Bacteriologa

Generalidades > Introduccin

Las bacterias o eubacterias son microorganismos unicelulares que pertenecen al dominio Bacteria. Los miembros de este dominio tienen diferencias con aquellos pertenecientes a los otros dos dominios, Archaea y Eukarya. En la Tierra, existen slo dos tipos bsicos de clulas que son estructuralmente muy diferentes: las procariontes y las eucariontes. Las bacterias son clulas procariontes. Estas clulas poseen un nico cromosoma desnudo, es decir, que este cromosoma no se halla envuelto por una membrana nuclear sino que se halla en el citoplasma. Algunos investigadores se refieren a este cromosoma desnudo como nucleoide o ncleo primitivo. Otra de las caractersticas principales de las clulas procariontes es que no poseen organelas rodeadas por membranas como retculos endoplsmicos, mitocondrias, aparato de Golgi o lisosomas. Las eubacterias poseen las siguientes caractersticas:

Presentan una pared celular, con excepcin de los Mycoplasmas, por fuera de la clula que otorga rigidez y proteccin en medios osmticamente inadecuados. La membrana citoplasmtica posee una estructura trilaminar tpica y est formada por lpidos, protenas y pequeas cantidades de hidratos de carbono. Se reproducen por fisin binaria o divisin simple. No poseen un ncleo verdadero sino un cromosoma de DNA que se encuentra, ms o menos libre, en el citoplasma. No poseen organelas rodeadas por membranas. Sus ribosomas son 70s formados por las subunidades 30s y 50s. Poseen grnulos citoplasmticos que son acumulaciones de materiales de reserva como polisacridos, lpidos y polifosfatos.

Ultraestructura bacteriana
Dentro de las eubacterias existen tres grupos de bacterias que pueden ser diferenciados en relacin a la estructura de la pared celular. Para poder diferenciar a estos grupos no es necesario utilizar complejos sistemas de identificacin, y basta con un microscopio ptico y unas cuantas soluciones de colorantes. La forma ms sencilla de iniciar una identificacin del microorganismo que se desea estudiar es realizar una coloracin o tincin de Gram. La tincin de Gram es una tincin diferencial porque no todas las clulas se tien de la misma manera y permite discriminar entre dos grandes grupos de eubacterias, las eubacterias Gram positivas y Gram negativas. Los microorganismos Gram positivos, como el Staphylococcus aureus, adquieren un color violeta despus de la coloracin de Gram debido a que contienen una pared celular estructuralmente muy diferente a la de los microorganismos Gram negativos, como la Escherichia coli, que adquieren un color rosado. El tercer grupo de eubacterias es el de los Bacilos Acido-Alcohol Resistentes (BAAR) que pueden ser diferenciados utilizando la coloracin de Ziehl-Neelsen. La diferencia en la

coloracin no se debe a reacciones qumicas con ciertos componentes de la pared sino a la estructura fsica de la misma.

Generalidades > Evolucin

rbol Filogentico Universal

Generalidades > Microorganismos Gram positivos

Las eubacterias Gram positivas son clulas con una gruesa pared celular de peptidoglicano. Ests clulas poseen una membrana citoplasmtica con fosfolpidos y protenas. Por fuera de la membrana citoplamtica se encuentra la pared celular que est compuesta por una ancha capa de peptidoglicano. Este peptidoglicano es una macromolcula gigante formada por cadenas de un dmero compuesto por N-acetilglucosamina y N-acetilmurmico. A su vez, estas cadenas se encuentran unidas entre s mediante pptidos, que son pequeas cadenas de aminocidos que se entrecruzan. Estos puentes peptdicos son caractersticos de las distintas bacterias y presentan mayor rigidez cuanto ms completo sea el entrecruzamiento. El peptidoglicano es una malla porosa que otorga forma y rigidez a la clula, y evita que la clula estalle en medios hipotnicos. Al ser porosa permite el paso de nutrientes desde el exterior y el movimiento de enzimas catalticas y productos de secrecin hacia el exterior de la clula. La pared celular Gram positiva tambin contien cidos teicoicos y cidos lipoteicoicos. Los cidos teicoicos son cadenas de ribitol o glicerol unidas por fosfodisteres, y estn unidos covalentemente al peptidoglicano por medio de grupos fosfodister en el oxihidrilo del C6 del N-acetilmurmico. Los cidos lipoteicoicos son polmeros de glicerofosfato se encuentran anclados en la membrana citoplasmtica y no estn unidos al peptidoglicano. La funcin de estos compuestos sera estructural, pero existen evidencias que indican que tambin participaran en la regulacin de las enzimas hidrolticas que renuevan la pared celular (autolisisnas) y que seran sitios de fijacin de fagos.

