INGENIERIA BIOQUIMICA III (Diseo de biorreactores) Oscar Monroy Hermosillo Departamento de Biotecnologa Universidad Autnoma Metropolitana Objetivos 1.

Que alumno comprenda el concepto de velocidad de reaccin, aprenda a medir las velocidades de reaccin y calcular las constantes cinticas en los diferentes sistemas. 2. Adiestrar al alumno en la aplicacin de balances de masa y energa y los tipos de cinticas para disear biorreactores.

1) INTRODUCCION Todo proceso industrial debe ser diseado para transformar las materias primas, a travs de varias operaciones y reacciones, al menor precio y para producir un bien. El ingeniero bioqumico debe saber disear tanto las operaciones unitarias, (transformaciones fsicas) como los reactores (transformaciones qumicas) para obtener un buen producto. La parte mas delicada del proceso, la que el ingeniero bioqumico debe entender y dominar es el cambio bioqumico. Para poder disear un biorreactor el ingeniero bioqumico se debe contestar estas preguntas: 1. Que cambios espera que ocurran? Hasta donde va a llegar la reaccin, va a liberar o a necesitar calor (termodinmica). 2. Que tan rpido se desarrollarn? Si es muy rpida, entonces los datos termodinmicos de equilibrio sern suficientes, si no es tan rpida, entonces se requiere conocer la cintica de la reaccin y la transferencia de calor y masa. 3. Cmo se van a mover y hacer contacto las partculas que toman parte en la reaccin? Que tanto y que tan pronto se mezclan? Su estructura y propiedades permiten el contacto con otros reactivos? Dejarn pasar el calor producido o requerido? Con las respuestas se debe poder encontrar una ecuacin de diseo o de comportamiento del reactor. condiciones salida = f(cond entrada, cintica, contacto) Con esta ecuacin se pueden comparar diseos y condiciones diferentes, seleccionar el mejor y disear reactores de mayor tamao. Tipos de reacciones Hay homogneas si se llevan a cabo en una sola fase y heterogneas si se llevan a cabo en dos o mas fases. En estas ltimas, los fenmenos de transporte se vuelven importantes pues la masa o el calor al pasar de una fase a la otra pueden llegar a frenar o limitar la reaccin.

Definicin de velocidad de reaccin La velocidad de reaccin esta influenciada por la composicin y energa (temperatura) del fluido. La velocidad de las reacciones -qumicas y bioqumicas- depende de la temperatura y de la composicin del medio. La temperatura afecta la constante especfica de reaccin (k) y la composicin (S) que define propiamente la funcin de la velocidad de reaccin. en donde rs = k*f(S) k = f(T)

1.1 Efecto de la temperatura en la velocidad de reaccin El intervalo de temperaturas capaz de activar a las enzimas para llevar a cabo las reacciones bioqumicas esta normalmente entre -5 y 95oC. El crecimiento y el metabolismo son el resultado de varias reacciones bioqumicas acopladas. Los procariotes se clasifican de acuerdo al intervalo de temperaturas a las que crecen segn se muestra en el cuadro 1.1. CUADRO 1.1 CLASIFICACION DE MICROORGANISMOS EN TERMINOS DE LA INFLUENCIA DE LA TEMPERATURA EN LA CONSTANTE DE LA VELOCIDAD DE CRECIMIENTO grupo mnima ptima mxima -------------------------------oC ---------------------------------40 a 45 55 a 75 60 a 80 10 a 15 30 a 45 35 a 47 19 a 22 30 a 35

termoflicos mesofilicos psicroflicos obligados -5 a 5 15 a 18 facultativos -5 a 5 25 a 30 ---------------------------------------------------------

La influencia de la temperatura esta explicada por la teora cintica que dice que la energa cintica depende nicamente de la temperatura absoluta. Arrhenius en 1889 la describe en su ecuacin emprica: k = A exp(-Ea/RT) . . . . . . . . . . . (1) en donde: k=la constante especfica de la velocidad de reaccin [dependen del orden de reaccin] A = factor de frecuencia (de colisiones totales entre las moleculas que reaccionan) [las de k] Ea = es la energa de activacin [J/mol] (Figura 1). R = constante general de los gases ideales [8.314 J/mol.oK] T = temperatura absoluta [oK] El trmino exp(-Ea/RT) proviene de la ley de distribucin de Boltzmann y aqu significa la fraccin de colisiones moleculares que poseen una energa mayor que o igual a la energa de activacin Ea.

