Fitase e suas implicaes na digesto e absoro de nutrientes

Gilson Alexandre Gomes Gerente Tcnico AB Vista Feed Ingredients gilson.gomes@abbrasil.com.br

Resumo Historicamente as fitases tm sido utilizadas com o intuito de liberao de fsforo atravs da hidrlise do fitato. Novos estudos tm demonstrado o efeito antinutricional do fitato, e o conceito de nutrio na ausncia do fitato principalmente atravs de Superdosagens de fitase esto trazendo ganhos significativos em desempenho animal. Introduo O uso de fitases em raes para animais no ruminantes bastante elevada, e estima-se que cerca de 90% das dietas de aves e sunos contenham a adio dessa enzima. Existem 4 principais tipos de fitase no mercado que derivam de diferentes microrganismos: Peniophora, Aspergillus, E Coli selvagem e E Coli geneticamente modificada. Cada uma delas tem caractersticas diferentes em termos de estabilidade trmica, estabilidade gstrica, afinidade ao substrato (fitato) e atuao em diferentes pHs, e so essas diferenas que fazem com que cada tipo de fitase atue de maneira diferente, e por consequncia, causem diferentes liberaes de nutrientes. Contudo, um objetivo comum de todas as fitases a quebra do fitato dos ingredientes vegetais que no disponvel para os animais, assim liberando o fsforo e reduzindo a necessidade de incluso de fosfato inorgnico (ou outras fontes de fsforo, como por exemplo, a farinha de carne e ossos) s dietas de aves e sunos, trazendo assim um benefcio econmico quando da formulao das dietas. Nos ltimos anos a comunidade cientifica vem discutindo os efeitos negativos que o fitato pode causar para a digestibilidade de microminerais (Harland e Morris, 1995), protena (Cowieson e Cowieson, 2011), aminocidos (Cowieson e Ravindran 2007, Cowieson et al., 2004), sdio (Cowieson et al., 2004) e utilizao da energia. Essa uma rea de estudo relativamente nova, onde doses mais altas de fitato tem sido empregadas para determinar o efeito extra-fosfrico das fitases, ou seja, a resposta adio de altas doses de fitase que no estejam meramente associadas liberao de fsforo do fitato, mas sim por evitar os danos causados pelo fitato na digestibilidade dos nutrientes supracitados. Fitato e seus efeitos anti-nutricionais De acordo com Santos (2012) o fitato (mio-inositol 1,2,3,4,5,6-hexa fosfato desidrogenado) alm de ser uma importante fonte de fsforo para nutrio animal, tambm uma fonte de reserva desse mineral nos gros, e mais recentemente se demonstrou que atua como antioxidante nos gros atravs da quelao de minerais como ferro, clcio e zinco, prevenindo o estresse oxidativo e assim evitando a morte do embrio. Santos (2012) ainda cita que a afinidade do fitato a ctions no trato gastrintestinal varia de acordo com o pH, fato este que est relacionado com a constante de dissociao da molcula (pKa), o que significa que o fitato pode estar

levemente carregado negativamente (em pH cido) ou fortemente carregado negativamente (em pH neutro/alcalino). Desta maneira a afinidade do fitato aos ctions da dieta muda de acordo com o pH (Figura 1).

Figura 1 Solubilidade do fitato em pH 2,0 a 7,0 na presena de Ca em concentrao similar ao encontrado no trato gastrintestinal dos animais (Fonte: Universidade de Maryland, dados no publicados) Tamin e Angel (2003) demonstraram que a baixa digestibilidade do P ftico do fitato no devido ao fato que as aves e sunos no possurem uma enzima capaz de hidrolisar o fitato. De acordo com os pesquisadores isto ocorre devido ao fato que alguns minerais reagem com o fitato insolubilizando-o, e assim impossibilitando a assimilao do P ftico, assim como do mineral que est ligado ao fitato. Tamin et al. (2004) demonstraram que o desaparecimento do P ftico em dietas sem calcrio foi ao redor de 69%, enquanto que com somente 0,5% de calcrio houve uma diminuio para 25%. Neste mesmo estudo se demonstrou que as fitases so eficientes em incrementar a absoro no somente do fsforo, mas tambm do clcio. Apesar da afinidade do fitato ser maior ao cobre e zinco (Selle e Ravindran, 2007) em dietas de aves existe uma alta concentrao de clcio, e por isso a formao de complexos Ca-fitato inevitvel. Nelson (1984) demonstrou que os requerimentos de clcio incrementam de acordo com a quantidade de fitato na dieta, e Lutrell (1993) demonstrou que a afinidade do ster IP4 (fitato com 4 grupos fosfato) ao clcio 70% menor que um ster IP6 (Figura 2 e 3).

