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Controles internos para la deteccin de micoplasmas contaminantes por PCR

1. 2. 3. 4.
Resumen Introduccin Diagnstico Controles internos de amplificacin en los ensayos de PCR para la deteccin de micoplasmas contaminantes 5. Controles internos de amplificacin 6. Tipos de CIA 7. Sistemas de amplificacin de los controles internos 8. Conservacin de los CIA 9. Conclusiones 10.Bibliografa

Resumen
Las contaminaciones causadas por micoplasmas constituyen uno de los problemas ms importantes y frecuentes cuando se trabaja con lneas y cultivos celulares, sueros para la elaboracin de medios de cultivo y en la industria de productos biofarmacuticos. La tcnica de reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) ha sido ampliamente utilizada para la deteccin de micoplasmas contaminantes.La presencia de sustancias que pueden inhibir la amplificacin de los cidos nuclicos en cultivos celulares, suero y algunos productos de inters biomdico como vacunas, constituye una limitacin de la PCR como mtodo diagnstico ya que puede disminuir su sensibilidad y por tanto su eficiencia. Es por esto que en la actualidad los sistemas de diagnstico de micoplasmas contaminantes por PCR incluyen entre sus controles de calidad un control interno de amplificacin que permita la deteccin de resultados falsos negativos ocasionados fundamentalmente por la presencia de inhibidores en la reaccin. El presente trabajo tuvo como objetivo suministrar una revisin actualizada sobre el uso de controles internos en los ensayos de PCR desarrollados para la deteccin de micoplasmas contaminantes en cultivos celulares, suero y productos biofarmacuticos, resaltando los principales tipos de controles internos utilizados en cuanto a estrategias de diseo y amplificacin de los mismos. Palabras clave: micoplasmas, CIA, PCR, inhibidores, diagnstico Abstract Mycoplasmas contamination is one of the most serious and common problems of lines and cell cultures management and in the biopharmaceutical industry .PCR techniques have been widely used for contaminant mycoplasmas detection. The presence of substances that can inhibit nucleic acids amplification in cell cultures, serum and in some products of biomedical interest as vaccines constitutes a limitation of the PCR as a diagnostic method due to it can reduce its sensitivity and therefore its efficiency. That is why, nowadays, mycoplasmas diagnostic systems include in its quality controls, an internal control that allows the identification of amplification inhibitors and false-negatives results within the assay. The aim of this article was to provide an updated review of the use of PCR internal controls for mycoplasmas detection in cell cultures, serum and biopharmaceutical products, the main types of internal controls used regarding of design and amplification strategies. Key words: mycoplasmas, internal control, PCR, inhibitors,diagnosis

Introduccin
Los micoplasmas constituyen un amplio grupo de microorganismos pertenecientes a la clase Mollicutes , (del latn molli: suave y cutes: piel ),que se distinguen del resto de las bacterias por la ausencia de pared celular, (1). Fueron reportados por primera vez en 1898 por los cientficos Nocard y Roux en el Instituto Pasteur, tras el cultivo exitoso del agente de la Pleuroneumona Contagiosa Bovina,(2) . Los micoplasmas fueron considerados durante mucho tiempo como virus, debido a su diminuto tamao y la capacidad de atravesar filtros que bloquean el paso de bacterias ordinarias; hasta 1930 en que se descubri la verdadera naturaleza de los virus y se hizo evidente que los micoplasmas no podas ser definidos como tales ya que presentan ambos tipos de cidos nucleicos, crecen en medios artificiales y se dividen por fisin binaria, al igual que las bacterias. Con el descubrimiento en 1935 de las formas L bacterianas, los micoplasmas fueron