Einterna

tiempo Figura 1.1 Diagrama esquemtico de la energa de activacin de una reaccin. (Williams y Williams pag 316) Midiendo la cintica de una reaccin para obtener la k o la rs (si es a concentracin constante) a diferentes temperaturas y tomando el logaritmo natural de la ecuacin 1, se pueden obtener los valores de A y de Ea como se ilustra en la figura 1.2.
-3 -4 -5

ln k

-6 -7 -8 -9 -10 0.0028

0.0029

0.003

0.0031

0.0032

0.0033

0.0034

0.0035

1/T (1/K)

Figura 1.2. La grfica de la ecuacin de Arrhenius que muestra los lmites impuestos por la temperatura de desactivacin de las enzimas. (Ollis y Bailey 133) El cuadro 1.2 muestra algunos valores de la energa de activacin para diferentes reacciones qumicas y bioqumicas. Se puede apreciar que las primeras tienen valores mas altos, indicando una mayor dependencia en la temperatura. Incluso

los valores para las esterilizaciones indican una mayor dependencia en la temperatura. CUADRO 1.2 ENERGIA DE ACTIVACION DE ALGUNAS REACCIONES CARACTERISTICAS. ------------------------------------------------------------------------------------------------------Reaccion Ea Temperatura (Kj/mol) (oC)___________ Crecimiento celular A. niger 58 20-37 E. coli 55 23-37 K. aerogenes 59 20-40 E. coli 119 12-26 Desactivacin Acido flico 70 100 Tiamina 92 102 Pasteurizacin 337 63 74 Esterilizacin B. stearothermophilus 283 125 B. subtilis 318 125 C. botulinum 343 125 Reaccin qumica hidrogenacin de etileno catalizada 53 77 homognea 179 77 descomposicin NO3 58 n.r. acido trimetil actico 274 n.r. eter diproplico (cat) 119 n.r. eter diproplico 253 n.r. H2O2 (no catalizada) 75 (Cat con I-) 56 (Cat Pt coloidal) 49 (Cat con catalasa 23 --------------------------------------------------------------------An a temperatura constante, las enzimas tambin decaen irreversiblemente siguiendo una cintica de primer orden. E -- = -kdE . . . . . . . . . . . . . . (2) t en donde: kd es la constante de desactivacin y esta dada por: kd = (KBT/h)exp(_S*/R)exp(-Ea/RT) KB = constante de Boltzmann [1.38 x 10-23 J/oK] h = constante de Planck [6.6256 x 10-34 J.s] Algunos valores de _S y Ea se encuentran en el Bailey y Ollis pp 134.

Para reacciones que ocurren cerca de la T ptima, se propone la ecuacin de Hinshelwood (1946) que combina el proceso de sintesis y de decaimiento. k = A1.exp(-Ea1/RT) - A2.exp(-Ea2/RT) . . . . . (3) que fue modificadai para estudiar la actividad metanognica relativa (k) de una metangena mesfilica y del crecimiento global () en un proceso de digestin anaerobia termoflica. Encontraron que: k = k1.exp(a1(T - Tref) - k2.exp (a2(T - Tref)) Tref oC para k -1 0.75 0.15 0.14 0.3 30 (d ) 0.324 0.06 0.02 0.14 35 ------------------------------------------------------------------------------------------------------------Un parmetro comnmente usado es el coeficiente de temperatura Q10 definido como la tasa de cambio en la actividad microbiana entre T 1 y T2 = T1 + 10oC. De esta definicin y de la ecuacin 1 se puede obtener la ecuacin 3. Q10 = exp {Ea(T2 - T1)/(RT1T2)} Los valores de Y[gSSV/gDQO] y de b[d-1] se pueden considerar independientes de la temperatura. Sin embargo, los valores de Ks si son afectados. 1.2 Efecto de la concentracin en la velocidad de reaccin Las reacciones qumicas se pueden clasificar de acuerdo a la correspondencia de la velocidad de reaccin con la estequimetra. a. Reaccin elemental se llama a aquella en que las moleculas que aparecen en la ecuacin estequiomtrica son las que interaccionan para formar los productos. Por ejemplo en A + B -----> D la velocidad de desaparicin de A est dada por -rA = k.CA.CB. En otras palabras la ecuacin estequiomtrica nos indica que una molecula de A reacciona con una de B y la ecuacin de velocidad de reaccin tambin nos dice que concentraciones equimolares de A y B reaccionan. La molecularidad es una subclasificacin de las reacciones elementales y se refiere al nmero de molculas que eventualmente reaccionan para formar los productos. De esta manera tenemos las reacciones monomoleculares, bimoleculares y trimoleculares. El ejemplo anterior se refiere a una reaccin bimolecular. b. Orden de reaccin Algunas veces la velocidad de reaccin (involucrando las sustancias A, B, D, etc) se puede aproximar por una expresin del tipo rA = kCAa CBb...CZz en donde a+b+...+z = n a, b,...z no tienen que estar relacionados directamente con los coeficientes estequiomtricos. Las potencias a las que estn elevadas las concentraciones se llaman orden de reaccin. De tal manera que la reaccin anterior sera de a orden respecto a A b orden respecto a B z orden respecto a Z n orden respecto a la reaccion k1 a1 (oC-1) k2 a2 (oC-1)