Esquema de las Envolturas de una Eubacteria Gram Positiva

Generalidades > Microorganismos Gram negativos

Las eubacterias Gram negativas son clulas con una delgada capa de peptidoglicano y una segunda envoltura denominada membrana externa. Las clulas se encuentran envueltas por una membrana citoplasmtica formada por una bicapa fosfolipdica y protenas. Por encima de esta membrana se encuentra una fina capa de peptidoglicano que se halla unida covalentemente a unas lipoprotenas de anclaje que fijan la membrana externa por medio de porciones lipoflicas. Entre la membrana citoplasmtica y la membrana externa queda delimitado el espacio periplsmico. Este espacio es ocupado por el periplasma que es una matriz isotnica respecto al citoplasma, isotonicidad que es mantenida mediante los oligosacridos derivados de membrana (MDO), y en la que se hallan componentes catalticos de suma importancia para la viabilidad celular. La membrana externa tiene una estructura de bicapa asimtrica en donde la cara externa esta compuesta por el lipopolisacarido (LPS) y la cara interna por fosfolpidos. Adems, esta membrana es rica en protenas, algunas de las cuales se denominan porinas. La membrana externa funciona como una barrera de permeabilidad para ciertas sustancias como antimicrobianos y enlentece el pasaje de otros que son inactivados en el periplasma. El LPS est formado por tres regiones: el polisacrido O (Antgeno O), el polisacrido del centro (KDO) y el lpido A (Endotoxina). La presencia del LPS en la membrana externa le confiere a la clula una efectiva proteccin contra enzimas digestivas y detergentes como las sales biliares, y dota a la superficie bacteriana con una fuerte hidrofilicidad que le permite a la clula evadir la fagocitosis, tener cierta resistencia al complemento, evitar la respuesta inmune especfica por alteracin de la superficie antignica y adherirse a ciertas clulas del hospedador. Las porinas son poros o canales proteicos no especficos que pueden ser atravesados por pequeas molculas hidroflicas. En la membrana externa se encuentran otras protenas que funcionan como canales de difusin especficos y facilitan el paso de di, tri y oligosacridos.

Esquema de las envolturas de una eubacteria Gram Negativa

Generalidades > Bacilos Acido-Alcohol Resistentes

Los microorganismos pertenecientes al gnero Mycobacterium se caracterizan por tener una pared celular completamente diferente a las restantes eubacterias. La pared de las Mycobacterias posee un alto contenido de lpidos que la hace impermeable a los agentes hidroflicos, por lo tanto estos microorganismos no se tien adecuadamente con los reactivos utilizados en la coloracin de Gram y no pueden ser clasificados como Gram positivos o negativos. Las Mycobacterias son teidas adecuadamente por el mtodo de Ziehl-Neelsen (Tincin Acido-Rpida o Acid-Fast Stain) que utiliza como solucin decolorante una mezcla de etanol y cido clorhdrico. Estos microorganismos una vez coloreados son resistentes a la decoloracin cido-alcohlica y por eso se denominan Bacilos Acido Alcohol Resistentes (BAAR). Los microorganismos del gnero Mycobacterium contienen una membrana citoplasmtica formada por una bicapa lipdica similar a las restantes eubacterias. Por encima de esta membrana se encuentra el rgido peptidoglicano que contiene N-glucolilmurmico en lugar de N-acetilglucosamina. Por medio de una unin fosfodister, el peptidoglicano se halla unido covalentemente al arabinogalactano, un polmero de arabinosa y galactosa. En la porcin ms distal y externa de los arabinogalactanos se hallan fijados los cidos miclicos que tienen cadenas carbonadas largas (C60 a C90). Los glucolpidos son un grupo de compuestos (micolatos de trealosa, sulfolpidos, micsidos, etc) que se encuentran asociados no covalentemente a los cidos miclicos y se ubican perifricamente en la pared. Los micolatos de trealosa (llamados factores de cordn porque su presencia produce cultivos que tienen forma de cordones serpenteantes) y sulfolpidos se encuentran principalmente en las cepas de Mycobacterias ms virulentas. El lipoarabinomanano (LAM) es un compuesto que se halla anclado en la membrana citoplasmtica. El LAM es considerado como el equivalente mycobacteriano del lipopolisacrido de las Gram negativas debido a que provoca una importante respuesta antimicrobiana en macrfagos. En las cepas de Mycobacterias ms virulentas la arabinosa terminal del LAM est recubierta con residuos de manosa (manLAM) a diferencia de las cepas no virulentas no estn recubiertas (AraLAM). Adems, el LAM tambin podra servir como poro para el paso de los nutrientes a

travs de la pared celular. En la pared celular tambin se encuentran protenas inmunoreactivas que son utilizadas con fines diagnsticos (PPD). El Mycobacterium tuberculosis es el agente etiolgico de la tuberculosis, una enfermedad que primariamente produce lesiones en los pulmones y que puede causar la muerte si nos es tratada en forma adecuada. Existen otras Mycobacterias capaces de producir infecciones en el hombre. El M. bovis tambin causa tuberculosis, mientras que las infecciones producidas por M. avium, M. kansakii, M. fortuitum y M. chelonei son consideradas oportunistas y no tuberculosas. La lepra es una infeccin causada por el Mycobacterium leprae que es un parsito intracelular obligado que se multiplica lentamente en clulas fagocitarias mononucleares como los histiocitos de la piel y en las clulas de Shwan de los nervios. La tuberculosis es una enfermedad de distribucin mundial pero con consecuencias devastadoras en los pases en desarrollo. En el ao 1993 la Organizacin Mundial de la Salud (OMS-WHO World Health Organization) declar a la tuberculosis una "Emergencia Global". Se estima que un tercio de la poblacin mundial est infectada con el M. tuberculosis, y que en la prxima dcada sern infectadas ms de 300 millones de personas de las cuales 90 millones desarrollarn la enfermedad y 30 millones morirn por ella.

