) + Water Na deze voorbereiding van de cellen kan vervolgens de voorbereiding van de PCR gestart worden. Isolatie RNA Stap 1: openbreken van de cel: Om de inhoud van de cel vrij te laten komen moet eerst de cel kapot worden gemaakt. Dit gaat door middel van ultrasone geluidgolven die het membraan 12

van de cel stukmaken, dit heet sonicatie. Door gedurende vijf seconde ultrasone trillingen de oplossing in te sturen, wordt het celmembraan en daarmee de cel kapot getrild. Stap 2: Scheiden van celresten Door de oplossing te centrifugeren worden alle niet oplosbare zware deeltjes naar beneden getrokken terwijl de oplosbare deeltjes en lichtere niet oplosbare deeltjes blijven drijven. De waterige oplossing bevat het DNA, mRNA en eiwitten. Deze laag wordt gebruikt voor de volgende stappen. Stap 3: Verwijderen Eiwitten De eiwitten worden gescheiden van het DNA en mRNA door middel van een fenol, chloroform en isoamyl oplossing toe te voegen. DNA zal wederom in de waterige oplossing blijven met het mRNA, terwijl de eiwitten neerslaan. Stap 4: mRNA isoleren Reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) In dit onderzoek wordt gekeken naar de invloed van HDAC remmers op de aanmaak van cytokinen door Microgliacellen. De hoeveelheid cytokinen die worden geproduceerd door Microgliacellen moet dus worden gemeten. In dit onderzoek zijn het aantal mRNA moleculen die voor cytokinen coderen in de cel gemeten. Eerst zijn de mRNA moleculen ge soleerd en daarna is er gekeken hoeveel van deze mRNA moleculen die voor cytokinen coderen er aanwezig. De techniek die hiervoor gebruikt is wordt reverse transcription polymerase chain reaction genoemd. Reverse Transcription Het mRNA molecuul is ge soleerd uit de cel. Dit mRNA molecuul moet nu worden omgeschreven tot complementary DNA (cDNA). Stap 1: Hybridiseren met poly (t) primer Aan het mRNA wordt een kleine oligonucleotide toegevoegd, die complementair is aan de poly-A staartaan het 3 eind van het mRNA. Deze bindt aan de polyA-staart. Deze kan vervolgens werken als primer voor het reverse transcriptase. Stap 2: Maken van DNA-kopie van het RNA door middel van reverse transcriptase Vanaf de primer wordt nu door reverse transcriptase een complementaire DNA streng aan de RNA streng gebonden. Zo wordt er door het reverse transcriptase een DNA/RNA helix gevormd. Stap 3: Bewerken van het RNA met RNase H Er wordt RNase H toegevoerd aan de DNA/RNA helix. Deze zorgt ervoor dat er gaten ontstaan in het RNA molecuul. Er worden steeds meer stukjes RNA weggehaald, totdat er een enkelstreng DNA molecuul overblijft. De stukjes overgebleven RNA op het DNA molecuul kunnen dienen als primer voor het DNA transcriptase.

