Resumen

La infeccin por Toxoplasma gondii es un problema significativo en los marsupiales australianos, y puede conducir a enfermedad devastadora y predisponer a los animales a la depredacin. T. gondiiinfeccin en los canguros es tambin de importancia para la salud pblica debido al comercio de carne de canguro. Una seroprevalencia moderada de T. gondii se observ en un estudio de los canguros grises occidentales ubicados en el rea metropolitana de Perth en Australia Occidental. De 219 canguros probado, el 15,5% (IC 95%: 10,7 a 20,3) fueron positivos para T. gondii anticuerpos mediante la tcnica ELISA desarrollado para detectar T. gondii IgG en los marsupiales macropod. Cuando se compara con la MAT disponible comercialmente (ensayo modificado de aglutinacin), el ELISA desarrollado estaba de acuerdo absoluto y se obtuvo un coeficiente de 1,00. De los 18 canguros ensayadas para determinar la presencia de T. gondii del ADN por PCR, los 9 canguros ELISA positivos probados PCR positivos y los negativos de ELISA 9 canguros dieron negativo que indica el protocolo de ELISA PCR fue altamente especfico y sensible y se correlacion 100% con el ensayo de PCR ms mano de obra. Palabras clave: Toxoplasma gondii , marsupial, serologa, ELISA, la prevalencia, Australia
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1. Introduccin
Marsupiales australianos se encuentran entre los anfitriones ms susceptibles a Toxoplasma gondii y el parsito se sabe que causa la infeccin crnica y aguda [ 1 , 2 ]. La infeccin en los marsupiales no siempre es fatal y puede resultar en una infeccin latente a largo plazo que puede ser reactivado durante momentos de estrs [ 3 ]. T. gondii infeccin puede hacer que un marsupial ms propensos a la depredacin por que afecta a su movimiento, la coordinacin y de la vista [ 4 , 5 ]. No slo es la infeccin con T. gondii atribuye a la disminucin en las poblaciones de marsupiales que causan en la naturaleza [ 6 , 7 ], la toxoplasmosis se asocia con una patologa generalizada y muerte en varias colecciones de marsupiales cautivos [ 8 - 16 ]. Cautiverio es un factor de estrs y por lo tanto se cree que incrementan la posibilidad de reactivar T. gondii infeccin [ 1 , 3 , 17 ]. Los signos clnicos de toxoplasmosis en marsupiales australianos varan e incluyen diarrea, dificultad respiratoria, prdida de peso, ceguera, dficit neurolgico y muerte sbita [ 18 ]. Comunes los hallazgos histopatolgicos incluyen la necrosis del miocardio, el msculo esqueltico y liso, con T. gondii quistes y taquizotos en reas de necrosis y neumona intersticial de los pulmones [ 8 ]. Debido a la dinmica de la T. gondiiinfeccin en los marsupiales, el conocimiento de la T. gondii estado serolgico de los marsupiales es un inmenso beneficio para su manejo en cautiverio y en libertad. Aunque un nmero de casos de toxoplasmosis se describen en los marsupiales en cautividad, hay pocos datos recientes sobre la prevalencia y la distribucin

de T. gondii infeccin en los marsupiales silvestres. T. gondii libres de seroprevalencia en los marsupiales que van del 3,3% en los wallabies de Bennett y del 17,7% en pademelons Tasmania mediante la tcnica ELISA [ 19 ], y el 15% en el embridado wallabies nailtail utilizando una prueba de aglutinacin del ltex [ 20 ]. Adems, T. gondii niveles de seroprevalencia de 6,7% en el este de prescripcin bandicuts [ 6 ] y el 6,3% en la zarigeya brushtail comn [ 7 ] se observaron con la MAT. No slo es la prevalencia de T. gondii en los marsupiales silvestres de importancia en trminos de conservacin, la presencia de infeccin en los canguros salvajes, en particular, es