Esquema de las envolturas de una eubacteria Acido-Alcohol Resistente Adaptado del minireview "Immunopathology of Tuberculosis: Roles of Macrophages and Monocytes" de M. J. Fenton y M. W. Vermeulen (Infection and Immunity. Marzo de 1996)

Generalidades > Peptidoglicano

Esquema de la estructura del peptidoglicano del Staphylococcus aureus

Esquema de la estructura del peptidoglicano de la Escherichia coli

Entrecruzamiento del peptidoglicano

Generalidades > Sntesis del Peptidoglicano

Esquema de la sntesis del peptidoglicano de una Eubacteria

Transglicosilacin del peptidoglicano

Fisiologa bacteriana > Requerimientos qumicos

Carbono
Este elemento puede aportarse a los microorganismos en forma muy diversa dependiendo del tipo de metabolismo que posean. El carbono es utilizado por los microorganismos para sintetizar los compuestos orgnicos requeridos para las estructuras y funciones de la clula. Los microorganismos se pueden dividir en categoras nutricionales en base a dos parmetros: naturaleza de la fuente de energa y naturaleza de la fuente principal de carbono (Estas propiedades metablicas fueron seleccionadas arbitrariamente y no brinda una descripcin completa de las necesidades nutricionales de un organismo).

Fototrofos: utilizan luz como fuente de energa. Quimiotrofos: la fuente de energa es qumica. Autotrofos: utilizan como fuente de carbono al CO2 y a partir del cual sintetizan los esqueletos carbonados de los metabolitos orgnicos. Heterotrofos: utilizan compuestos orgnicos como fuente de C y electrones.

Combinndose estos dos parmetros se pueden establecer cuatro categoras principales de organismos:

Fotoautotrofos: dependen de la luz como fuente de energa y utilizan CO2 como principal fuente de carbono. Vegetales superiores, bacterias fotosintticas, algas eucariticas, etc. Fotoheterotrofos: utilizan luz como fuente de energa y emplean compuestos orgnicos como fuente de carbono. Algunas bacterias fotosintticas y algas eucariticas. Quimioautotrofos: utilizan CO2 como fuente de carbono y emplean fuentes de energa qumica proveniente generalmente de compuestos inorgnicos reducidos (H2, S2-, NH4+, etc). Quimioheterotrofos: utilizan compuestos orgnicos como fuente de carbono y energa. Los compuestos orgnicos tambin se comportan como fuente de electrones. Este grupo est integrado por animales superiores, hongos, protozoos y la mayora de las bacterias.

Nitrgeno
El nitrgeno es utilizado por las bacterias para formar aminocidos, pirimidinas, purinas, etc, y puede provenir de fuentes diferentes.

Asimilacin de NH3 y sales de amonio: el nitrgeno es transferido con este estado de oxidacin a los aminocidos por la va de la glutamato/glutamina. Fijacin de Nitrgeno: el N2 es reducido dentro de la clula a NH4+ y metabolizado. Reduccin asimiladora de Nitratos: los nitratos son reducidos dentro de la clula por la va de los nitritos a NH3 y metabolizado.

Hidrolizados proteicos: los microorganismos incapaces de asimilar el nitrgeno de sales inorgnicas, lo obtienen a travs de compuestos orgnicos nitrogenados como los hidrolizados proteicos. Estos compuestos proteicos son a su vez hidrolizados por enzimas bacterianas, fuera de la clula, a aminocidos, los que despus son metabolizados dentro de la clula.

Oxgeno
Basados en los requerimientos de oxgeno molecular las bacterias se pueden dividir en 5 grupos:

Aerobios obligados: requieren oxgeno para el crecimiento pues dependen de este elemento para cubrir sus necesidades energticas. El oxgeno es el aceptor final de electrones en la cadena respiratoria. Anaerobios obligados: crecen en ausencia total de oxgeno porque necesitan un medio muy reductor. Utilizan respiracin anaerobia donde los aceptores finales de electrones pueden ser generalmente SO42-, Fumarato2- o CO32-.

Anaerobios facultativos: pueden crecer en presencia o ausencia de oxgeno. Utilizan al oxgeno como aceptor final de electrones en la cadena respiratoria cuando est disponible, y en ausencia de oxgeno la energa la obtienen por fermentacin o respiracin anaerobia (generalmente el NO3- es un aceptor final de electrones en las enterobacterias).

Anaerobios aerotolerantes: pueden crecer en presencia o ausencia de oxgeno, pero la energa la obtienen por fermentacin. Microaerofilos: slo pueden crecer con bajas tensiones de oxgeno porque las altas tensiones son txicas para este tipo de microrganismos (1 a 12% de O2 en la fase gaseosa). La energa la obtienen por respiracin aerbica, cuando no hay aceptores electrnicos terminales alternativos, o anaerbica.

Azufre
El azufre puede ingresar en la clula reducido (grupos sulfhidrilos), como sulfato (debe ser reducido dentro de la clula para metabolizarse) o como aminocidos azufrados. El azufre es utilizado para la sntesis de aminocidos azufrados como la cistena o metionina, que tienen un papel muy importante en la estructura terciaria de las protenas (formacin de puentes S-S) y en el sitio cataltico de enzimas.

Factores de Crecimiento
Son compuestos orgnicos que el microorganismo es incapaz de sintetizar a partir de los nutrientes y son fundamentales para la maquinaria metablica de la clula. Son vitaminas, aminocidos, purinas, pirimidinas, etc.

En relacin al requerimiento de factores de crecimiento los microorganismos se pueden dividir en:

Prottrofos: microorganismos que sintetizan sus propios factores de crecimiento. Auxtrofos: microorganismos que requieren una fuente exgena de factores de crecimiento debido a que son incapaces de sintetizarlos.

Iones Inorgnicos
Son esenciales para el crecimiento porque estabilizan los compuestos biolgicos como enzimas, ribosomas, membranas, etc. Los iones requeridos para el crecimiento bacteriano son aportados en el medio a travs de sales que contienen K+, Mg2+, Mn2+, Ca2+, Na+, PO43-, Fe2+, Fe3+ y trazas de Cu2+, Co2+ y Zn2+.