El orden de reaccin puede ser un nmero fraccional puesto que es una expresin emprica de la velocidad de reaccin y no necesariamente se ajusta al mecanismo de reaccin. Se puede probar el orden de la velocidad de reaccin si se grafica ln(-rA) contra el ln(CA). La pendiente de la curva dar n, el orden de reaccin. ln(-rA) = ln k + n ln CA . . . . .(1.2.1) c. Reacciones no elementales Cuando no hay correspondencia entre la estequiometra con la velocidad de reaccin tenemos tenemos este tipo de reacciones que son el resultado global de una secuencia de reacciones elementales. La razn por la que solo vemos una reaccin y no a la serie de reacciones elementales es que la cantidad de intermediarios formados no es detectable. Como ejemplos se tienen: 1. Reacciones en cadena, radicales libres H2 + Br2 <====> 2HBr cuyo mecanismo es: Br2 <=====> 2Br. Br. + H2 <=======> HBr + H. H. + Br2 ---> HBr + Br. que tiene una expresin k1[H2][Br2]0.5 rHBr = ---------------- . . . . . . . (1.2.2) k2 + [HBr]/[Br2] 2. Mecanismo de intermediarios moleculares que es la expresin de las reacciones enzimticas E + S <=====> E + P k1 E + S <=====> ES k2 k3 ES -------> E + P cuyo mecanismo es:

que tiene una expresin

k3[Eo][S] Vmax [S] v = ----------- = -------- . . . . . . (1.2.3) KM + [S] KM + [S] Este mecanismo presenta las siguientes caractersticas que pueden deducirse al estudiar la reaccin: 1. La velocidad es proporcional a la concentracin de enzima introducida a la reaccin. 2. A bajas concentraciones de sustrato, la velocidad de reaccin es proporcional a la concentracin del sustrato. 3. A altas concentraciones de sustrato, la velocidad se vuelve independiente de la concentracin del sustrato. 4. Se supone que la concentracin del intermediario es apreciable en cuyo caso la enzima se distribuye de la siguiente manera:

[Eo] = [E] + [ES]. Esta suposicin permite plantear la ecuacin en trminos de la concentracin inicial de enzima [Eo] y de la concentracin de sustrato. La figura 1.3 muestra la curva caracterstica de la velocidad de consumo de sustrato en funcin de su concentracin en el medio reaccionante. Se indica el significado de los dos parmetros Vmax y KM. El apndice 1 muestra otros casos de reacciones enzimticas cuando existen otros sustratos que compiten o inhiben.