de importancia para la salud pblica debido al comercio de carne de canguro. La infeccin con T. gondii puede ser diagnosticado en un nmero de maneras. Diagnstico con la histologa y la deteccin de bioensayo T. gondii organismos se, sino que requieren los tejidos de animales muertos. Adems, durante la infeccin crnica, T. gondii se propaga poco dentro de los tejidos y es a menudo difcil de detectar con la histologa [ 21 ]. Bioensayos, aunque altamente sensible y especfica en la deteccin de T. gondii infeccin, son caros y requieren mucho trabajo [ 22 ]. PCR deteccin de T.gondii ADN tambin requiere tcnicas invasivas de muestreo o necropsia. En contraste, la serologa se identifican los anticuerpos en suero, que son fciles de detectar durante las pruebas de sangre de rutina.Una de las limitaciones de la serologa es que anticuerpos de reaccin cruzada en animales infectados con parsitos coccidios relacionados pueden dar resultados positivos falsos. Durante los estudios que incluyeron la proyeccin de canguros grises occidentales para T. gondiianticuerpos, la prueba de aglutinacin modificada se utiliz. El MAT (ToxoScreen DA, bioMrieux, Francia) fue elegido para examinar muestras de sueros iniciales, ya que es la prueba ms utilizada para el diagnstico serolgico de T. gondii infeccin en marsupiales australianos [ 10 y 18 y 23 - 26 ] y es la nica prueba rutinaria a los marsupiales de pantalla para T. gondii infeccin en los parques zoolgicos en toda Australia. Los estudios publicados han demostrado una buena correlacin entre la positividad de MAT en los marsupiales y la infeccin con T. gondii [ 6 , 27 ]. La popularidad de la MAT en marsupiales se deriva de la prueba que no requieren un reactivo secundario especfico de la especie para detectar la T.gondii anticuerpos circulantes en los animales infectados, por lo que le permite ser usado en una amplia gama de especies de marsupiales. Adems, el TMA se ha utilizado ampliamente para el diagnstico de la toxoplasmosis en una gama de otras especies [ 28 ] y se utiliza como un ensayo sensible y especfico para detectar T. gondii anticuerpos IgG en los seres humanos [ 29 ], los ratones
[ 30 ], los cerdos [ 31 ], ovejas [ 32 ] y los felinos [ 33 , 34 ]. Para el cribado rutinario de canguros grises occidentales para T. gondiianticuerpos utilizando el MAT, sin embargo, encontramos que la prueba sea un costo prohibitivo. Por lo tanto, desarroll un ELISA para detectar T. gondii IgG en los marsupiales macropod. Este ELISA se encontr que era absolutamente de acuerdo con la MAT. El ELISA se utiliz para determinar la seroprevalencia de T gondii en macropods silvestres dentro del rea metropolitana de Perth. La prueba de ELISA fue validada posteriormente, utilizando un enfoque muy especfico de PCR para confirmar la presencia de la infeccin por T. gondii ADN en una cohorte de animales seropositivos.

2. Materiales y Mtodos
2,1. Prueba de aglutinacin modificada

Los sueros de 52 canguros grises occidentales ( Macropus fuliginosus ) se analizaron con el MAT disponible en el mercado. Los sueros se ensayaron en dos diluciones diferentes sueros; 1:40 y 1:4000, de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los sueros de control positivo y negativo incluido en el kit se utilizaron en cada ronda de muestras analizadas, adems de un control de antgeno compuesto de PBS.Una muestra de suero se determin que era T. gondii positivo cuando una reaccin de aglutinacin se observ a una dilucin de suero de al menos 1:40, basado en las instrucciones del fabricante.
2,2 ELISA desarrollo