Fisiologa bacteriana > Requerimientos fsicos

Temperatura
Todos los microorganismos tienen una temperatura ptima de crecimiento. Esto significa que a determinada temperatura la velocidad de duplicacin (o la velocidad de crecimiento poblacional) de los microorganismos es mayor. Hay que tener en cuenta que no todos los microorganismos crecen en el mismo rango de temperaturas: Clasificacin Termfilos Mesfilos Psicrfilo Rango Optima

25 - 80 C 50 - 60 C 10 - 45 C 20 - 40 C -5 - 30 C 10-20 C

La temperatura afecta la estabilidad de las protenas celulares porque induce cambios conformacionales que alteran la actividad biolgica de estos compuestos, especialmente la de enzimas.

pH
La mayora de los microorganismos crecen en pH cercanos a la neutralidad, entre 5 y 9, cosa que no excluye que existan microorganismos que puedan soportar pH extremos y se desarrollen. Segn el rango de pH del medio en el cual se desarrollan pueden dividirse en:

Clasificacin Acidfilos Neutrfilos Alcalfilos

pH externo pH interno 1.0 - 5.0 5.5 - 8.5 9.0 - 10.0 6.5 7.5 9.5

Los microorganismos regulan su pH interno mediante un sistema de transporte de protones que se encuentra en la membrana citoplasmtica, que incluye una bomba de protones ATP dependiente. El rango de pH ptimo para el desarrollo de los microorganismo es estrecho debido a que frente a un pH externo muy desfavorable se requiere un gran consumo de energa para mantener el pH interno.

Actividad de Agua
El agua es el solvente en donde ocurren las reacciones qumicas y enzimticas de la clula y es indispensable para el desarrollo de los microorganismos. La actividad de agua (aW) del medio representa la fraccin molar de las molculas de agua totales que estn disponibles, y es igual a relacin que existe entre la presin de vapor de la solucin respecto a la del agua pura (p/po). El valor mnimo de aW en el cual las bacterias pueden crecer vara ampliamente, pero el valor ptimo para muchas especies es mayor a 0.99. Algunas bacterias halfilas (bacterias que se desarrollan en altas concentraciones de sal) crecen mejor con aW = 0.80. Variaciones en la actividad de agua puede afectar la tasa de crecimiento, la composicin celular y la actividad metablica de la bacteria, debido a que si no disponen de suficiente cantidad de agua libre (no asociada a solutos, etc) en el medio necesitaran realizar ms trabajo para obtenerla y disminuir el rendimiento del crecimiento.

Potencial de Oxido-Reduccin
El Potencial de Oxido-Reduccin es una medida de la tendencia del medio a donar o recibir electrones. Es crtico para el crecimiento de los microorganismos y generalmente est asociado con la presencia de oxgeno molecular disuelto en el medio el cual es muy oxidante. En medios que contienen oxgeno, en condiciones similares a las atmosfricas, el potencial redox vara entre 0,2 y 0,4 Voltios. Los anaerobios estrictos necesitan una atmsfera sin oxgeno pues deben crecer en medios reductores donde el potencial no sea mayor a -0,2 Voltios. Sin embargo, potenciales redox positivos creados por la presencia de otras sustancias qumicas no afectan el crecimiento de los anaerobios ms estrictos, aunque muchos anaerobios estrictos son inhibidos por potenciales mayores a -0.100 mV.

Fisiologa bacteriana > Ciclo de crecimiento

Un cultivo bacteriano simple y homogneo tiene un ciclo de crecimiento como el que se representa a continuacin.

Este ciclo tiene una morfologa y una divisin de clulas asincrnica. Se divide en cuatro fases:

Fase de Latencia: Es la fase de adaptacin al medio, existe aumento de la masa celular pero no hay aumento en el nmero de clulas. Fase de Crecimiento Exponencial: Es la fase donde se produce un incremento exponencial del nmero de microorganismos. Fase Estacionaria: Es la fase a la que se llega cuando se ha agotado la fuente de energa. Fase de Muerte: Es la fase que se caracteriza por una disminucin exponencial del nmero de microorganismos.

La fase de latencia puede ser inducida por un rpido cambio en las condiciones del cultivo. En un medio fresco, el largo de la fase de latencia va a depender del tamao del inculo, de la edad del inculo, y de los cambios en la composicin y concentracin de los nutrientes que experimenten las clulas. Un pequeo volumen de inculo transferido a un gran volumen de medio fresco va a producir una salida por difusin de iones, vitaminas y cofactores que son indispensables para la actividad de muchas enzimas intracelulares. Si las clulas provenientes de un medio rico son inoculadas en un medio mnimo, el tiempo de latencia puede estar afectado por el tamao del inculo como un resultado de los nutrientes remanentes del medio original. La edad del inculo va a influir en el tiempo de latencia en el medio fresco debido a la acumulacin de materiales txicos y a la falta de nutrientes esenciales dentro de la clula durante el crecimiento anterior. En general, inculos viejos alargan la fase de latencia. Cambios en la composicin y concentracin de nutrientes entre el cultivo del inculo y el medio fresco pueden desencadenar el control y la regulacin de la actividad enzimtica

dentro de las clulas o la diferenciacin morfolgica, como la formacin de esporas. Si las clulas son transferidas de un medio simple a un medio rico, se van a necesitar ms tiempo y nutrientes para incrementar la concentracin de enzimas necesarias para el metabolismo.