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considerados dentro de este grupo debido a las similitudes en su morfologa microscpica y la forma tpica de huevo frito de sus colonias.La presicin de los criterios morfolgicos, a travs, del estudio de la ultraestructura de los micoplasmas , sus propiedades bioqumicas y antignicas, permiti su posterior separacin taxonmica de las formas L bacterianas ,(3). El trmino mycoplasma (del griego: mykes que significa hongo y plasma que significa algo formado y moldeado ) fue acuado por los investigadores Edward y Freundt en los aos 50 , siendo usado para describir al nico micoplasma conocido hasta ese momento, la especie M. mycoides,la cual tiene la caracterstica distintiva entre las otras especies , de presentar un patrn de crecimiento semejante al micelio fungal ,reemplazando de esta forma al trmino organismos semejantes al de la pleuropneumonia ,(en ingls PPLO: pleuropneumonia like organisms),(2). Un gran nmero de especies de micoplasmas han sido descritas como patgenos de humanos, mamferos, reptiles, peces, artrpodos y plantas y cada vez se descubren nuevos hospederos,(1). Adems de su importancia como agentes patgenos, los micoplasmas se consideran como uno de los contaminantes ms frecuentes e importantes de sueros,cultivos celulares y en la industria biofarmacutica desde la etapa de investigacin hasta la fase de desarrollo clnico , (4). Los micoplasmas como contaminantes de cultivos celulares, sueros y productos biofarmacuticos En 1956 Robinson y colaboradores reportaron la primera infeccin por micoplasmas en cultivos celulares, al detectar la presencia de estos microorganismos como contaminantes en controles negativos de cultivos celulares,(2). Actualmente se reporta que entre el 15 y el 80% de los cultivos celulares testados estn infectados con micoplasmas,(5-6).La incidencia de contaminacin por una sola especie de micoplasma es de un 15 a un 35% a nivel mundial, pudiendo llegar hasta un 65 a 80%, mientras que la incidencia de contaminacin simultnea por 2 o ms especies oscila entre un 7 y un 60%,(7-8). Entre las 20 especies de micoplasmas que han sido aisladas de cultivos celulares contaminados (9), M. arginini, M. hyorhinis, M. fermentans, M. orale y Acholeplasma laidlawii se han identificado como causantes del 95 % de las contaminaciones ,(5-6, 10). Se ha reportado M. orale como la especie de contaminante ms comn con una frecuencia de un 20 a 40%, seguido de M. hyorhinis con una frecuencia de 10 a 40%, la frecuencia de contaminacin para el resto de las especies es de un 20 a 30% para M. arginini , de un 10 a un 20% para M. fermentans y M. hominis (9) y de un 5 a un 20% para Acholeplasma laidlawii, segn la coleccin alemana de microorganismos y cultivos celulares (DSMZ), 2004.Las especies M. orale, M. fermentans, y M. hominis se hallan comnmente en el tracto orofarngeo de los humanos , lo cual explica que el personal de laboratorio constituya una de las fuentes de contaminacin de los cultivos celulares con micoplasmas. Las especies M. arginini y A. laidlawi han sido identificadas en el suero bovino , por otra parte M. hyorhinis es un patgeno frecuente de cerdos, de ah que el suero bovino o porcino utilizado para la elaboracin de los medios de cultivo pueda ser tambin una fuente de contaminacin, (11).Otras fuentes de contaminacin son el equipamiento de laboratorio, los tejidos usados para la elaboracin de cultivos primarios y otras lneas celulares ya contaminadas, (8, 11). Debido a la ausencia de pared celular estos microorganismos no producen turbidez en el medio que contaminan, tampoco cambio de coloracin del mismo, provocando que la contaminacin no sea muy evidente, sin embargo, los cambios morfolgicos, bioqumicos, antignicos y genticos que provocan en las clulas infectadas pueden sugerir su presencia,(8, 12). Estas contaminaciones en la mayora de las ocasiones pueden provocar severos daos a la clula, como son: alteraciones en el crecimiento (la monocapa tiene microscpicamente una apariencia arrugada y se aglutina durante la suspensin), en patrones de enzima, en la composicin de la membrana celular, aparicin de aberraciones cromosomales y la induccin de cambios citopatognicos(3).Sus efectos dependen de la especie de micoplasma contaminante, el tipo de clula infectada, las condiciones de cultivo, y la intensidad y duracin de la infeccin,(8, 13).Estas infecciones pueden alterar los resultados de experimentos biolgicos o la calidad de los productos biofarmacuticos,(13).

Diagnstico
La deteccin de contaminaciones biolgicas en productos biofarmacuticos constituye un punto importante dentro de los sistemas de calidad, en este sentido existen normas muy estrictas establecidas por las agencias reguladoras y entre ellas, especficamente, normas que establecen la deteccin de micoplasmas como prueba determinante para la liberacin o no de estos,(3, 14-16). La implementacin en la actualidad de programas de control de calidad ms eficientes ha contribuido a la disminucin de la frecuencia de contaminacin por micoplasmas. La mejor vigilancia y manejo de los sueros, medios y materia prima por parte de los productores en la industria biofarmacutica ha reducido significativamente la introduccin potencial de micoplasmas a partir de estas fuentes, (4).