13

Stap 4: Synthetiseren van een complementaire DNA streng met behulp van DNA polymerase; RNA-fragmenten fungeren als primer. Door DNA polymerase wordt er langs de DNA streng een complementaire DNA streng gemaakt. Dit zorgt ervoor dat er een dsDNA molecuul ontstaat. Met dit dsDNA molecuul kan PCR worden uitgevoerd. We zijn nu van een mRNA molecuul naar een dsDNA molecuul gegaan. Dit wordt reverse transcriptase genoemd. Polymerase chain reactie Het dsDNA wordt vermenigvuldigd. Hier wordt gebruik gemaakt van de PCR techniek. Stap 1: Heat to separate strands Het dsDNA moet eerst uit elkaar gaan zodat er 2 enkelstrengs DNA moleculen ontstaan. Dit wordt bereikt door het dsDNA molecuul te verhitten tot 95 graden Celsius. Dit zorgt ervoor dat de waterstofbruggen tussen de twee DNA stengs worden verbroken zodat er twee enkelstrengs DNA moleculen ontstaan. Stap 2: Hybridization of primers Nadat de strengen zijn gescheiden, wordt het DNA afgekoeld. Dit gebeurt in de aanwezigheid van een overschot aan twee primer DNA oligonucleotiden. Deze primers binden vervolgens aan complementaire gebieden van de twee DNA stengen. Stap 3: DNA synthese vanaf de primer Aan de mix van DNA en primers wordt DNA polymerase en de vier desoxyribosenucleoside trifosfaten toegevoerd. Dit zorgt ervoor dat er DNA wordt gesynthetiseerd, vanaf de twee primers. De uitkomst is dus dat je van 1 dsDNA molecuul 2 dsDNA moleculen hebt gemaakt. Als de 3 stappen zijn verlopen kan de cyclus weer opnieuw beginnen bij stap 1. Bij de tweede cyclus wordt er uit 2 dsDNA moleculen 4 dsDNA moleculen gemaakt. Bij de derde cyclus uit 4 dsDNA moleculen 8 dsDNA moleculen, etcetera. In guur 10 is te zien dat door de primers op een bepaalde plaats te laten hybridiseren, je kunt bepalen welk gedeelte van het DNA molecuul je wilt laten dupliceren. Aezen resultaten PCR Wanneer de PCR is voltooid moeten de resultaten nog afgelezen worden. Dit wordt gedaan door middel van elektroforese. De samples worden in wellen ge njecteerd van een agarose gel die in TAE is gekookt. Het doel van de elektroforese is het scheiden van het DNA naar grootte. Hoe groter het DNA, hoe moeilijker het is om door de gel te bewegen. DNA is negatief geladen en zal dus naar het positieve punt worden getrokken. Daarnaast wordt er ook een referentie sample toegevoegd om af te kunnen lezen hoe groot de stukjes DNA zijn. Omdat het DNA niet zichtbaar is voor het oog, wordt er ook een oranje kleurstof aan elke sample toegevoegd zodat men kan zien of het sample ook juist is ge njecteerd in de wel. Nadat de gel met de samples in een bad heeft 14

gelegen voor 45 minuten op 80 V wordt de gel uit het bad verwijderd en in een ultraviolette scanner gelegd (Bio-rad). Op deze manier kan de intensiteit worden afgelezen van de bandjes DNA die zijn ontstaan en kunnen er conclusies gevormd worden (zie guur 11).

Figuur 10: PCR-methode

15

Figuur 11: Gel elektroforese

2.4

ELISA-methode

In ons onderzoek gebruiken we ELISA voor het detecteren van de cytokines in het medium waarin de cellen hebben gezeten. ELISA is een test waarbij macromoleculaire stoen zoals eiwitten kunnen worden gemeten waarbij we uitgaan van het binden van antigeen aan antistoen. In ons onderzoek beschikken we over een microtiterplaat waarin reeds een laag met captured antibody aangebracht was. In de wells willen we aantonen dat er cytokines geproduceerd zijn en dan wel in meer of mindere mate. We hebben de cellen uit de cellijn BV2 op vier verschillende methoden geprepareerd: er zijn niet behandelde cellen, met LPS behandelde cellen, met TSA behandelde cellen en cellen die behandeld zijn met zowel TSA als LPS. Deze cellen hebben we vervolgens geltreerd en de oplossing die overbleef bevatte dus geen cellen meer maar bestond enkel uit het medium met daarin de eventueel vrijgekomen cytokines. Overzicht van de microtiterplaat TNF (pg/ml) 500 250 125 62.5 31.3 15.6 0 CTRL LPS TSA TSA+LPS IL-6 (pg/ml) 500 250 125 62.5 31.3 15.6 0

Van de cytokines die we onderzoeken hebben we in de te onderzoeken wells

16

100 l medium in de wells gepipetteerd. In ons onderzoek gebruikten we de sandwich ELISA methode, die uit een aantal stappen bestaat. Eerst worden de wells gecoat met een antilichaam dat bindt aan de antistoen die in de wells worden toegevoegd. In ons geval betreen deze antistoen dus de stoen TNF en IL-6, die in het medium worden toegevoegd aan de wells. Zie guur 12.