1,1 Requerimento de Ca (%) 1,0 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0 0,1 0,2 P-ftico (%)
Figura 2 Requerimento de clcio total de frangos de corte at 21d de idade alimentados com dietas purificadas e recebendo nveis crescentes de P ftico (adaptado de Nelson, 1984)

0,3

0,4

Afinidade de quelao relativa com o Ca (% do IP6)

100 90 80 70

y = 5,1164x2 - 15,889x + 11,004 R = 1

60
50 40 30 20 10 0 1 2 3 4 5 6 Grau de defosforilao

Figura 3 Afinidade de diferentes steres de fitato pelo clcio (adaptado de Lutrell, 1993) Cowieson et al. (2004) elucidaram em partes o efeito anti-nutricional do fitato quando em seus estudos perceberam que existia um incremento na produo de mucina, e na excreo de sdio e outros minerais quando frangos de corte recebiam dietas com fitato (Tabela 1). De acordo com os autores isto ocorre porque o organismo secreta mais HCl para a ativao da pepsina, j que o fitato diminui a hidrlise das protenas e os animais tentam compensar essas perdas de digestibilidade. Tabela 1 Efeito do cido ftico e fitase na excreo de minerais endgenos e de cido silico (mg/ave/48h) em frangos de corte (Adaptado de Cowieson et al., 2004) Glicose Clcio Ferro Sdio Enxofre c. Silico 72,517,0a 5,20,62a 38,715,7a 66,84,6a 1,870,19a Glicose + 1.000FTU 70,013,2a 4,30,64a 45,012,4a 67,55,1a 2,230,16ab Glicose + 1g IP6 122,514,7b 6,81,04b 15526,3c 98,113,0b 5,330,39c Glicose + 1g IP6 + 1.000FTU 73,813,1a 6,60,79b 86,215,5b 80,310,0ab 2,460,37b

Mdias ( erro padro da mdia) sobrescritas com letras distintas na linha, e para a mesma varivel, diferem pelo teste de Tukey (p<0,05).

Kies et al. (2006) em ensaios in vitro demonstraram que a solubilidade de diferentes protenas pode ser influenciada pela concentrao de fitato. Neste estudo a protena de pior solubilidade foi a do farelo de arroz, matria prima esta que j tem um alto contedo de fitato em sua composio causando sua auto-insolubilizao (Figura 4). Mais recentemente Cowieson e Cowieson (2011) propuseram que o fitato diminui a solubilidade da protena atravs da atrao de molculas de gua para perto de si (interao eletrosttica), o que faria que os nutrientes tivessem menos gua ao seu redor, e assim diminuindo a sua solubilidade/digestibilidade. (Figura 5).

120%

100%

pH 2 pH 2 + fitato pH 2 + fitato + fitase

pH 3 pH 3 + fitato pH 3 + fitato + fitase

Solubilidade da Protena

80%

60%

40%

20%

0%

Casena

Milho

Farelo de Soja

Farelo de Arroz

Farelo de Canola

Farelo de Girassol

Figura 4 Impacto do pH e da concentrao de fitato na solubilidade da protena de diferentes ingredientes (adaptado de Kies et al., 2006)

Fitato (mM) Figura 5 Efeito da concentrao crescente de cido ftico sobre a solubilidade da lisozima (adaptado de Cowieson e Cowieson, 2011) Anlise de fitato em matrias-primas Como mencionado acima, o fitato dos gros desempenha um forte efeito antinutricional para as aves, e desta maneira crucial o conhecimento da quantidade de fitato nos ingredientes e raes, e com isso tentar otimizar a utilizao das fitases, empregando doses adequadas quantidade de substrato. Existem muitas metodologias utilizadas para a determinao da quantidade de fsforo ftico (precipitao por ferro, HPLC e metodologia enzimtica), porm, o maior limitante da anlise de fitato so os custos analticos elevados. Uma alternativa para a