Fisiologa bacteriana > Medida del crecimiento

El crecimiento de una poblacin bacteriana puede ser entendido desde diferentes perspectivas y de acuerdo a stas se puede llegar a determinar la medida del crecimiento mediante diversas metodologas. Para algunos, el crecimiento es la capacidad para multiplicarse que tienen las clulas individuales, sto es iniciar y completar una divisin celular. De esta forma, se considera a los microorganismos como partculas discretas y el crecimiento es entendido como un aumento en el nmero total de partculas bacterianas. Existen dos formas para determinar el nmero total de microorganismos en una muestra:

Recuento microscpico de partculas Recuento electrnico de partculas

Para otros, el crecimiento implica el aumento de los microorganismos capaces de formar colonias debido a que slo se tiene en cuenta el nmero de microorganismos viables, esto es capaces de crecer indefinidamente. Las determinaciones que se utilizan son:

Recuento de colonias Mtodo del nmero ms probable

Para los fisilogos bacterianos, bioqumicos y bilogos moleculares una medida del crecimiento es el incremento de biomasa. Para ellos, la sntesis macromolecular y un incremento en la capacidad para la sntesis de los componentes celulares es una medida del crecimiento. Para este grupo la divisin celular es un proceso esencial pero menor que rara vez limita el crecimiento, ya que lo que limita el crecimiento es la capacidad del sistema enzimtico para utilizar los recursos del medio y formar biomasa.

Determinacin de peso hmedo Determinacin de peso seco Determinacin de nitrgeno total Determinacin qumica de un cido nucleico

Un ltimo grupo entiende al crecimiento sobre la base de la influencia que ejercen los microorganismos en los cambios qumicos de su entorno como consecuencia del incremento de la biomasa.

Recuentos Directos
Recuento microscopico: Es una tcnica comn, rpida y barata que utiliza un equipamiento fcilmente disponible en un laboratorio de microbiologa. Para estos recuentos se utilizan generalmente cmaras de recuentos, aunque tambin pueden realizarse a partir de muestras filtradas en membranas y transparentizadas o teidas con colorantes fluorescentes (Naranja de acridina).

La mayor dificultad del recuento en cmara es obtener reproductibilidad en el llenado de la cmara con lquido. Otra dificultad es la adsorcin de las clulas en las superficies del vidrio, incluyendo pipetas. Esta adsorcin es crtica en el proceso de dilucin de la muestra y se minimiza al realizar las diluciones en medios de alta fuerza inica (solucin fisiolgica o medios mnimos sin fuente de carbono). Las cmaras ms utilizadas son las de Hawksley y la de Petroff-Hausser. La primera tiene la ventaja que puede ser utilizada con objetivos de inmersin, aunque la mayora de los recuentos se realizan con objetivos secos. Una de las mayores ventajas del recuento microscpico es brindar informacin adicional sobre el tamao y la morfologa de los objetos contados.

Camara de recuento de Petroff-Hausser

Tipo de cuadro Cuadrado total Cuadrado grande Cuadrado pequeo

Area [cm2] 1.00 x 10-2 4.00 x 10-4 2.50 x 10-5

Volumen [ml] 2.00 x 10-5 8.00 x 10-7 5.00 x 10-8

Factor [1/Volumen] 5.00 x 104 1.25 x 106 2.00 x 107

1/Dilucin: Inversa de la dilucin utilizada para llenar la cmara de recuento. Nmero de cuadrados contados: Cantidad de cuadrados de la cmara que se utilizaron para contar un el nmero de bacterias. Volumen del cuadrado: Volumen de cada cuadrado de la cmara. Depende del tipo de cuadrado en donde se realiz el recuento. Por ejemplo, cada cuadrado pequeo tiene un volumen de 5 x 10-8 ml (50 m x 50 m x 20 m = 5 x 104 m3 = 5 x 10-8 ml).

Recuento electronico: Los contadores electrnicos permiten realizar recuentos de bacterias, levaduras no filamentosas y protozoarios, pero no de hongos y microorganismos filamentosos o miceliares. Estos instrumentos constan bsicamente de dos compartimientos comunicados a travs de un pequeo conducto. En ambos compartimientos hay electrodos que miden la resistencia elctrica del sistema, y como el orificio del conducto es muy pequeo y su resistencia es muy alta, la resistencia elctrica de cada compartimiento es independiente. El principio de funcionamiento de estos instrumentos es el que se explica a continuacin. Un volumen fijo de una suspensin bacteriana es forzada a pasar desde un compartimiento al otro a travs del pequeo conducto, en un muy breve intervalo de tiempo. Cuando un microorganismo pasa al nuevo compartimiento, la resistencia de ste se incrementa debido a que la conductividad de la clula es menor que la del medio. Estos cambios en la resistencia son convertidos en pulsos o voltaje y contados. Este tipo de recuento presenta algunos inconvenientes. Ciertas bacterias muy pequeas producen cambios en la resistencia que son comparables al "ruido" generado por la turbulencia que se desarrolla al pasar el fluido por el orificio. No pueden medirse clulas que formen filamentos o agregados o soluciones muy concentradas de microorganismos, debido a que el pasaje de ms de una clula en un breve perodo de tiempo va a ser tomado como una clula ms grande. Es comn la obstruccin del orificio por microorganismos muy grandes.