MAT sueros examinados se utilizaron para optimizar la prueba de ELISA en el local. Antigen para el ELISA se prepar a partir del tipo I cepa RH de T. gondii taquizotos en cultivo de clulas Vero adaptado de [ 35 ]. Despus de cultivos celulares infectados fueron cosechadas, taquizotos se purificaron a partir de las clulas Vero por cizallamiento a travs de una aguja 30G a continuacin de la filtracin con un filtro de jeringa de 5m. Taquizoitos purificados se lavaron dos veces en PBS, pH 7,2. La suspensin de taquizotos en PBS se sonic durante 3 perodos de 1 minuto a un nivel de potencia de 5 (Sonicator Rprocesador ultrasnico, Misonix Incorporated, Farmingdale, EE.UU.). Los ncleos y las membranas se centrifugaron a 10.000 g durante 30 minutos para producir una preparacin taquizoto antgeno soluble. Un ensayo de protenas Bradford (Bradford inicio rpido reactivo colorante, BioRad Laboratories, Gladesville, Australia), se llev a cabo y la concentracin de antgeno ajustado con un volumen de PBS para producir una preparacin de protena 1000g/ml. Las concentraciones ptimas de antgeno, suero y reactivos para el ELISA se determinaron utilizando un sistema de tablero de ajedrez con el antgeno diluido en una direccin y una serie de diferentes sueros y las concentraciones de reactivos diluidos en direcciones opuestas. Cuatro diluciones de antgeno, 1 g / ml, 10 mg / ml, 25 g / ml, 50 mg / ml, se pusieron a prueba, con dos MAT positivos y dos muestras de sueros MAT negativos diluidos a 1:100, 1:200 y 1: 400. La dilucin del suero y el antgeno con la mayor diferencia entre positivo y negativo se seleccionaron entonces para su uso en ensayos para determinar la concentracin ptima de reactivo secundario y terciario. Tres diluciones de reactivo secundario, 1:500, 1:1000 y 1:2000, se ensayaron frente a tres diluciones de reactivo terciario, que eran 1:1000, 1:2000 y 1:4000 y una dilucin 1:400 de suero se utiliz con una concentracin de antgeno de 1 g / ml. Dos MAT positivos y dos MAT negativa occidental gris canguro sueros fueron utilizados en los ensayos de optimizacin iniciales. Despus de que el antgeno ptima

y las concentraciones de reactivos fueron identificados, 1 muestras positivas y negativas 5 sueros se ensayaron a 8 diluciones secuenciales de 1:400 a 1:51200, utilizando una concentracin de reactivo secundario y terciario de 1:1000 cada uno. La dilucin del suero con la mayor diferencia entre positivo y negativo fue elegido como la dilucin de suero para uso en el ELISA, lo que fue una dilucin del suero de 1:800. Despus de la concentracin del antgeno, los reactivos y los sueros se han optimizado, un total de 54 MAT probado macropod muestras de suero se utiliza para validar la prueba ELISA y establecer un positivo punto de corte para la densidad ptica. El punto de corte se determin mediante el clculo de la densidad ptica media (DO) ms 3 desviaciones estndar (SD) [ 36 , 37 ] de los sueros MAT negativos, este fue de 0,636. Una muestra de suero con una lectura de OD igual a la media ms 3 desviaciones estndar de sueros MAT negativo se utiliz como control positivo de referencia. Para el control de placa a placa variacin, 2 positivo de control negativo y 2 sueros, incluyendo el control positivo de referencia, se incluye en cada placa. Una muestra de suero se consider positiva cuando su valor de OD fue mayor que la del control positivo de referencia, como se describe en [ 38 ]. El protocolo final de la prueba de ELISA se inici con T. gondii antgeno diluido en tampn de carbonato 50 mM, pH 9,6, a una concentracin de 1 mg / ml. Cien microlitros de antgeno diluido se aadi entonces a cada pocillo de una placa de 96 pocillos de ELISA (Microlon 600, Greiner Bio-uno, Frickenhausen, Alemania). La placa de 96 pocillos se incubaron durante 1 hora a 37 C. Un ciclo de lavado seguido de aclarado que consista en PBS con 0,05% de Tween 20 durante tres perodos de 3 minutos. La placa de ELISA se bloquearon durante 1 hora utilizando 150 l de leche en polvo desnatada al 5% en PBS 0,05% de Tween 20 y se lav. Los duplicados de ensayo muestras de suero diluidas en 5% de leche descremada en PBS se aadi a un volumen de 100 l, y la concentracin de 1:800. Dos MAT seropositivos y seronegativos dos muestras de sueros MAT fueron incluidos en cada placa de 96 pocillos a prueba. Los sueros se incub durante 90 minutos a 37 C y la placa se lav antes de la adicin de 100l de comercialmente disponibles no conjugado de conejo anti-canguro IgG (Kangaroo IgG (H + I) antisuero, Bethyl Laboratories Inc, Montgomery, EE.UU.) a una concentracin de 1 : 1000. La placa de ELISA se incub durante otros 60 minutos y se lava despus de los cuales 100 l de peroxidasa de rbano picante (HRP)-conjugado anticuerpo anti-conejo (burro anti-conejo: HRP, Affinity Bioreagents , Golden, EE.UU.) se aadi a una concentracin de 1:1000. Despus del perodo de incubacin final de 60 minutos, se lav la placa y se aade 200 l OPD (o-fenilendiamina dihidrocloruro) Solucin de sustrato (Sigma Fast OPD, Sigma, San Luis, EE.UU.). La OPD se dej en la oscuridad a temperatura ambiente durante 15 minutos antes de la reaccin se detuvo con 50 l de 2M H 2 SO 4 . La densidad ptica se ley a 450 nm despus utilizando un espectrofotmetro. Las muestras de suero a prueba utilizando el MAT, y se utiliza para optimizar la prueba ELISA, se volvieron a ensayar con la final de protocolo de ELISA ( Tabla 1 ).