Lisozima em soluo (% de 6mg/mL)

reduo dos custos seria a implementao de anlise de fitato por NIRS (Near-Infrared Reflectance Spectroscopy). Nas Tabelas Brasileiras para Aves e Sunos (Rostagno et al., 2011) podemos observar alguns valores de referencia para o contedo de fsforo ftico em matriasprimas brasileiras. No entanto, Wadt et al. (2010) demonstraram que a quantidade de fsforo ftico em amostras de milhos brasileiros apresentaram um valor mnimo de 0,10% e mximo de 0,26% (n=94), e concluram que esta variao pode estar correlacionada fertilizao feita no solo, assim como por diferenas ambientais e genticas. Em um estudo com gentica de feijes (Phaseolus vulgaris) Coelho et al. (2002) verificaram que a fertilizao por fsforo e a gentica influenciaram a biossntese de fitato pela planta. Fitases De acordo com Krabbe (2012) para que a utilizao das enzimas seja bem sucedidad algumas condies so essenciais: presena do substrato, presena da enzima especfica para aquele substrato, relao adequada entre atividade enzimtica e quantidade de substrato, ambiente adequado para a enzima (temperatura, pH e tempo). Entretanto, muitas vezes as condies no aparato intestinal das aves no so ideais para a atividade enzimtica. Onyango et al. (2005), estudando a atividade residual de diferentes fitases (bacteriana de Escherichia coli, e fngica de Peniophora lycii) verificaram que a fitase bacteriana apresentava atividade muito maior em todos os segmentos do trato gastrintestinal de frangos de corte quando comparadas fitase fungica. Os resultados encontrados por Onyango et al. (2005) podem ser explicados pelos resultados encontrados por Igbasan et al. (2000) que em ensaios in vitro expuseram diferentes fitases fngicas e bacterianas a um ambiente gstrico (simulando as condies do estmago/proventrculo pH 2 + pepsina e pancreatina) e concluram que as E. coli fitases foram as nicas que resistiram grandemente ao desafio imposto (pH baixo e proteases endgenas). A cintica de atuao das fitases tambm outro ponto de extrema relevncia. Prata et al. (2007) compararam uma fitase E. coli geneticamente modificada com outras fitases fngicas, testando a velocidade de hidrlise do fitato e seus diferentes steres (IP6, IP5, IP4, IP3, IP2) em dois diferentes pHs (2,5 e 3,5) e concluiu que a E. coli geneticamente modificada foi muito mais rpida na hidrlise do substrato, principalmente em hidrolisar os steres IP6 e IP5. O contedo de substrato exerce um efeito importante sobre a atividade da fitase, e sua ao est na dependncia da presena do substrato e sua concentrao. Apesar do aumento da concentrao de substrato no causar um aumento indefinido na atividade enzimtica, a pouca presena do substrato pode diminuir sua atividade, j que o contato fsico entre enzima e substrato necessrio. O Km da enzima (Figura 6) descreve a habilidade que uma enzima tem para manter sua atividade quando a quantidade de substrato em soluo limitante. De maneira geral, as fitases bacterianas apresentam Km mais baixo que as fitases fngicas (nesse caso quanto menor melhor), e esto surgindo algumas fitases E. coli geneticamente modificadas onde se est incrementando ainda mais a afinidade ao substrato, e adicionalmente se incrementando a resistncia s proteases endgenas e pH baixo. Outro ponto de grande relevncia a termo-estabilidade das enzimas. De acordo com Ushasree (2011) a fitase ideal aquela que intrinsecamente termotolerante, e a engenharia gentica tem ajudado cada vez mais a alcanar a fitase ideal (do ponto de vista de termo-tolerncia e eficincia cataltica). Tomando-se em conta todos os fatores acima expostos de se supor que diferentes fitases tenham liberaes de fsforo distintas. Selle e Ravindran (2007), em um artigo de reviso bibliogrfica sobre fitases, demonstraram que existe muita variao na liberao de fsforo pelas fitases, e isto pode estar correlacionado com a metodologia de avaliao empregada no experimento. Dados internos da AB Vista tm

demonstrado que as E.coli fitases (especialmente as duas geraes de E.coli fitases geneticamente modificadas) tm uma maior capacidade de liberao de fsforo do fitato que as fitases fngicas (Figura 7).