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Para el diagnstico e identificacin de micoplasmas contaminantes se han empleado diversas metodologas que incluyen el cultivo microbiolgico , mtodos bioqumicos, inmunolgicos y moleculares, (17-19). Entre los mtodos descritos por la Farmacopea Europea 2007 para el diagnstico de micoplasmas contaminantes en bancos y lneas celulares, semillas virales y clulas controles se encuentran el cultivo microbiolgico y el mtodo del cultivo celular indicador, este ltimo se puede usar adems para el anlisis de medios de cultivo, mientras que para el diagnstico en vacunas, cosechas virales y productos finales de produccin el mtodo recomendado es el cultivo microbiolgico. Aunque se ha sealado que los procedimientos moleculares no pueden reemplazar totalmente a los mtodos convencionales (20), los mtodos de amplificacin de cidos nuclicos han sido aceptados por la Farmacopea Europea 2007 como mtodos alternativos del cultivo microbiolgico y del mtodo del cultivo celular indicador, despus de una adecuada validacin de los mismos, (21). En los ltimos aos las tcnicas de hibridacin de cidos nuclicos (HAN) y la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) han sido ampliamente utilizadas en la identificacin de micoplasmas, (22-24) . La PCR actualmente se ha convertido en una herramienta muy til y eficiente, no solo para la deteccin de micoplasmas contaminantes en cultivos celulares, suero y productos biofarmacuticos, sino adems para su identificacin a nivel de gnero y especie, (13, 23). Con el objetivo de incrementar la sensibilidad en el diagnstico se han desarrollado diferentes tipos de PCR tales como PCR anidado,(22) y RT-PCR , este ltimo usa como molcula diana el ARN , la cual se encuentra en un mayor nmero de copias por clula que su correspondiente ADN,(10).Se han desarrollado otros tipos de PCR como PCR-ELISA,(25), PCR-RFLP , (26),PCR mltiples, (27) y ms recientemente PCR en tiempo real,(27-28) .Los ensayos de PCR para micoplasmas diseados a partir de la regin altamente conservada del ARNr 16S de los Mollicutes permiten diagnosticar un amplio rango de estos microorganismos. En nuestro laboratorio, MYCOLAB, se han empleado para el diagnstico de micoplasmas en cultivos celulares, sueros y productos biofarmacuticos, los cebadores diseados por Van Kuppeveld y cols., 1994 a partir de una regin del ARNr 16S de los Mollicutes. El uso de estos cebadores ha permitido la deteccin de un 15.6% de muestras contaminadas durante los aos 20092010, con respecto al cultivo microbiolgico que solo permiti la deteccin de un 2. 4 % en el mismo perodo. Tambin se han diseado cebadores especie-especfico complementarios a la regin intergnica entre el ARNr 16S (29) y el 23S y cebadores complementarios al extremo 5 del ARNr 23S (30). Los PCR especieespecfico permiten tener una informacin sobre el posible origen de la contaminacin identificando la especie de micoplasma contaminante (11), sin embargo, no permiten la deteccin de otras especies de Mollicutes que pudieran estar presentes (5, 13), en una infeccin mixta a no ser que se empleen varios cebadores especie-especficos, por ejemplo, en un formato mltiple.

Controles internos de amplificacin en los ensayos de PCR para la deteccin de micoplasmas contaminantes
Inhibidores de la PCR en la deteccin de micoplasmas contaminantes A pesar de las ventajas del PCR, en ocasiones su utilidad como mtodo diagnstico se ha visto afectada por la presencia de sustancias que inhiben la amplificacin de los cidos nuclicos en las muestras que se analizan. Estos inhibidores pueden afectar la sensibilidad de deteccin del ensayo, incluso cuando estn presentes en pequeas cantidades,(31), conduciendo a la generacin de resultados falsos negativos (32) y a la bsqueda de mtodos cada vez ms eficientes de procesamiento de la muestra previo a la PCR para facilitar la amplificacin del ADN diana en presencia de incluso trazas de sustancias inhibitorias de la amplificacin, (31). De manera general se han reportado diversas muestras biolgicas como inhibitorias de la amplificacin de los cidos nuclicos. Algunos cultivos de clulas pueden presentar inhibidores de la PCR , ((13, 33), como por ejemplo la melanina presente en las clulas de melanoma,(34). La presencia de fenol o formaldehdo en algunas vacunas pudiera ser la causa de inhibicin de la amplificacin del ADN, (35). Tambin muchas drogas para humanos contienen heparina, la cual es un conocido inhibidor que permanece en el ADN extrado, (3638). En suero ,D.S. Konet y cols, 2000, reportaron la presencia de posibles inhibidores de la RT-PCR , (39). Los inhibidores de la PCR no solo pueden encontrarse en las muestras originales, sino que pueden ser aadidos a la mezcla de reaccin durante el procesamiento de la muestra previo a la amplificacin del ADN, (31, 40-41).Entre estos inhibidores se incluyen los reactivos usados durante el paso de extraccin y purificacin del ADN, ejemplos conocidos son el etanol, fenol,isopropanol, detergentes inicos como el desoxicolato de sodio, sarcosil y dodecilsulfato de sodio (SDS), algunas sales cuando se encuentran en exceso en la mezcla de reaccin pueden tener accin inhibitoria sobre la amplificacin de los cidos nuclicos