Tabla 1

El nivel de acuerdo entre el MAT comercialmente disponibles y un mtodo de ELISA en el oeste de canguros grises
2.3 La seroprevalencia estudio

Doscientos veinte canguro gris occidental de los sueros se obtuvieron a partir de 7 lugares diferentes en las afueras de la zona metropolitana de Perth durante un perodo de 18 meses. Los canguros fueron sacrificadas durante el Departamento de Medio Ambiente y Conservacin (DEC) los programas de control de la poblacin en reas tales como parques, reservas, campos de golf y granjas debido a la superpoblacin. Durante los programas de sacrificio un ID se asigna a cada animal y el sexo de los canguros seal. La sangre se recogi por aspiracin con aguja del corazn dentro de las 4 horas de la muerte del canguro. Los sueros se separ por centrifugacin y se almacen a -20 C. Cincuenta y cuatro de estas muestras de suero se sometieron a pruebas tanto en el MAT y ELISA, mientras que los restantes se sometieron a pruebas de ELISA solamente. El tejido cerebral y la lengua de 62 de los 220 canguros adultos fueron recolectados durante los programas canguro de sacrificio de animales en Perth. La cabeza de cada uno de canguro, se elimin en el campo y se transportan a nuestro laboratorio para su procesamiento. Las muestras de cerebro y la lengua se retiraron entonces de la cabeza de canguros adultos, se colocaron en recipientes estriles y se congelaron a -20 C. La bolsa joven de los 62 canguros tambin perdieron la vida en consonancia con las medidas de control de la poblacin de DEC, a travs de un traumatismo contuso en la cabeza. Las muestras de cerebro y el corazn fueron retirados de la bolsa de joven una vez transportados a nuestro laboratorio. Las muestras de tejido se colocaron en recipientes estriles y se congelaron a -20 C.
2,4 de extraccin de ADN y PCR

El gen B1 [ 39 ] y ITS1 lugar [ 40 ] fueron amplificados mediante PCR anidada para detectar T. gondiiADN en 9 ELISA positivo y 9 de ELISA negativas canguros grises occidentales en la que ambas muestras de suero y los tejidos se obtuvieron. Iniciadores B1 de genes utilizados para la PCR anidada fueron: Pml/S1, 5'TGTTCTGTCCTATCGCAACG; Pml/S2, 5'-TCTTCCCAGACGTGGATTTC; Pml/AS1, 5'ACGGATGCAGTTCCTTTCTG; Pml/AS2, 5'-CTCGACAATACGCTGCTTGA. ITS1 cebadores utilizados para locus hemi-nested PCR fueron: 22/FWD, 5'GGGAAGTTTTGTGAACCT; SU-5, 5'-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG; SU-2, 5 'GCTGCGTTCTTCATCGATGC. Las muestras de tejido cerebral probado incluido, lengua y las muestras del corazn. Se extrajo el ADN utilizando un QIAamp DNA MiniKit (QIAGEN, Hilden, Alemania). Para la PCR, 1l de ADN molde se aadi a un volumen de reaccin total de 50 l, que constaba de 5l de 10 x tampn de PCR (SIGMA