Figura 6 Efeito da concentrao de substrato na velocidade de reao catalisada enzimaticamente

4,0 3,5

P dispovel (g/Kg de dieta)

3,0

2,5
2,0 1,5

E.coli Modificada 1
1,0 0,5 E. coli Modificada 2 E. coli Selvagem Aspergillus niger Peniophora lycii

0,0
0 2000 4000 6000 8000 10000 12000

Dose Fitase (FTU/Kg)

Figura 7 Efeito da dose-resposta sobre a disponibilizao de fsforo em dietas recebendo a incluso de diferentes fitases

Superdosagem de fitase e seus efeitos extra-fosfricos Por todo o efeito danoso que o fitato exerce sobre a digestibilidade de nutrientes em aves, esto sendo feitos experimentos ao redor do mundo com doses maiores de fitases, alm dos 500FTUs convencionais. Apesar de ser um tema que ainda est em desenvolvimento, principalmente quando olhamos nas possibilidades de aplicao comercial, os estudos iniciais com doses mais elevadas de fitase datam do inicio da dcada de 70. Nelson, um dos pioneiros nos estudo com fitases, conduziu um estudo empregando doses elevadas de fitase (0, 950, 1900, 3800, 7600FTU/Kg de uma fitase de Aspegillus ficuum) no desempenho de frangos de corte. Os resultados mostraram que a maior dosagem (7600FTU/Kg) teve a melhor resposta aps 21 dias de idade das aves, onde o ganho de peso e cinzas sseas incrementaram 31 e 59%, respectivamente, quando comparadas s aves que no receberam fitase. Em estudos posteriores (Auspurger e Baker, 2004; Brana et al., 2006; Cowieson et al., 2004) se comprovou o achado de Nelson, onde nesses estudos se utilizou at 24000FTU/Kg, e se verificou incrementos significativos no desempenho dos animais. Selle e Ravindran (2007) mencionam que estratgias devem ser adotadas para diminuir o contedo de fitato ingerido pelos animais, seja pela desfitinizao das matrias-primas (principalmente quando falamos de farelos de oleaginosas), pela diminuio do contedo de fitato nos gros vegetais atravs da modificao gentica, ou pela utilizao de fitases mais eficientes na nutrio animal. Recentemente Cowieson et al. (2011) publicou um artigo abordando a estratgia de Superdosagem de fitase, especialmente focando as fitases provenientes de E.coli e Aspergillus niger, e concluram que existem oportunidades muito interessantes na melhoria da converso alimentar e ganho de peso em aves e sunos, inclusive podendo melhorar o rendimento de carcaa dos animais. Bedford (2012) enumerou recentemente alguns dos benefcios da utilizao da Superdosagem de fitase em aves (frangos, poedeiras, perus e patos). Bedford et al. (2011) demostraram efeitos bastante benficos sobre o ganho de peso de perus quando altas dosagens de fitase foram empregados. Os resultados desse estudo demonstram que apenas 500FTUs de uma E.coli fitase geneticamente modificada foram capazes em compensar uma diminuio em 0,15% no fsforo disponvel e 0,15% no clcio total (dieta controle negativo adicionados de 500FTU/Kg), apresentando resultados similares aos animais alimentados com a dieta controle positivo. Adicionalmente, animais recebendo 2000FTU/Kg apresentaram um maior ganho de peso (3,5% superior) quando comparados aos animais recebendo a dieta controle positivo. Dados internos da AB Vista demonstram um benefcio bastante interessante da utilizao da Superdosagem de uma E.coli geneticamente modificada, de segunda gerao, sobre a converso alimentar de frangos de corte (Figura 8). Dois outros fatores podem ser de grande importncia quando da utilizao do conceito de Superdosagem. O primeiro deles o potencial aproveitamento da assimilao de mio-inositol. Karadas et al. (2010), em estudo onde utilizaram at 12.500FTU/Kg de uma E. coli fitase geneticamente modificada, verificaram um aumento nos nveis de vitamina A, vitamina E e Coenzima Q10. Isso porque o inositol desempenha um importante papel no transporte de lipdeos, e a Coenzima Q10, um importante antioxidante, pode auxiliar nas funes mitocondriais e assim trazer benefcios no apenas para o metabolismo energtico, mas tambm na transferncia de nutrientes para o embrio quando da formao da gema. Walk et al. (2012) mencionam ainda a possibilidade de empregar Superdosagem de uma E. coli geneticamente modificada para, alm de melhorar o desempenho dos animais, poder reduzir a incluso de calcrio nas dietas, j que esse ingrediente causa diversas reaes fisiolgicas no organismo prejudicando a digestibilidade de nutrientes. No