Figuur 12: Capture antibody

Deze antistoen kunnen binden aan de antilichamen waarmee de plaat reeds gecoat is, waarna de plaat gewassen wordt. Zie guur 13.

Figuur 13: Binden van antistoen

Een volgend speciek antilichaam wordt toegevoegd, dit bindt aan het antigeen of in ons geval de stofjes waar we naar op zoek zijn: TNF- en IL-6. Dit verklaart de naam sandwich Elisa, waarbij de antistoen als het ware tussen een sandwich (twee antilichamen) liggen Zie guur 14.

Figuur 14: De sandwich structuur

Vervolgens worden er secundaire antilichamen toegevoegd die aan het constante gedeelte van de antilichamen binden die als laatste toegevoegd zijn. Dit zijn enzym-gelinkte antilichamen. Dit is te zien als het donkergroene bolletje in guur 15. De plaat wordt opnieuw gewassen zodat de ongebonden antilichaam-enzymen verwijderd worden. 17

Figuur 15: Toevoegen van secundaire antilichamen

Vervolgens wordt er een chemische stof toegevoegd die omgezet wordt door het enzym dat aan het secundaire antilichaam vastzit, wat zorgt voor een kleur, uorescente of chemisch signaal. Zie guur 16.

Figuur 16: Omzetten van chemische stof

De resultaten die uit ons onderzoek naar voren komen kunnen we aezen middels een uorescence microplate reader. Dit apparaat meet de hoeveel cytokines in picogrammen aan de hand van de totale uorescentie die te zien is in de wells. Een voorbeeld van een dergelijke microplaatlezer is te zien in guur 17.

Figuur 17: Microplaatlezer

18

3
3.1

Resultaten
Celculturen

In guur 18 zijn onze verschillende celculturen weergegeven. Boven: de primaire vorm van microgliacellen, hoewel deze cellen niet zo geramiceerd zijn als in het brein hebben deze cellen in kweek kleine uitlopers. Midden: Gekweekte vorm van microgliacellen, deze cellen zijn lijken op de primaire vorm van microgllia, maar hebben minder uitlopers. Onder: Macrofagen, deze cellen hebben een vergelijkbare functie in het lichaam als microgliacellen in het brein. Deze cellen hebben een afgeronde vorm en dienen als controle van het onderzoek.

Figuur 18: Celculturen van microgliacellen en macrofagen, 100x vergroot onder een Zeiss Axioskop 40 lichtmicroscoop, waarbij een 10x objectief gebruikt is.

19

3.2

Resultaten Western Blot

Western blot analyse van H3 acetylering in microglia cellen

Figuur 19: Resultaten Western Blot

Bij deze Western blot experimenten is gebruik gemaakt van primair gekweekte muizen microglia, RAW cellen (een muizen macrofaag cellijn) en BV2 cellen (een muizen microglia cellijn). Deze cellen zijn deels voorbehandeld met TSA (30nM). Na isolatie zijn de eiwitfracties op gel gebracht en na de electroforese gemarkeerd met een antilichaam tegen acetyl H3. Zoals al in de methode omschrijving is beschreven, zullen alleen de bandjes op het membraan die acetyl H3 bevatten een uorescent signaal afgeven. Primaire microglia cellen: Op de Western blot is te zien dat voor de controlegroep cellen, die niet zijn behandeld met TSA, geen Acetyl H3 bandje te zien is. Dit betekent dat de H3 histonen niet geacetyleerd zijn. Bij de microglia cellen die wel behandeld zijn met TSA (30 nM) is wel een bandje te zien. Dit betekent dat deze histonen wel geacetyleerd zijn. Microglia cellijn (BV2 cellen): Op de Western Blot is te zien dat de controlegroep, die niet is behandeld met TSA, een licht Acetyl H3 bandje te zien is. Dit bandje valt echter in het niet