Medida de la Biomasa
La medida de la masa de los constituyentes de la clula bacteriana es utilizada frecuentemente como base para la medida de una actividad metablica, o de un constituyente metablico o qumico. Algunos de los mtodos para cuantificar la biomasa son obvios y confiables, pero pueden volverse complicados si se busca la exactitud. Peso hmedo: Se obtiene a partir de una muestra en suspensin que es pesada luego de la separacin de las clulas por filtracin o centrifugacin. Es una tcnica til para grandes volmenes de muestra. La principal desventaja es que el diluyente queda atrapado en el espacio intercelular y contribuye al peso total de la masa. La cantidad de lquido retenida puede ser importante, por ejemplo, un pellet de clulas bacterianas muy empaquetadas puede contener un espacio intercelular que aporta entre el 5-30% del peso, de acuerdo a la forma y deformacin celular. Para corregir el peso hmedo se determina la cantidad de lquido que queda retenida en el espacio intercelular luego de una centrifugacin, para ello se utilizan soluciones de polmeros no inicos (como el Dextran) que pueden ingresar en el espacio intercelular pero no pueden atravesar las paredes bacterianas. Peso seco: El peso seco (contenido de slidos) de las clulas bacterianas que se encuentran en una suspensin se obtiene por el secado de un volumen en un horno a 105C hasta peso constante. Esta tcnica es til para grandes volmenes de muestra, debido a que diferencias del orden de los miligramos representan el peso de un gran nmero de bacterias.

La desventaja de este mtodo es que componentes voltiles de la clula pueden perderse por el secado y puede existir alguna degradacin. Tambin la muestra seca puede recobrar humedad durante el pesado, principalmente si el ambiente tiene una humedad relativa alta. Determinacin de acidos nucleicos: Es una tcnica que permite determinar indirectamente la masa de una poblacin bacteriana. Se determina la cantidad existente de un determinado cido nucleico (generalmente DNA) y a partir de este dato se estima la masa de la poblacin. Determinacion de nitrgeno: Es una tcnica que permite determinar indirectamente la masa de una poblacin bacteriana. Existen distintas tcnicas para determinar la cantidad de nitrgeno que contiene una muestra en relacin al compuesto que se quiera determinar. Puede analizarse el nitrgeno no proteico mediante el NO2-, NO3-, NH4+, el nitrgeno proteico mediante absorcin en UV, Reaccin de Biuret, Reaccin de Lowry, o el nitrgeno total mediante la Digestin de Kjeldahl. Incorporacin de precursores radiactivos: Es una tcnica que permite determinar indirectamente la masa de una poblacin bacteriana. En esta tcnica se adiciona al medio un compuesto marcado radiactivamente que puede ser incorporado a la clula, y luego se determina la cantidad de marca incorporada por toda la poblacin.

Dispersin de la Luz
Cuando un haz de luz paralelo (colimado) golpea una partcula en suspensin, parte de la luz es reflejada, parte es diseminada, parte es absorbida y parte es transmitida. La nefelometra mide la luz dispersada por una solucin de partculas. La turbidimetra mide la luz dispersada como un decrecimiento de la luz transmitida a travs de la solucin. En relacin a la longitud de onda y al tamao de la partcula pueden existir tres tipos de dispersin. Los mtodos de dispersin de la luz son las tcnicas ms utilizadas para monitorear el crecimiento de los cultivos bacterianos. Son muy tiles y poderosos pero pueden llevar a resultados errneos. Principalmente, dan informacin sobre el peso seco (contenido macromolecular). Turbidimetra: La turbidimetra mide la reduccin de la transmisin de luz debido a partculas de una suspensin y cuantifica la luz residual transmitida. Estudios tericos y experimentales han mostrado que soluciones diluidas de diferentes tipos de bacterias, independientemente del tamao celular, tienen casi la misma absorbancia por unidad de concentracin de peso seco. Esto quiere decir que, en soluciones diluidas, la absorbancia es directamente proporcional al peso seco, independientemente del tamao celular del microorganismo. Sin embargo, se encuentran absorbancias muy diferentes por partcula o por UFC (Unidad Formadora de Colonia) cuando los tamaos de las clulas bacterianas son diferentes. Por esta razn, para estimar el nmero de microorganismos totales o el nmero de microorganismos viables de una suspensin bacteriana debe realizarse una "curva de calibracin" con cada tipo de microorganismo, slo de esta forma es posible relacionar Absorbancia (Densidad Optica) con el nmero de microorganismos totales o con UFC.

Absorbancia en funcin del Peso Seco

Absorbancia = K x Peso Seco K: constante que vara con la longitud de onda utilizada y representa la inversa del peso seco del microorganismo que produce un aumento de 10 veces en el valor de la absorbancia (1/W0). Peso seco: Concentracin celular bacteriana expresada en unidades de peso seco (g/mlmg/ml). La relacin directa entre la absorbancia y el peso seco slo se aplica para suspensiones diluidas de bacterias. Estas suspensiones no deben tener una absorbancia mayor a 0.3, ya que valores mayores producen desviaciones de la ley de Beer. Sin embargo, el inconveniente de utilizar suspensiones diluidas puede involucrar un mayor error de pipeteo y menor sensibilidad por el bajo nivel de absorcin.

Absorbancia en funcin del Peso Seco

Absorbancia en funcin del Nmero de Microorganismos Totales

En estos grficos se puede apreciar que suspensiones diluidas de dos microorganismos diferentes con igual peso seco tienen la misma absorbancia, mientras que para el mismo nmero de microorganismos totales la absorbancia de cada suspensin es distinta.

Fisiologa bacteriana > Medios de cultivo

Los medios de cultivo son una mezcla equilibrada de nutrientes que en concentraciones adecuadas y con condiciones fsicas ptimas permiten un buen crecimiento de los microorganismos. Contienen una base mineral; fuente de carbono, nitrgeno y azufre; atmsfera adecuada y los factores de crecimiento necesarios.