estudo realizado por esses autores a utilizao de 5000FTU/Kg em dietas contendo apenas 0,64% de clcio total foi capaz em melhorar a converso alimentar em 50g (1,356 vs 1,306) e o ganho de peso em 10g (462 vs 472) quando comparadas a aves recebendo a dieta controle positivo (1,03% de clcio total sem a adio de fitase). Adicionalmente, os autores verificaram um incremento estatisticamente significativo na digestibilidade ileal de aminocidos (Arg, Val, Iso, Leu, Phe, Lys, Asp, Ser, Glu, Pro, Gly, Ala, Tyr) e uma tendncia de incremento na digestibilidade da protena bruta, quando da utilizao de Superdosagem de fitase, sendo que a maior quantidade de clcio (via calcrio) parece afetar a digestibilidade da protena bruta.

P = 0,0048; Controle Negativo = Controle positivo 0,15% Pdisp Anlise composta de 4 experimentos (dados internos AB Vista).

Figura 8 Efeito de diferentes dosagens de uma E.coli geneticamente modificada sobre a converso alimentar corrigida de frangos de corte aos 42 dias de idade Concluses Nos ltimos anos passamos a compreender melhor os efeitos anti-nutricionais do fitato e seus reflexos na utilizao de nutrientes pelos animais. Este melhor conhecimento levou a uma srie de novas pesquisas no intuito de elucidar os benefcios da reduo do fitato, pelo uso da superdosagem de fitase, sobre os parmetros de desempenho de aves. Apesar do mecanismo pelo qual as superdosagens de fitase incrementam os parmetros de desempeno no estar completamente elucidado, est claro que existe um incremento da digestibilidade e do status anti-oxidante dos animais. Os dados so realmente promissores, e sugerem que o futuro das fitases no mais ser a liberao de fsforo apenas, mas a busca incessante pela enzima mais hbil em rapidamente hidrolisar o fitato buscando assim os efeitos extra-fosfricos advindos da utilizao da chamada superdosagem de fitase.