20

bij het bandje van de behandelde groep, en dus is de controlegroep veel minder geacetyleerd. Bij de microglial cellijn die wel behandeld is met TSA is wel een bandje te zien. Dit betekent dat deze histonen wel geacetyleerd zijn. Macrophage celline (RAW): Op de Western Blot is te zien dat de controlegroep, die niet is behandeld met TSA, een licht Acetyl H3 bandje te zien is. Dit bandje is echter veel lichter dan het bandje van de behandelde groep, en dus is de controlegroep veel minder geacetyleerd. Bij de macrofaag cellijn die wel behandeld is met TSA is wel een bandje te zien. Dit betekent dat deze histonen wel geacetyleerd zijn. De Total H3 (17 kDa) is dezelfde Western Blot, maar dit keer gekleurd met een antilichaam voor H3 histonen. Dit is onder de H3 Acetyl Western Blot gezet om aan te geven hoeveel H3 histonen er in het prote isolaat zitten. ne

3.3

Resultaten PCR

Cytokine transcriptie in primair gekweekte microglia: IL-6

Figuur 20: Cytokine transcriptie in primair gekweekte microglia: IL-6

Bij de controlegroep van de primair gekweekte microglia is te zien dat zonder behandeling er geen transcriptie plaats vindt van IL-6 mRNA. Er is dan ook nauwelijks een bandje zichtbaar op het blot. In de graek in guur 20 is duidelijk zichtbaar dat vier uur behandeling met LPS (dosis) zorgt voor een grote verandering in het transcriptie level. Er is in deze vier uur na de behandeling dus heel veel IL-6 mRNA aangemaakt. Ook op het blot is dit goed te zien. Het bandje van LPS is heel licht en intens, wat duidelijk maakt dat behandeling met LPS aanzet tot IL-6 mRNA stimulatie. Wanneer de cellen worden behandeld met TSA gebeurt er niks, er vindt geen stimulatie van IL-6 plaats. Ook dit is te zien op het blot, het bandje is weer nauwelijks zichtbaar en staat gelijk aan het bandje van de controlegroep waar ook geen stimulatie van IL-6 MRNA plaats vond. Bij voorbehandeling van TSA en daarna behandeling met LPS (TSA+LPS) is te zien dat TSA het eect van IL-6 sterk onderdrukt. Er vindt wel transcriptie plaats van IL-6 mRNA maar veel minder dan wanneer er alleen behandeld

21

wordt met LPS. Er is een licht bandje te zien. Cytokine transcriptie in de primair gekweekte microglia: TNF-

Figuur 21: Cytokine transcriptie in de primair gekweekte microglia: TNF-

Bij de controlegroep van de primair gekweekte microglia in guur 21 is te zien dat er zonder behandeling geen transcriptie plaats vindt van TNF- mRNA. Er is dan ook nauwelijks een bandje zichtbaar op het blot. In de graek is het duidelijk zichtbaar dat vier uur behandeling met LPS zorgt voor een grote verandering in het transcriptie level. Er is in deze vier uur na de behandeling dus heel veel TNF- mRNA aangemaakt. Ook op het blot is dit goed te zien. Het bandje van LPS is heel licht en intens, wat duidelijk maakt dat behandeling met LPS aanzet tot TNF- mRNA stimulatie. Echter vindt er wel minder stimulatie plaats van TNF- mRNA in verhouding tot IL-6 mRNA. Wanneer de cellen worden behandeld met TSA gebeurt er niets, er vindt geen stimulatie van TNF- plaats. Ook dit is te zien op het blot, het bandje is nauwelijks zichtbaar en staat gelijk aan het bandje van de controlegroep waar ook geen stimulatie van TNF- MRNA plaats vond. Bij voorbehandeling van TSA en daarna behandeling met LPS (TSA+LPS) is te zien dat TSA het eect van TNF- onderdrukt. Er vindt wel transcriptie plaats van TNF- mRNA maar veel minder dan wanneer er alleen behandeld wordt met LPS. Echter in verhouding met de afname van de transcriptie van IL-6 bij TSA+LPS is de afname van de transcriptie van TNF- hier wel minder. Cytokine transcript prole in Microglial cell line (BV2): IL-6 In deze graek (guur 22) is te zien dat bij de transcriptie van IL-6 mRNA in BV2 cellen hetzelfde gebeurt als bij de transcriptie van IL-6 mRNA in de primary microglial cultures. Echter is alles wel ietwat minder sterk . Er vindt minder transcriptie plaats van IL-6 mRNA bij stimulering met LPS in BV2 cellen dan in de primary microglial cultures en ook is de afname van de transcriptie door TSA+LPS in verhouding minder bij de BV2 cellen.