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, como el KCl, NaCl, entre otras, (40-41). Las sustancias que se liberan del poliestireno despus de la exposicin de las pipetas a la luz ultravioleta durante su descontaminacin tambin pueden inhibir la amplificacin del ADN, (42). Aunque no se conocen bien los mecanismos especficos de accin de los inhibidores, si se sabe que de manera general estos pueden actuar mediante inactivacin de la ADN polimerasa termoestable, degradacin o captura de los cidos nuclicos o interferencia con el paso de lisis celular durante el proceso de extraccin del ADN (31). La unin directa de algunos agentes al ADN de simple y doble cadena permite la purificacin simultnea del inhibidor con el ADN interfiriendo con la amplificacin posterior del mismo,(41). La ADN polimerasa termoestable es tambin una de las dianas de accin de los inhibidores, probablemente sea este reactivo de la mezcla de PCR el sitio de accin ms importante de las sustancias inhibitorias,(31). Los inhibidores pueden bloquear la actividad enzimtica de las ADN polimerasas afectando la disponibilidad de cofactores requeridos por esta para su actividad. Por ejemplo, cualquier sustancia que reduzca la disponibilidad de Mg 2+ o interfiera con su unin a la ADN polimerasa, puede inhibir el PCR, (41). Las ADN polimerasas presentan diferencias en cuanto al grado de sensibilidad o resistencia que manifiestan frente a la accin de los inhibidores de la PCR. Se ha demostrado que la Taq DNA polymerasa es ms sensible a la accin de los inhibidores que otras polimerasas termoestables como la Tth, de Thermus thermophilus y la Tfl de Thermus flavus. Esto corrobora la afirmacin de que el grado de inhibicin del PCR depende del tipo de polimerasa termoestable usada en la reaccin, (43).

Controles internos de amplificacin

Una forma de identificar la presencia de inhibidores causantes de resultados falsos negativos en los ensayos de PCR es incorporar en la reaccin un control interno de amplificacin (CIA), (44). Este no es ms que un fragmento de ADN no diana que se amplifica simultneamente con la diana en el mismo tubo de reaccin(32). La seal de amplificacin del CI debe ser visible independientemente de la presencia del ADN diana, no obstante, en ocasiones, cuando hay amplificacin de la diana, la seal del CI puede estar ausente, esto sucede sobre todo cuando el ADN diana se encuentra en elevada concentracin. La ausencia del amplicn del CI y de la diana simultneamente indica que la muestra contiene inhibidores que impiden la amplificacin o fue contaminada con estos durante la extraccin del ADN, en este caso, el resultado no es vlido y la muestra debe re-analizarse, (33). Los primeros ensayos de PCR desarrollados para la deteccin de micoplasmas contaminantes no incluan controles internos de amplificacin (18). En un ensayo de PCR sin CIA la ausencia de seal positiva pudiera indicar que no hay ADN diana presente en la muestra. Sin embargo, tambin pudiera ser indicativo de mal funcionamiento del termociclador, de los reactivos de la mezcla o de la presencia de inhibidores en la muestra que impiden la amplificacin de los cidos nuclicos,(32, 45). Actualmente los mtodos de diagnstico por PCR desarrollados para la deteccin de micoplasmas contaminantes cuentan con controles internos de amplificacin, (10, 19), aunque se ha planteado que la necesidad o no de incluir estos controles en los ensayos debe ser determinado de manera puntual debido a la dificultad de su implementacin y a la posibilidad de que afecte la sensibilidad del ensayo. Se plantea que si el porciento de error durante la evaluacin del PCR es menor o igual al 2% no es necesario incorporar de manera rutinaria un CIA en la reaccin a menos que las consecuencias mdicas de un resultado falso negativo sean severas, (46).