PCR tampn 10 x contiene 15 mM de MgCl 2 , Sigma, Saint Louis, EE.UU.), 5l de 2 mM dNTP, 0.4l de imprimacin 50pmol adelante, 0.4l de 50 pmol primer inversa y 1,25 U de Taq polimerasa (Taq polimerasa de ADN SIGMA A EE.UU., Sigma, Saint Louis,). ADN de la cepa RH de T. gondii se utiliz como un control positivo de PCR y los controles negativos de PCR consisti en agua destilada. La amplificacin consisti de desnaturalizacin a 94 C durante 5 minutos, seguido por 30 ciclos de 94 C durante 40 segundos, 60 C durante 40 segundos y 72 C durante 90 segundos, despus de lo cual se produjo un periodo de extensin de 10 minutos a 72 C. Productos de PCR se visualizaron utilizando 0,8% geles de agarosa teido con bromuro de etidio. Los productos PCR de la PCR ITS1 se secuenciaron para identificar una T.gondii secuencia de ADN especfica.
2.5 Estadsticas

Acuerdo entre el MAT y ELISA se estim mediante el coeficiente [ 41 ]. El valor p de Pearson de la prueba de Chi cuadrado [ 42 ] y la odds ratio [ 43 ] fueron utilizados para comparar los resultados de la seroprevalencia de canguros grises hombres y mujeres occidentales. Un valor de p menor de 0,05 fue considerado estadsticamente significativo. La odds ratio se calcularon los intervalos de confianza del 95%.
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3. Resultados
La prueba de ELISA en casa era absolutamente de acuerdo con el MAT como se ilustra en la Tabla 1 y se obtuvo un coeficiente de 1. Todas las 47 muestras de sueros MAT negativos fueron ELISA negativo y las 7 muestras MAT positivos los sueros fueron ELISA positivo ( Tabla 1 ). El protocolo fue optimizado ELISA usan de manera habitual en las muestras de canguro a prueba en elT. gondii estudio de seroprevalencia ( Tabla 2 ). De los 219 canguros grises del oeste de la muestra en el rea metropolitana de Perth, el 15,5% (95% IC: 10.7-20.3), eran seropositivos para T. gondii con el de la casa de ELISA. Canguros machos tenan una seroprevalencia general del 10,9% en comparacin con el 21,5% para las mujeres. Esta diferencia fue estadsticamente significativa (p = 0,038; OR 0,45 =, IC: 0,21 a 0,97).

Tabla 2

La prevalencia de T. gondii anticuerpos en los canguros grises occidentales segn lo determinado por ELISA Los resultados de la PCR fueron consistentes con los resultados del ELISA ( Tabla 3 ). T. gondii especfica de ADN se detect en los nueve animales que tenan suero que

fue ELISA positivo. Adems, todas las muestras de tejido de canguros ELISA negativos fueron PCR negativa para T. gondii ADN usando los cebadores para el gen B1 [ 39 ] y ITS1 lugar [ 40 ]. Limpieza productos de amplificacin de PCR se observ tanto para el gen B1 (datos no mostrados) y ITS1 locus ( Figura 1 ). Todas las muestras positivas ITS1 PCR fueron secuenciados, y el anlisis BlastN de las secuencias de ADN revel que los amplicones eran especficos para T. gondii (datos no presentados).