22

Figuur 22: Cytokine transcript prole in Microglial cell line (BV2): IL-6

Cytokine transcript prole in Microglial cell line (BV2): TNF-

Figuur 23: Cytokine transcript prole in Microglial cell line (BV2): TNF-

In deze graek in guur 23 is te zien dat bij de transcriptie van TNF- mRNA in BV2 cellen hetzelfde gebeurt als bij de transcriptie van TNF- mRNA in de primary microglial cultures. Echter is alles hier ook ietwat minder sterk . Er vindt minder transcriptie plaats van TNF- mRNA bij stimulering met LPS in BV2 cellen dan in de primary microglial cultures en ook is de afname van de transcriptie door TSA+LPS in verhouding minder bij de BV2 cellen.

23

3.4

Resultaten ELISA

In guur 24 wordt in twee diagrammen de resultaten van de ELISA weergegeven. Links worden van LPS gestimuleerde primary microglial cultures de eecten van TSA op de productie van TNF- weergegeven. Het rechterdiagram geeft deze eecten weer op de productie van IL-6.

Figuur 24: Eect van TSA op LPS gemedieerde pro-inammatoire vrijlating in primaire microglia kweek

In de controlegroep van de primary microglial cultures is te zien dat er nauwelijks TNF- geproduceerd is. Het aantal TNF- pg/ml ligt bij de 0. Hetzelfde geldt voor IL-6. In de controle groepen zijn dus geen cytokines gevormd door de cellen. Het medium van de cellen die gestimuleerd waren met LPS bevatte zeer veel cytokines. In ons experiment is 5000 Pg/ml TNF geproduceerd en 240 Pg/ml Il-6. Cellen die enkel gestimuleerd zijn met TSA hebben geen TNF- of IL-6 geproduceerd. Beide graeken laten geen staaf zien en dit betekent 0 Pg/ml TNF- en IL-6. Wanneer de cellen gestimuleerd zijn met zowel LPS als TSA is er wel TNF- gevormd, namelijk ongeveer 500 Pg/ml. Dit is sterk verminderd ten opzichte van de cellen die enkel met LPS zijn gestimuleerd. Daar is de geproduceerde hoeveelheid TNF- ongeveer 5000 Pg/ml. Wanneer we kijken naar de geproduceerde hoeveelheid IL-6 zien we hetzelfde. Er is wel degelijk IL-6 gevormd, namelijk 80 Pg/ml, tegenover 240 Pg/ml Il-6 wanneer de cellen enkel zijn gestimuleerd met LPS en geen TSA toegediend hebben gekregen. Als we kijken naar de productie van TNF- is het verschil tussen de cellen gestimuleerd met LPS en die met LPS en TSA groter dan wanneer we dit ver-

24

schil bekijken bij de productie van IL-6. Uit bovenstaande graeken blijkt dat het blootstellen van primary microglial cultures aan LPS de productie van de ontstekingsmediatoren TNF- en IL-6 stimuleert. De productie van deze ontstekingsmediatoren werd geremd door de toediening van TSA. Dit remmende eect werd sterker waargenomen bij de productie van TNF-. De twee diagram-

Figuur 25: Het eect van TSA op LPS gemedieerde pro inammatoire vrijlating in microglia cel lijn BV2