Tipos de CIA
Un CIA puede ser un fragmento de ADN o ARN forneo que se adiciona en el tubo de reaccin o un ADN endgeno que se encuentra de manera habitual en el material que se analiza y que por tanto siempre debe amplificarse ,(44). El gen de la glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) presente en las clulas de ovario de hmster ha sido usado como CIA endgeno para la identificacin de resultados falsos negativos durante la deteccin de micoplasmas contaminantes en cultivos celulares de ovario de hmster Chino usados en el desarrollo de protenas recombinantes teraputicas, (47). El uso de secuencias endgenas como IAC, a diferencia de los controles exgenos, permite monitorear todos los pasos del ensayo desde la extraccin del ADN hasta la amplificacin, puesto que el ADN endgeno usado como IAC se purificar simultneamente con la diana. Adems, permite monitorear la integridad del cido nuclico diana, pues en materiales colectados, almacenados o procesados incorrectamente tanto el

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ADN diana como el control pueden estar ausentes o degradados, dando como resultado una seal de amplificacin negativa,(48). Secuencias de ARN han sido utilizadas tambin como CI, especficamente en los ensayos de RT-PCR empleados para la deteccin de micoplasmas contaminantes. DB Brown y cols., 2009, emplearon el ARN genmico total de la lnea celular humana HEK 293 como CI exgeno para verificar la ausencia de inhibidores de la amplificacin y monitorear los pasos de extraccin, retrotranscripcin y amplificacin durante la validacin de un ensayo de RT-PCR para la deteccin de Mollicutes contaminantes includos en los gneros Acholeplasma y Mycoplasma, (10).Cuando se usa este tipo de controles es importante tener en cuenta la accin de RNAsas presentes naturalmente en muestras clnicas. Los controles internos de ARN se pueden introducir en fagos, como el MS2, para protegerlos contra la degradacin por parte de estas RNAsas, (46).

Sistemas de amplificacin de los controles internos

El CI puede ser amplificado con cebadores diferentes o usando los mismos cebadores del ADN diana. En este sentido se definen dos sistemas de amplificacin: un sistema no competitivo en el cual se usan cebadores diferentes y un sistema competitivo cuando se usan los mismos cebadores.Esto ltimo supone una competencia entre el CI y la diana por los cebadores, provocando una disminucin en el lmite de deteccin del ensayo y por tanto en la eficiencia de amplificacin. A pesar de esto, se ha recomendado el desarrollo de sistemas de amplificacin competitivos a fin de evitar interacciones indeseables cuando se emplean mltiples cebadores y de esta forma garantizar iguales condiciones de reaccin para ambos fragmentos de ADN, (32). Diseo y construccin de los CIA Un aspecto importante a tener en cuenta cuando se realiza el diseo de los controles internos es que el producto de su amplificacin debe ser fcilmente diferenciable del amplicn del ADN diana, ya sea por la talla en un gel de electroforesis o por diferencias en la secuencia de nucletidos usando una sonda de hibridacin especfica,(32) . El diseo y construccin de CIA para sistemas competitivos se puede llevar a cabo mediante delecin, insercin o modificacin de las secuencias entre los sitios de reconocimiento de los cebadores. Para esto se disean usualmente estrategias de clonaje que pueden ser largas y laboriosas debido a los sucesivos pasos de digestin, ligazn, clonaje y purificacin,(32). El CIA usado por Uphoff y Drexler, 2002 en un anlisis comparativo de PCR para la deteccin de infecciones por micoplasmas en lneas celulares continuas, (Stratagene, Amsterdam, The Netherlands), se obtuvo mediante el clonaje del producto de PCR de Acholeplasma laidlawii en un vector (pGEM-T vector), al cual posteriormente se le insert un fragmento de 476 pb. Este es un sistema competitivo cuando Acholeplasma laidlawii es el contaminante y no competitivo cuando los contaminantes son otros micoplasmas,(9, 49). En un sistema de amplificacin competitivo uno de los parmetros crticos a considerar es la concentracin del CI autilizar. El clculo del nmero correcto de copias de CI usado en el PCR es muy importante pues demasiada cantidad de CI puede competir con el ADN diana e interferir con su amplificacin ocasionando por tanto, un resultado falso negativo, sobre todo si el ADN diana est presente en baja concentracin. Es por esto que los CI se usan en concentraciones muy cercanas al lmite de deteccin del ensayo,(32). Rosenstraus y cols., 1998, desarrollaron un mtodo para calcular el nmero de molculas en un stock de CI basado en que a una concentracin de 20 a 40 copias del mismo por reaccin, las molculas se distribuyen segn la ley de Poisson. La concentracin del stock de CIA se calcula realizando diluciones seriadas del CIA y llevando a cabo mltiples amplificaciones. Mediante la frmula C=-ln(Pn) , donde P es el nmero de rplicas de amplificacin negativas obtenidas a una dilucin particular del stock, se obtiene el nmero de unidades generadoras de seal, C, la cual se define como la menor unidad en un volumen de solucin dado que generar una seal positiva de PCR, (48) . Este mtodo puede resultar largo y laborioso, (32), sin embargo, tiene la ventaja de ser independiente de cualquier medida espectrofotomtrica o fluoromtrica, las cuales se ven afectadas por la interferencia de los reactivos residuales de la purificacin de los plsmidos de CI o productos de PCR del mismo. Otro parmetro crtico a tener en cuenta en este sistema es la talla del CI, ya que fragmentos de ADN con menor talla se amplifican de manera preferencial con respecto a fragmentos de mayor talla. Por esto,es preferible la utilizacin de CI de mayor talla que el ADN diana a fin de garantizar que la competencia no limite la amplificacin de la diana, (32). El sistema de PCR MycoSensor utilizado para la deteccin rpida de micoplasmas contaminantes incluye un CI de 500-bp fcilmente diferenciable del amplicn de 315 pb del ADN diana. Otro ejemplo es el CI de 502 pb del ensayo MycoScanTM, donde los cebadores de la diana amplifican un fragmento de 154-237 bp segn la especie de micoplasma contaminante presente en la muestra. Tambin se han desarrollado CI de tallas menores que la de la diana, a pesar de las desventajas que estos presenteas. El sistema de PCR VenorGeM excluye la posibilidad de resultados falsos negativos empleando como CIA un fragmento