Referncias Bibliogrficas Auspurger, N.R.; Baker, D.H. (2004) High dietary phytase levels maximize phytate phosphorus utilization but do not affect protein utilization in chicks fed phosphorus or amino acid deficient diets. Journal of Animal Science, 82: 1100-1107. Bedford, M.R.; Wyatt, C.; Knox, A.; Santos, T.T. (2011), Turkey performance between 0 and 84 days when diets supplemented with high doses of phytase, International Poultry Symposium, Atlanta. Bedford, M.R. (2012) Alternate uses of phytases Superdosing. Asian Poultry Magazine, p. 8-11. Brana, D.V.; Ellis, M.; Castandeda, E.O.; Sands, J.S. (2006), Effect of novel phytase on growth performance, bone ash, mineral digestibility in nursery and grower-finisher pigs. Journal of Animal Science, 84: 1839-1849. Coelho, C.M.M.; Santos, J.C.P.; Tsai, S.M.; Vitorello, V.A. (2002) Seed phytate content and phosphorus uptake and distribution in dry bean genotypes. Brazilian Journal of Plant Physiology, 14: 51-58. Cowieson, A.J.; Acamovic, T.; Bedford, M.R, (2004), The effect of phytase and phytic acid on the endogenous loss from broiler chickens. British Poultry Science, 45: 101 108. Cowieson, A.J.; Cowieson, N.P. (2011), Phytate and the thermodynamics of water. Australian Poultry Symposium, Page 11. Cowieson, A.J.; Ravindran, V (2007), Effect of phytic acid and microbial phytase on the flow and amino acid composition of endogenous protein at the terminal ileum of the growing broiler chicken. British Journal of Nutrition, 98: 45-752 Cowieson, A.J.; Wilcock, P.; Bedford, M.R. (2011) Super-dosing effects of phytase in poultry and other monogastrics. Worlds Poultry Science Journal, 67: 225-236. Harland, B.F.; Morris, E.R. (1995), Phytate A good or bad food component? Nutrition Research, 15: 733-754 Igbasan, F.A.; Mnner, K; Miksch, G.; Borriss; R.; Farouk, A.; Simone, O. (2000) Comparative studies on the in vitro properties of phytases from various microbial origins, Archiv fr Tierernaehrung, 53:353-373. Karadas, F.; Pirgozliev, V.; Pappas, A.C.; Acamovic, T.; Bedford, M.R. (2010), Effects of different dietary phytase activities on the concentration of antioxidants in the liver of growing broilers Journal of Animal Physiology and Animal Nutrition. 94: 519-526. Kies,A.K.; De Jonge, L.H; Kemme,P.A.; Jongbloed, A.W. (2006) Interaction between Protein, Phytate, and Microbial Phytase. In Vitro Studies. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 54:17531758. Krabbe, E.L. (2012) Perspectivas quanto ao desenvolvimento de enzimas para uso na nutrio de aves. XI Seminrio Internacional de Aves e Sunos, So Paulo, Brazil, CD ROM. Luttrell, B.M. (1993) The biological relevance of the binding of calcium ions by inositol phosphates. The Journal of Biological Chemistry, 268: 1521-1524. Nelson, T.S. (1984) Available calcium for poultry. Proceedings of the Florida Nutrition Conference for Feed Manufacturers, Orlando, Florida, pp. 1-6.

Onyango, E.M.; Bedford, M.R.; Adeola, O. (2005) Phytase activity along the digestive tract ofthe broiler chick: A comparative study ofan Escherichia coli-derived and Peniophora lycii phytase. Canadian Journal of Animal Science, 85: 61-68. Prata, R.; Batie, C.; Betts, S.; Basu, S.S. (2007) XX Congreso Latinoamericano de Avicultura, Porto Alegre, Brazil, p.13-15. Rostagno, H.S.; Albino, L.F.T.; Donzele, J.L.; Gomes, P.C.; Oliveira, R.F.M.; Lopes, D.C.; Ferreira, A.S.; Barreto, S.L.T.; Euclydes, R.F. Tabelas brasileiras para aves e sunos Composio de alimentos e requerimentos nutricionais. 3. ed. Visconde do Rio Branco, MG: Suprema, 2011. v. 01. 259 p. Santos, T.T. (2012) Phytate: anti-nutrient for poultry and swine. Feedstuffs, 84:1-3. Selle, P.H.; Ravindran, V. (2007) Microbial phytase in poultry nutrition. Animal Feed Science and Technology, 135:1-41. Tamim, N.M.; Angel, R. (2003) Phytate phosphorus hydrolysis as influenced by dietary calcium and micro-mineral source in broiler diets. Journal of Agriculture and Food Chemistry, 51: 4687-4693. Tamim, N.M.; Angel, R.; Christman, M. (2004) Influence of dietary calcium and phytase on phytate phosphorus hydrolysis in broiler chickens. Poultry Science, 83:13581367. Ushasree, M.V.; Sumayya, H.B.V.S.; Pandey, A. (2011) Adopting structural elements from intrinsically stable phytase a promising strategy towards thermostable phytases. Indian Journal of Biotechnology, 10:458-467. Wadt, G.R.; Santos, T.T.; Gomes, G.A.; Cowieson, A.J.; Bedford, M.R. Total and phytic phosphorus on corn samples from different regions in Brazil. Proceedings of Congresso Latino Americano de Nutrio Animal. Estncia de So Pedro, 4:7-8. Walk, C.L., Bedford, M.R., McElroy, A.P. (2012) Influence of limestone and phytase on broiler performance, gastrointestinal pH, and apparent ileal nutrient digestibility. Poultry Science, 91:13711378.