men in guur 25 laten de resultaten zien van de ELISA in de microglial cell line BV2. Links worden van LPS gestimuleerde cellen de eecten van TSA op de productie van TNF- weergegeven. Het rechterdiagram geeft deze eecten weer op de productie van IL-6. De resultaten in de microglial cell line BV2 laten hetzelfde patroon zien als de resultaten van de ELISA van de primary microglial cultures. In de controlegroep, waarbij geen LPS of TSA werd toegediend, is een kleine hoeveelheid TNF- geproduceerd. Deze hoeveelheid is zeer klein en ligt dichtbij de 0 Pg/ml. Productie van de cytokine Il-6 werd helemaal niet waargenomen. Wanneer de cellen werden gestimuleerd met LPS had dit een sterk eect op de cytokine productie. 7900 Pg/ml TNF- werd gevormd en 525 Pg/ml IL-6. Stimulatie van de cellen met enkel TSA had geen eect op de productie van zowel TNF- en IL-6. Beide graeken laten waarden zien van 0 Pg/ml. Cellen gestimuleerd met LPS en TSA produceerden 3500 Pg/ml TNF-. Dit is meer dan de helft minder dan wanneer zij niet waren gestimuleerd met TSA. Het verschil hierin bij de productie van IL-6 is groter. Cellen die enkel gestimuleerd waren met LPS produceerden 530 Pg/ml Il-6 tegenover 80 Pg/ml Il-6 wanneer zij zowel met LPS als met TSA waren gestimuleerd. Uit deze graeken kunnen we concluderen dat het blootstellen van microglial cell line BV2 aan LPS de productie van de ontstekingsmediatoren TNF- en IL-6 stimuleert. Het toedienen van TSA aan deze cellen remt deze productie van mediatoren wel degelijk. De productie van IL-6 wordt hierbij meer gereduceerd dan de productie van TNF-. Uit beide experimenten, zowel het experiment met de primary microglial cultures als het experiment met de microglial cell line BV2, blijkt dat TSA een remmende werking heeft op de productie van de ontstekingsmediatoren TNF-alpha en IL-6 van cellen die gestimuleerd zijn met LPS. Bij de primary microglial cultures is deze remmende werking op de

25

productie van TNF- sterker dan bij de productie van IL-6. Bij de microglial cell line BV2 waren de uitkomsten juist andersom. Hierbij werd de productie van IL-6 juist meer geremd door het TSA dan de productie van TNF-.

26

Discussie

Microglia zijn de cellen die in ons onderzoek centraal stonden. Deze cellen zijn de macrofagen van de hersenen. Zodra er lichaamsvreemde stoen hun micromilieu binnenkomen ronden ze zich af en gaan ze de indringers te lijf door middel van fagocytose. De uitlopers van de microglia trekken zich dan in en als er cellen defect zijn kiezen zij ervoor om deze te regenereren of degenereren. Microgliacellen lijken zoals gezegd op macrofagen, dus ze scheiden bij deze reactie cytokines uit. Echter, hersenweefsel dat aangetast wordt door de ontsteking die volgt op de activatie van de microgliacellen regenereert moeilijk. Zo krijg je dus al snel een reactie die uiteindelijk voor meer schade zorgt dan het geval zou zijn als er geen cytokines zouden worden uitgescheiden. Bij neurodegeneratieve ziekten zoals Alzheimer is dit het geval. Neuronen raken hierbij beschadigd door de cytokines die worden uitgescheiden, waarna men vergeetachtig kan worden, persoonlijkheidsveranderingen kan doormaken of er verlies van spraak optreedt.7 HDACs (histone-deacetylases) zijn enzymen die een rol spelen bij het verwijderen van acetylgroepen van histonstaarten. Dit proces heet deacetylering. Dit zorgt voor een verlaagde transcriptie van bepaalde fragmenten DNA. Uit onderzoek is gebleken dat het remmen van deze HDACs kan zorgen voor een verminderde productie van cytokines, waarna er een minder heftige ontstekingsreactie ontstaat. Dit lijkt enigszins tegenstrijdig, want op het moment dat de HDACs geremd worden, gaat de transcriptie van fragmenten DNA omhoog. Gevoelsmatig lijkt het dan logisch dat de productie van cytokines door de cel ook omhoog gaat. Echter, door deze verhoogde transcriptie kunnen er ook factoren extra worden geproduceerd die juist de aanmaak van cytokines remmen, waardoor er per saldo toch een lagere uitscheiding van cytokines mogelijk is. In ons onderzoek bekijken we het eect van deze HDAC-remmers op microgliacellen en kijken we of de ontsteking afneemt door toediening van deze HDAC-remmers. Het onderzoek is opgedeeld in een aantal stappen. Voor het detecteren van eiwitten, mRNA en cytokines hebben we drie verschillende methodes gebruikt. Daarvoor hadden we verschillende cellijnen nodig. Eenvoudig gezegd hadden we de beschikking over drie celculturen: Primaire microglia Cellijn microglia (BV2) Cellijn macrofagen (RAW) Bij de Western Blot methode waren we op zoek naar de acetyl-H3 (histon 3) groep in deze cellijnen. Al deze celtypes hebben we zowel behandeld als nit e behandeld met HDAC-remmers. Wat we verwachten te zien, was dat er acetylering optreedt in de cellen die behandeld zijn met de HDAC-remmers, omdat daar de deacetylering wordt geremd. De Western Blot-methode wordt gebruikt om eiwitten op eiwitgewicht en lading te selecteren en is dus geschikt om deze acetylgroepen te detecteren. Vervolgens hebben we door middel van de RT-PCR techniek gekeken of er ook mRNA werd aangemaakt voor cytokines op het moment dat cellen werden voorbehandeld met LPS, en of deze cytokineaanmaak ook onderdrukt werd als er een HDAC-remmer als TSA werd toegevoegd. Hierbij is speciek gekeken naar mRNA van de cytokines IL-6 en TNF- en de transcriptie van de cytokines in 27