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de ADN de 191 pb insertado en un plsmido de E.coli , mientras que los cebadores de la diana amplifican un fragmento de 270 pb del ARNr 16S del genoma de los micoplasmas. El CI usado en el ensayo de SouthernBiotech para la deteccin de micoplasmas tiene una talla de 270 pb y se diferencia fcilmente en un gel de electroforesis del amplicn de 448-611 pb que se obtiene con los cebadores especficos de la diana en dependencia de la especie de micoplasma presente.

Conservacin de los CIA

Los IAC se conservan muy bien insertados en un plsmido, en una clula transformada, mantenida en glicerina, liofilizada o congelada.Tambin es posible conservarlos como ADN libre en un buffer alcalino (TE 0.1 M, PH 8), el cual lo estabiliza, o liofilizados, donde la degradacin o prdida del material gentico es mnima.Es importante tener en cuenta que el ADN puede unirse a la supeficie de los tubos de polipropileno, lo cual induce cambios conformacionales en el mismo, influyendo en su eficiencia de amplificacin.Se ha planteado que los tubos de polialmero son ms adecuados para la conservacin ya que no muestran adsorcin o degradacin del ADN, (32).

Conclusiones
La presencia de inhibidores de la amplificacin del ADN en el suero empleado para el cultivo de clulas y en algunos productos biofarmacuticos como vacunas o la introduccin de estos durante el manejo de la muestra, pudiera ser la causa de resultados falsos negativos durante el diagnstico por PCR de micoplasmas contaminantes. El uso de CIA basado en estrategias de amplificacin competitivas constituye una alternativa recomendable para la deteccin de muestras inhibitorias y la disminucin por tanto, de los resultados falsos negativos. La talla y la concentracin de los controles internos usados en el PCR son parmetros crticos a tener en cuenta y es necesario llevar a cabo una adecuada evaluacin y optimizacin del sistema a fin de garantizar que la inclusin de los mismos no compita con el ADN diana en la reaccin y que por tanto no disminuya la sensibilidad analtica del ensayo. La utilizacin de controles internos de PCR aumenta la confiabilidad de los resultados y la calidad de los servicios prestados por los laboratorios que realizan el diagnstico de micoplasmas contaminantes en lneas celulares y productos biofarmacuticos.

Bibliografa
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