Medio sintetico: son los medios que contienen una composicin qumica definida cuali y cuantitativamente. Se utilizan para el estudio de requerimientos nutricionales y para obtener resultados reproducibles. Medio minimo: son los medios que presentan la minima cantidad de nutrientes capaz de permitir el desarrollo de los microorganismos. Medio complejo: medios que contienen nutrientes de composicin qumica variable o no establecida. Son mezclas complejas y poco definidas de sustancias. Se forman a partir de extractos animales, vegetales, etc. Se utilizan cuando se necesita obtener una amplia gama de microorganismos. Medio enriquecido: medio que tiene un gran exceso de nutrientes y se utiliza para microorganismos que tienen grandes exigencias nutricionales. No pueden ser selectivos. Agar chocolate, agar cerebro-corazn, etc. Medio selectivo: medio que slo permite el crecimiento de un grupo de microorganismos e inhibe el de otros. Permite seleccionar y aislar microorganismos a partir de poblaciones mixtas Agar salado-manitol o Chapman (permite el crecimiento de ciertos Staphilococcus). Medio diferencial: medio que permite revelar caractersticas fisiolgicas de los microorganismos. Levine (permite visualizar la fermentacin de lactosa por viraje de un indicador cido-base), Agar sangre (permite visualizar la sntesis de hemolisinas).

Enriquecimiento: Es una tcnica que permite el desarrollo de un grupo de microorganismos a partir de una muestra que contiene una gran variedad de microorganismos. Se utiliza un medio selectivo lquido para favorecer la competencia entre los organismos y se incuba bajo determinadas condiciones. Aquellos microorganismos para los que el ambiente sea ms favorable crecern ms que los otros y finalmente sern predominantes.

Generalidades > Esporas bacterianas

Qu es una Endospora o Espora Bacteriana?

Las endosporas son formas de resistencia que desarrollan ciertos bacilos y cocos Gram positivos. Entre los bacilos formadores de endosporas se encuentran las especies Bacillus (aerbicos), Sporolactobacillus (microaerfilos), Clostridium (anaerbicos), Desulfotomaculum (anaerbico reductor de sulfato), Sporohalobacter (anaerbico halfilo) y Anaerobacter (anaerbico fijador de nitrgeno), mientras que los cocos son de la especie Sporosarcina (aerbicos).

Formacin de una Endospora en un Bacilo Gram Positivo

Etapa 0 La clula se encuentra en la etapa final de crecimiento exponencial y contiene dos cromosomas. Etapa 1 El DNA celular se hace ms denso y ocupa el centro de la clula. Comienza un importante recambio intracelular de protenas. Etapa 2 Se forma un tabique (septo) cerca del polo celular a causa de la invaginacin de la membrana citoplasmtica. El DNA es segregado en dos compartimentos (la espora en desarrollo y la clula madre). Etapa 3 El citoplasma de la espora en formacin queda delimitado por dos membranas debido al crecimiento de la membrana citoplasmtica alrededpr del protoplasto. La membrana ms interna se transformar en la membrana citoplasmtica de la espora en germinacin Etapa 4 Comienza a formarse la corteza de la espora por el depsito de un peptidoglicano esporoespecfico entre la membrana externa e interna. La espora aparece como un cuerpo refractario, comienza a acumularse calcio, y a sintetizarse Acido Dipicolnico. Etapa 5 Aparece el exosporio. La membrana exterior se transforma en la capa cortical por la incorporacin de protenas ricas en cistena. Esta etapa le confiere a la espora resistencia frente a los agentes

antimicrobianos. Etapa 6 Maduracin de la espora. Su citoplasma se vuelve homogneo y electrodenso. La capa cortical se completa. Etapa La endospora es liberada por la lisis de la clula. 7

Resistencia de las Endosporas

Las esporas bacterianas comienzan a formarse durante la fase estacionaria de cremiento cuando se han agotado uno o ms nutrientes del medio, pueden sobrevivir en ambientes adversos durante meses o aos, y una vez que las condiciones de crecimiento sean apropiadas pueden germinar y desarrollarse para formar clulas vegetativas. Las endosporas se caracterizan por un bajo contendo de agua, no tienen un metabolismo detectable, y carecen de compuestos de alta energa como ATP y otros nuclesidos trifosfatos. Adems, son altamente resistentes a la desecacin, congelacin, radiacin y a la accion de ciertas sustancias qumicas. Normalmente, el DNA de una clula procarionte sufre lesiones espontneas debido a la depurinizacin, desaminacin, alquilacin y oxidacn de los nucletidos o al efecto de la radiacin UV. Sin embargo, en las clulas vegetativas estos daos son rpidamente reparados por efectivos sistemas enzimticos. En cambio, las esporas bacterianas no presentan actividad enzimtica pero han desarrollado distintas estrategias que evitan la acumulacin de daos potencialmente letales en su DNA durante el estado de latencia. Estas son:

1. El bajo contenido de agua retarda o altera las reacciones qumicas que afectan al

DNA. Este menor contenido de agua disminuye la tasa de depurinizacin y la fotoqumica del DNA frente al UV respecto a las de una clula vegetativa. La radiacin UV no genera dmeros de timina en el DNA de una espora sino un producto denominado SP (spore photoproduct) que es un compuesto similar a una timiniltimina. 2. El DNA de la espora se encuentra unido a unas protenas denominadas alfa/betaSASP (small acid-soluble proteins) que disminuyen el dao trmico del DNA evitando la depurinizacin y cambian la reactividad fotoqumica del DNA frente al UV formando los SP. Estas protenas se hallan altamente coservadas en los gneros Bacillus y Clostridium, y son sintetizadas durante la esporulacin y degradadas durante la germinacin. 3. El DNA alterado durante la latencia es reparado en los primeros momentos de la germinacin. Las esporas presentan una elevada concentracin de cido dipicolnico que permite complejar grandes cantidades de calcio inico (Ca2+). El cido dipicolnico es una sustancia caracterstica de la espora pero no se encuentra en la clula vegetativa.