de primaire microglia en de microglia cellijn (BV2). Bij deze methode hebben we dus de transcriptie van cytokines op mRNA-niveau in kaart gebracht. Bij de derde methode, de ELISA, hebben we daadwerkelijk gekeken naar de eiwitten, te weten TNF- en IL-6, die uitgescheiden waren in het medium van de primaire microglia en de BV2 cellijn. Met deze methode, een zogeheten sandwich-methode, is het mogelijk cytokines zoals TNF- en IL-6 te detecteren door middel van antilichamen die binden aan de betreende cytokines. Mochten al deze drie methodes erop wijzen dat een HDAC-remmer als Trichostatin-A zorgt voor.. Een verhoogde histonacetylering in microglia Lagere hoeveelheden mRNA voor cytokines in geactiveerde microglia Lagere hoeveelheden cytokines uitgescheiden door geactiveerde microglia .. dan is het dus aannemelijk dat een HDAC-remmer als Trichostatin-A de aanmaak van cytokines als IL-6 en TNF- onderdrukt. Zoals in de resultaten te zien is, is dit ook het geval. Helaas is bij ons onderzoek de macrofagencellijn verloren gegaan. In de Western Blot hebben we nog gebruik gemaakt van deze cellijn, maar de RTPCR en de ELISA hebben we enkel met de primaire microglia cultuur en de microglia cellijn uitgevoerd. Dit gaf ons de verwachte resultaten, maar deze konden we helaas niet vergelijken met de RAW-lijn. Uit het onderzoek zijn geen resultaten die afwijken van onze verwachtingen naar voren gekomen. Uit de onderzoeksmethodes is gebleken dat (voorbehandelde) cellen na stimulatie met LPS verhoogde hoeveelheden cytokines uitscheiden en dat dit na toediening van TSA (drastisch) verminderd is. De methodes Western Blot, RT-PCR en ELISA hebben we slechts n keer ee uitgevoerd. We hebben alle experimenten wel gedaan met verschillende cellijnen, maar het zou misschien kunnen dat de resultaten die wij hebben verkregen uit ons onderzoek met de cellijn microglia BV2 voor een andere cellijn microglia anders zijn. Daarvoor hadden we dus meerdere cellijnen kunnen gebruiken. Statistisch gezien hadden we beter elk experiment een X aantal keer kunnen doen en vervolgens bekijken of de resultaten met elkaar overeenkomen. Toch zijn de resultaten wel overtuigend, aangezien uit elke methode blijkt dat er gebeurt wat wij verwacht hadden. De cytokines die in onze methodes werden gedetecteerd (of het mRNA daarvan) waren de cytokines IL-6 en TNF-. Van deze cytokines werd de aanmaak onderdrukt. Maar dit zijn niet de enige cytokines die uitgescheiden worden door microglia, sterker nog, er worden talloze cytokines uitgescheiden door microglia die wij niet mee hebben genomen in ons onderzoek. Cytokines die worden uitgescheiden door microglia, die we in ons onderzoek niet meegenomen hebben en waar we in een vervolgonderzoek eventueel naar zouden kunnen zoeken zijn: IL-3, IL-6, IL-8. IP-10, MCP-1, MDC, MIP-2, RANTES, TNF-, MIP-3-, etcetera.8 Dat de aanmaak van IL-6 en TNF- wordt onderdrukt wil nog niet meteen zeggen dat de aanmaak van al die andere cytokines k wordt onderoo drukt. Dit zou dus een goede reden voor vervolgonderzoek kunnen zijn. De HDAC-remmer in ons onderzoek betrof TSA, oftewel Trichostatin-A. Dit is slechts n HDAC-remmer, terwijl er meerdere selectieve HDAC-remmers ee beschreven worden in de literatuur. Wat neurodegeneratieve ziekten betreft