25 20 rp (g/L.min) 15 10 5 0 0 20 40 S (g/L) 60 80

Figura 1.3 Grfica de la ecuacin de Michaelis-Menten en donde se muestra la velocidad de reaccin obtenida a diferentes concentraciones de sustrato y manteniendo constante la concentracin total de enzima. 3. Crecimiento de microrganismos La actividad microbiana esta compuesta de un sinnmero de reacciones enzimticas que se acoplan para dar lugar al crecimiento celular o a la produccin de metabolitos de todos tipos. El conocimiento de la cintica de todas estas funciones metablicas permite disear procesos para optimizar la explotacin de los microorganismos. La representacin mas conocida en bioqumica es la reaccin autocataltica Xo + S ----> X

rx = ( - b) X . . . . . . . . .(1.2.4) en donde

X es la concentracin de microorganismos [M/L3] t es el tiempo [T] b es la tasa especifica de decaimiento [T-1] es la rapidez especifica de crecimiento [T-1]

es una funcin de la concentracin de sustrato. La expresin mas conocida es la de Monod. Otras se pueden ver en el Cuadro 1. (1.2.5) max = constante especifica mxima de crecimiento [T-1] S = concentracin del sustrato (o reactivo) [M/L3] Ks = constante de saturacin o de afinidad de sustrato [M/L3]. Muchas veces es importante seguir la cintica midiendo el consumo de sustrato, para eso es necesario definir el coeficiente de rendimiento Y [M biomasa/M sustrato], {g SSV/g DQO}

500 450 350

(1.2.6)

_ 400 Combinando las ecuaciones 1.2.4 y 1.2.6 se obtiene:

rx (g/L.hr)
300 250 200 150 100 50

(1.2.7) qS = coeficiente de utilizacin de sustrato[M/M.T]

En una 0 reaccin del tipo autocataltica, al empezar, la reaccin es lenta y aumenta a medida0que X aumenta. A 30 medida que se agota S, la velocidad de reaccin 10 20 40 50 60 70 80 disminuye segn se esquematiza en la figura 1.4.
S (g/L)

70
X S

60 50

g/L

40 30 20 10 0 0 5 tiempo (hr) 10 15

500 450 400 350

rx (g/L.hr)

300 250 200 150 100 50 0 0 10 20 30 40 S (g/L) 50 60 70 80

Figura 1.4 Grficas esquematizadas que muestran el comportamiento de las reacciones autocatalticas. (a) Evolucin de X y S respecto al tiempo, (b) Evolucin de la velocidad de reaccin respecto a la concentracin de sustrato (Ecuaciones 1.2.4 y 1.2.6). 2. OBTENCION E INTERPRETACION DE DATOS CINETICOS Como hemos visto una ecuacin cintica caracteriza a la velocidad de reaccin. Esta expresin puede ser sugerida por consideraciones tericas o puede ser el resultado de un procedimiento emprico de ajuste de curvas. La determinacin de la ecuacin de velocidad normalmente es un procedimiento de dos pasos. Primero, se encuentra la dependencia de la concentracin a una temperatura fija y despus se encuentra la dependencia de las constantes en la

temperatura. De esta manera se encuentra la expresin completa de la velocidad de reaccin. La informacin emprica se puede encontrar en dos tipos de equipo de laboratorio; los biorreactores intermitentes y los biorreactores continuos. Los reactores intermitentes son muy sencillos de operar y de escalar. Se deben usar para obtener datos cinticos en reacciones HOMOGNEAS. Los reactores continuos son usados para obtener datos de reacciones heterogneas aunque algunas veces se usan para complementar la informacin de los reactores intermitentes. Por ejemplo en las reacciones que son dificiles de seguir, las que dan varios productos, las que son muy rpidas o las que se efectan en el estado gaseoso son mas fciles de seguir en los reactores continuos. REACTORES IDEALES Estos son el reactor intermitente, el de flujo pistn, el de flujo mezclado. Estos tipos de reactores son los mas fciles de estudiar. Normalmente uno de estos tres o sus combinaciones representan el mejor modo de poner en contacto a los reactivos. En el laboratorio es facil aproximarse a cualquiera de estos modelos de flujo y por eso se usan para el estudio de las cinticas de las reacciones. Los reactores reales son una combinacin de reactores ideales. Por esta razn se procura disear a los reactores reales para que su operacin se asemeje a los ideales. Para interpretar la informacin cintica que se obtiene de un experimento corrido en cualquiera de los reactores ideales de laboratorio es necesario estudiar, en cada uno de ellos, la forma en que se ponen en contacto los reactivos y eventualmente los productos. El equipo que se usa para tratar las reacciones homogneas puede ser de tres tipos, el reactor intermitente (batch), el de flujo pistn y el de flujo mezclado. El punto de arranque para disear un reactor es la ecuacin de balance de un reactivo o un producto en un elemento diferencial (volumen, distancia, area) del reactor: tasa de flujo de A = tasa de flujo de A + velocidad cambio de A + a la entrada a la salida por reaccin qumica + velocidad de acumulacin de A Cuando la composicin es uniforme en todo el reactor, el balance se puede hacer sobre todo el reactor. Cuando la composicin no es uniforme, el balance se hace sobre un elemento diferencial de volumen y despus se integra sobre todo el reactor considerando las condiciones apropiadas de flujo y concentracin. En operaciones no isotrmicas, como son las fermentativas, se debe hacer tambin el balance de energa. Reactor intermitente o cerrado. En este tipo de fermentadores los reactivos se aaden al reactor, empieza la reaccin, los reactivos se van consumiendo y los productos aparecen hasta que se agotan los primeros o los segundos se acumulan hasta el punto de detener la reaccin. El perfil de la concentracin de las especies cambia con el tiempo como se ilustra en la figura 1.3. Se considera que los contenidos estn perfectamente mezclados o que no hay gradientes de concentracin dentro del reactor. {velocidad de acumulacin en el reactor} = {velocidad de cambio por reaccin}