Germinacin de las Endosporas

La germinacion de una espora que lleva a la formacin de una clula vegetativa consiste de tres fases secuenciales:

1. Activacin: Es una proceso reversible que condiciona a la espora para germinar en

un ambiente adecuado. Involucra la desnaturalizacin reversible de algunas protenas. 2. Germinacin: Es una proceso irreversible en el que participan enzimas que contiene la espora. En este etapa hay actividad metablica, y se pierden las caractersticas de la espora como refractariedad y resistencia a agentes fsicos y qumicos. 3. Crecimiento: Hay una alta actividad biosinttica con sntesis de protenas, RNA mensajero y componentes estructurales como en una clula vegetativa. Se desarrolla la pared celular. Se forma la clula vegetativa.

Virologa

Virus procariontes > Generalidades

Los virus son molculas de DNA o RNA rodeadas por una envoltura proteica que necesitan clulas viables para poder replicarse. Los virus utilizan la maquinaria metablica de las clulas para sintetizar su material gentico y protenas de la envoltura. Existen

distintos tipos de virus que pueden infectar clulas procariontes o clulas eucariontes. Los bacterifagos o fagos son virus que se reproducen en clulas procariontes. El genoma de los fagos puede ser RNA simple cadena (MS2, Q), RNA doble cadena (phi 6), DNA simple cadena (phi X174, fd, M13) o DNA doble cadena (T3, T7, lambda , T5, Mu, T2, T4). Estos cidos nucleicos pueden contener bases inusuales que son sintetizadas por protenas del fago. En los T-pares el genoma no contiene citosina sino 5'hidroximetilcitosina, mientras que en otros tipos de fago alguna de las bases esta parcialmente sustituida.

Virus procariontes > Bacterifago T4

Replicacin del Bacterifago T4

Esquema del Ciclo de Replicacin de un Bacterifago T4 El ciclo de replicacin de un bacterifago T4 se puede dividir esquemticamente en distintas etapas, las que son comunes a otros virus bacterianos y eucariticos. 1. 2. 3. 4. 5. Adsorcin Inyeccin del material gentico viral Replicacin del material gentico viral Sntesis de las envolturas proteicas Empaquetamiento del DNA dentro de la envoltura proteica y ensamblaje de la envoltura 6. Lisis y liberacin de las partculas viral Adsorcin: El virus se fija o adsorbe a componentes de la superficie celular que actan como receptores especficos. La zona de adsorcin del virus es complementaria al receptor celular, por lo tanto un determinado virus slo puede infectar un nmero limitado de cepas celulares que contengan a un determinado receptor. La naturaleza de la zona de adsorcin vara con el tipo de fago. En el T4 se localiza en el extremo de la cola, en donde se encuentran la placa basal, las espculas y las fibras de la cola. Inyeccin del material gentico viral: Despus de la adsorcin, se produce un cambio configuracional en las protenas de la placa basal, alguna de las cuales tienen actividad

enzimtica y producen un poro en la membrana citoplasmtica de la clula. La vaina del fago se contrae y el material gentico viral ingresa en la clula, mientras que la envoltura proteica queda en el exterior. Replicacin del material gentico viral: El material gentico viral que ingresa en una clula contiene bases modificadas que evitan la degradacin por nucleasas bacterianas. Esta modificacin consiste en la glicosilacin y/o metilacin de algunas determinadas bases. En el caso del fago T4 se glucosila la base 5'-hidroximetilcitosina. Para lograr una efectiva replicacin del genoma viral se deben sintetizar algunas protenas ni bien el material gentico ingresa en la clula. Esta protenas tempranas reparan el poro de la membrana citoplasmtica por donde ingres el genoma viral, degradan el DNA bacteriano lo que proporciona una fuente de precursores, evita la sntesis de RNA y protenas bacterianas, y proporciona ribosomas para la sntesis de protenas del fago. Adems algunas de estas protenas tempranas participan en la sntesis de las bases inusuales. La forma de replicacin del genoma viral es dependiente del tipo de material gentico (si es RNA o DNA, si es simple o doble cadena). En el caso del fago T4, las molculas replicadas se aparean en los extremos y formando una molcula de DNA ms larga denominada concatmero. Despus una enzima corta esta larga molcula lineal en molculas ms pequeas de igual longitud. Las molculas de DNA del T4 tienen se caracterizan por estar permutadas circularmente (el DNA del T4 es lineal) de esta forma todas las molculas de DNA resultantes contienen genes completos y funcionales. La enzima del T4 que corta al concatmero produce molculas de DNA de tamaos similares pero no reconoce sitios especficos sobre la molcula, en cambio la enzima del T7 reconoce sitios especficos sobre el DNA. Sntesis de las envolturas proteicas: Las protenas de la envoltura (cpside, vaina, fibras, etc) son protenas tardas que se sintetizan despus de iniciada la replicacin del material gentico. La sntesis de cada componente proteico se realiza separadamente. En el caso del fago T4, el material gentico es encapsidado antes del ensamble del resto de los componentes. Ensamble: Todas las protenas de la envoltura se ensamblan para formar una partcula viral madura capaz de infectar a otra clula cuando sea liberada. Lisis celular y liberacin de las partculas virales: La lisis celular se debe a la sntesis de protenas tardas codificadas en el genoma del fago. En el fago T4, estas protenas son enzimas que lesionan la membrana citoplasmtica y la pared celular.