28

is het aantal remmers wat gelimiteerd. Inderdaad is TSA (trichostatin-A) de meest gebruikte HDAC-remmer in experimenten, maar het is niet de enige. Andere HDAC-inhibitors zijn SD (sodium butyrate), PB (phenyl butyrate), VPA (valpro nezuur) en vorinostat, die allen bekend staan om het vermogen om de bloed-hersenbarri`re te penetreren.9 In vervolgonderzoeken zou je dus e naast TSA ook deze HDAC-remmers kunnen gebruiken. Daarbij hebben we getest met microglia die uit muizenhersenen afkomstig zijn. De vraag is of deze microglia dezelfde eigenschappen hebben als microglia uit onze hersenen. Stel dat de HDAC-remmers een heel ander eect op mensenhersenen hebben, is ons onderzoek dan nog wel zo representatief? Je zou dus vervolgonderzoek kunnen doen met menselijke microglia en indien je daar soortgelijke resultaten vindt als in dit onderzoek heeft dat meer betekenis voor de bestrijding van neurondegeneratieve ziekten. Of dit ethisch gezien een haalbare optie is, is een tweede. Verder wordt er nu enkel gekeken naar microglia in vitro. Hoewel ze wel in condities worden gehouden die ervoor zorgen dat ze kunnen overleven en die daarmee wel wat overeenkomsten vertonen als in vivo, zou dit onderzoek representatiever zijn als het onderzoek werkelijk gedaan wordt in vivo. In de hersenen bindt bijvoorbeeld het isoquinoline PK11195 aan de bindingsplaats PBBS op microglia, maar alleen indien deze microglia geactiveerd zijn, dus niet als deze in ruste zijn. Als dit PK11195 gelabeld wordt met koolstof-11, kun je door middel van beeldvormende technieken als PET inammatoire en neurodegeneratieve ziekten in kaart brengen. 10 Door middel van deze of soortgelijke technieken zou je wellicht de aanmaak en uitscheiding van cytokines in vivo in kaart kunnen brengen, eerst op niveau van proefdieren en later, als dat mogelijk is, in mensen.

29

Referenties
1. L.C. Junqueira en J. Carneiro, Functionele Histologie, elfde druk, 2010: hoofdstuk 9: zenuwweefsel. 2. Lev Osherovich, Managing microglia in Alzheimers, april 2010, online gepubliceerd 3. Alberts et al., Essential Cell Biology, 3e druk, 2010: hoofdstuk 5: DNA and Chromosomes en hoofdstuk 8: Control of Gene Expression 4. N. Sengupta en E. Seto, Regulation of histone deacetylase activities, september 2004. Uit Journal of Cellular Biochemistry 5. D.M. Vigushin en R.C. Coombes, Targeted histone deacetylase inhibition for cancer therapy, maart 2004. Uit Current Cancer Drug Targets 6. W. Chong et Al, Anti-inammatory properties of histone deacetylase inhibitors: a mechanistic study, februari 2012 7. Internationale stichting Alzheimer onderzoek, http://www.alzheimer.nl, Symptomen van Alzheimer 8. U.K. Hanisch et al. Glia, Microglia as a source and target of cytokines, oktober 2002 9. E. Hahnen et al., Histone deacetylase inhibitors: possible implications for neurodegenerative disorders, 2008

10. R.B. Banati, Visualising microglial activation in vivo, november 2002

30