dC V ---- = dt en donde C = X, S, P Integrando:

V rc

(2.1)

(2.2)

Que es la ecuacin que calcula el tiempo de reaccin en un reactor intermitente. Reactor de flujo pistn (FP). Este modelo ideal de flujo implica que cada seccin longitudinal de fluido se mueve sin ningn tipo de interaccin con secciones vecinas. El sistema es completamente segregado y cada seccin se comporta como un fermentador cerrado. Balance de materia en el elemento diferencial (z+z)A z u-----> z=0 AuC z - AuC z+z + A. z.rc = 0 uC]z z+z -->uC]z+z A ----->u z=L

en donde rc = velocidad de cambio de la especie C [M/L3.] A = seccin transversal del fermentador [L2] u = velocidad del flujo [L/] C = concentracin de la especie C [M/L3] Dividiendo entre A.z y tomando lmites lim uC z+z - uCz _z z----> 0 se tiene d ---uC = rc dz y al no haber cambio de fase = rc

dC rc = u ---dz dC ---dt

dz y como u = ---dt

rc =

(2.3)

Integrando entre los lmites Co y Cf se obtiene el tiempo de reaccin en un reactor de flujo pistn.

L Si Coi = Cop y ti = tp = ---, u

entonces

Cfi = Cfp

Reactor de flujo mezclado. Un balance de materia alrededor del reactor de la figura 3: {Acumulacin de materia en el reactor} = {Materia que entra} - {Materia que sale} -o+ {materia que cambia por reaccin}

En un estado estacionario; dC V ---- = FCo - FC + V.rc = 0 dt (C - Co) rc = -------tm V/F = tm = D-1 en donde tm es el tiempo de reaccin en un reactor de flujo mezclado D es la tasa de dilucin [T-1] Si C = X (concentracin de clulas g/l), rc = rx = X X tm = -------.X .X D = -------X . . . (2.7) . . . . . . .

.(2.5)

.(2.6)

Para el caso particular en que Xo = 0, no hay clulas en la corriente de entrada, que es el caso mas comun cuando se estudian biorreacciones en el laboratorio, entonces D = . . . . . . . .(2.8) Que nos indica que la tasa de dilucin esta limitada por la velocidad de crecimiento. Dicho de otra manera, no se puede alimentar a mayor velocidad a la que crecen los microorganismos. X Si C = S (concentracin de sustrato [M*L-3]) C = rs = --Y (So - S) .X tm = -------- Y D = --------- . . . (2.9) .X (So - S)Y X y solo cuando = D , Y = -------(So - S) Y de acuerdo a las ecuaciones 1.2.5, 2.8 KsD S = ---------- . (max - D) . . . . . .(2.11) . . . . . . (2.10)

X = Y{So -

KsD ----------} . . (max - D)

(2.12)