Tabla 3

PCR resultados de ELISA positivos y negativos de los canguros grises occidentales

Figura 1

ITS1 PCR en gel de agarosa. El carril 1, 100 puntos bsicos escalera del ADN. Carril 2, la bolsa joven 1, el cerebro. Calle 3, la bolsa joven 1, el corazn. Carril 4, bolsa de 2 jvenes, el cerebro. Calle 5, la bolsa de 2 jvenes del corazn,. Carril 6, la bolsa joven 3, el cerebro. Carril 7, la bolsa joven 3 de corazn. Carril 8, 8 para adultos, el cerebro.(ms ...)
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4. Discusin
La seroprevalencia de T. gondii en el oeste de canguros grises en este estudio se encontr que el 15,5% (IC 95%: 10,7 a 20,3). Esto es similar a las tasas de seroprevalencia del 17,7% se encuentran en el medio silvestre pademelons Tasmania [ 19 ], y la seroprevalencia de 15,5% en libres que van wallabies embridado nailtail [ 20 ]. La prevalencia de T. gondii anticuerpos en los wallabies de Bennett fue inferior en un 3,3% y tambin fue menor en el de menor tamao, las especies no macropod marsupiales como la zarigeya brushtail comn y orientales bandicuts rejas que eran del 6,3% [ 7 ] y el 6,7% [ 6 ], respectivamente. La seroprevalencia moderada de T. gondii en el medio silvestre canguros grises occidentales confirma canguros pueden sobrevivir con T. gondii infeccin en la naturaleza. Treinta y cuatro canguros en el rea metropolitana de Perth tenan evidencia de exposicin a T. gondii . La fuente de T. gondii para estos canguros es desconocida en este momento, ya que no hay informacin con respecto a la presencia de los gatos infectados en las reas

encuestadas. Los felinos son el nico husped definitivo de T. gondii y no hay ningn nativo de Australia felinos, dejando a los gatos domsticos y salvajes como la nica fuente de T. gondii ooquistes. Otra posible fuente de T. gondii infeccin es la transmisin congnita. La evidencia de la transmisin congnita en los marsupiales hasta la fecha es anecdtica [ 10 , 11 ] sin embargo, est bien establecido en una serie de especies, incluyendo ovejas, ratones, ratas, gatos y seres humanos [ 44 - 46 ]. Los canguros son herbvoros, por lo tanto, T. gondiitejido animal infectado es una fuente probable de infeccin en los canguros grises occidentales probadas. En este estudio de los canguros grises occidentales, la prevalencia en los varones fue significativamente inferior a la de los canguros femenino (p <0,05). Algunos otros estudios publicados han identificado una significativamente mayor de T. gondii seroprevalencia en las ovejas de las cabras y en comparacin con sus contrapartes de sexo masculino [ 47 y 48 ]. Es posible que las diferencias de comportamiento entre canguros grises masculinos y femeninos occidentales representa sus distintos niveles de exposicin a T.gondii . Por ejemplo, se piensa que los canguros hembra es capaz de cortar el csped corto mejor que los hombres [ 49 ]. Los varones se puede forzar a otros alimentos y puede ser visto acampado por separado de las mujeres [ 50 ]. Las hembras que pastan cerca del suelo puede ser por tanto ms probabilidad de estar expuestos a T. gondii ooquistes en el suelo. La concordancia absoluta entre la T. gondii resultados de ELISA y los resultados de la PCR se encontr en los 18 canguros probados utilizando el ELISA y PCR. Otros estudios han encontrado PCR a ser mucho menos sensible que la serologa para detectar T. gondii infeccin en cerdos [ 22 y 51 ] y el ganado [ 52 ]. La PCR utilizada en este estudio se encontr que tena una alta sensibilidad para detectar T. gondiien el ADN de ELISA positivos canguros grises occidentales, lo que podra indicar que los marsupiales tienen una carga mayor de tejido de los parsitos que, por ejemplo, cerdos y ganado. Todos los productos de PCR fueron secuenciados ITS1 y los resultados confirmaron que los amplicones fueron que de T.gondii en las muestras de tejido de los animales seropositivos. T. gondii no se detect ADN en los tejidos de 9 canguros seronegativos, que consista en 3 adultos y 6 bolsa joven. Aunque T. gondii ha sido detectado en animales seronegativos anteriormente [ 53 ], esto se inform con poca frecuencia.Resultados de la PCR de ADN extrado de los canguros seropositivos y seronegativos correlacionados exactamente con los resultados serolgicos sugieren que el ELISA desarrollado es sensible y especfico. Cincuenta y dos MAT-analizaron muestras de suero se utiliza para validar y optimizar el ELISA desarrollado en este estudio. Este ELISA se encontr que tena una sensibilidad y especificidad comparable a la MAT, con base en su valor Kappa de 1. La principal ventaja de la prueba ELISA es que puede ser utilizado para cribar grandes cantidades de muestras de suero ms rentable que la MAT comercialmente disponible. Resultados de ELISA tambin puede ser fcilmente interpretado basado en el punto de corte para la densidad ptica, en comparacin con un IFAT donde

diapositivas deben ser examinados por los lectores experimentados. Debido a la dilucin de suero relativamente alto utilizado en este protocolo de ELISA, slo una pequea cantidad de suero marsupial se requiere para detectar T.gondii anticuerpos. Esto es especialmente beneficioso en la investigacin de la fauna silvestre, ya que slo pequeas cantidades de suero son generalmente obtienen de animales vivos atrapados y stos se utilizan a menudo para comprobar varias condiciones. Este ELISA tericamente podra ser fcilmente modificado para adaptarse a no macropodine marsupiales cambiando el reactivo secundario. Se desconoce si los canguros estn infectados con T. gondii que no sea coccidios cruzan y producen anticuerpos reactivos. Cruce anticuerpos reactivos a T. gondii reducir la especificidad de las pruebas serolgicas. La especificidad de la MAT en los marsupiales se desconoce, sin embargo, como la MAT es la prueba ms utilizada y ampliamente aceptado para la deteccin de anti- T. gondii IgG en los marsupiales, el MAT se utiliz en este estudio como una prueba de referencia para optimizar y validar la in-house ELISA protocolo. PCR de los tejidos de los canguros ELISA positivo y negativo se utiliz para validar los resultados del ELISA. El nmero y la variedad de coccidios que infectan a los marsupiales australianos se desconoce, por lo tanto el nivel de reactividad cruzada que existe en los canguros salvajes infectados con coccidia otro es desconocido. Adems, el acuerdo absoluto entre el MAT y ELISA sugiere que el ELISA desarrollado tiene una especificidad similar a la MAT y es adecuado para su uso en estudios de seroprevalencia y serodiagnstico. La alta concordancia entre los resultados de ELISA y PCR resultados tambin sugieren que el ELISA desarrollado es sensible y especfico. En este estudio se determin una seroprevalencia moderada de T. gondii en el medio silvestre canguros grises occidentales, con una en la casa de ELISA. La infeccin con T. gondii en los marsupiales tiene el potencial de progresar a enfermedad fulminante, altera la forma en marsupiales deben ser manejados en cautiverio y es un problema de salud pblica como la carne de canguro es ahora comnmente consumida por los seres humanos y felinos domsticos [ 54 ]. Wild canguros grises occidentales se cosechan para la carne en Australia [ 55 ]. La carne de canguro es comnmente disfrutado de la carne de canguro y rara mascota regularmente se sirven crudos. T. gondii bradizotos permanecer infectivos cuando la carne est bien cocida, por lo que la ingestin de carne de canguro raras o prima un factor de riesgo en la T. gondii transmisin [ 54 ]. T. gondii canguros infectados no son slo una fuente de infeccin para los seres humanos, sino tambin para los gatos domsticos, que posteriormente puede arrojar ooquistes y perpetuar el ciclo de vida.
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Agradecimientos
Queremos agradecer a Lisa Hulme-Moir para la prestacin de canguro gris occidental sueros para el estudio de seroprevalencia. Tambin queremos dar las gracias a Glen

Goudie y su equipo por su gran ayuda con la recogida de muestras de canguro gris occidental. Nick Smith de la Universidad de Tecnologa de Sydney es reconocido por ofrecer T. gondii taquizotos para el cultivo celular Vero. Esta investigacin fue financiada en parte por el Programa de Investigacin Intramural del NIH y del NIAID (MEG).
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Notas al pie
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