Universidad Santo Toms

2012

Polimorfismos Factor V Leiden por PCR-RFLP

Luis Colihuinca Llancapan Resumen

El factor V Leiden es el nombre dado a una variante del factor V de la coagulacin que con frecuencia causa un trastorno de hipercoagulabilidad. La mutacin de este gen consiste en un polimorfismo de nucletido simple (SNP) situado en el exn 10 del brazo corto del cromosoma 1 humano. Se produce por sustitucin de G por A en el nucletido 1691 (G1691A), lo que genera un cambio de aminocido, una Arginina por una Glutamina.
Palabras claves: PCR-RFLP, factor V Leiden (FVL), Taq DNA polimerasa, enzima de restriccin Mnl1, polimorfismo.

Introduccin
La trombosis es una enfermedad multifactorial en la que participan tanto factores adquiridos como genticos, En relacin a estos ltimos, dos polimorfismos han sido implicados con mayor frecuencia, el factor V Leiden y la mutacin del gen de la protrombina (PT) G20210A. El factor V Leiden es un trastorno heredado de manera autosmica y dominante que presenta dominancia incompleta y resulta en una variante del factor V que no puede ser tan fcilmente degradada por la protena C activada. La mutacin de este gen consiste en un polimorfismo de nucletido simple (SNP) situado en el exn 10 del brazo corto del cromosoma 1 humano. El gen que codifica el factor V es de aproximadamente 80 kilobases de tamao, y se encuentra localizado en el brazo largo del cromosoma 1 (1q23) y consiste de 25 exones y 24 intrones. Su transcripcin da origen a un mRNA
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maduro de 6.8 kb el cual codifica una protena de 330 kDa que circula en la sangre en una concentracin de aproximadamente 21nM. El mtodo de Diagnstico que se utilizan principalmente en la deteccin PCR-RFLP. Este mtodo detecta polimorfismo de tamao de los fragmentos de restriccin. La mutacin de un nucletido provoca la prdida de un nuevo sitio de corte para una enzima de restriccin. Por tanto, si se digiere despus de realizar la PCR, se obtendrn distintos patrones de bandas dependiendo de si el individuo presenta la mutacin en homocigota, heterocigoto o si es totalmente sano. Para realizar esta tcnica, se utilizan oligonucletidos especficos del gen, y se obtienen bandas de tamaos. Una banda de 267 pb resulta de la amplificacin del PCR. Los productos
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de la enzima de restriccin consisten en 3 fragmentos de 163, 67 y 37 pb en individuos normales. En presencia del FV Leiden un corte se pierde y solo 2 fragmentos de 200 y 67 pb son observados. Se utilizara la enzima de restriccin Mnl1 para estudiar la mutacin puntual Factor V Leiden.

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Materiales y procedimientos
Muestra: Se utiliz muestras de ADN genmico (fig. 1) Micropipetas de 0,1-20 ul, de 20-200ul y 200-1000ul. Puntas de micropipetas estriles con filtros. Tubos eppendorf libres de DNA/RNAasas. -Cmara de electroforesis horizontal. -Peines para las bandejas. -Bandeja para la preparacin del gel. -Fuente de poder. -1 matraz de Erlenmeyer de 100ml estril. -Guantes de ltex sin talcos. -Guantes para calor. Reactivos. Primer F Primer R Taq polimerasa dNTPs MgCl Agarosa grado molecular TAE 1X Red gel Buffer de carga Buffer de reaccin enzimtica. -Agua Destilada libre de DNA/RNAsas. BSA y Mnl1.
Diagnstico Molecular Buffer de Rx Vol. Final Figura 1. Materiales para llevar a cabo una PCR.

Procedimiento 1- se realizo el clculo de los

volmenes que se necesitan a partir de las soluciones stock.

Reactivo H2O libre de DNA/RNAasa MgCl dNTPs Primer F Primer R ADN molde Taq polimerasa

Concentracin

Volumen 4,5ul

50mM 10uM 10Um

5ul 4ul 1ul 1ul 2ul

5 U/ul

5ul 2,5ul 25ul

2.-En un tubo eppendorf libre de DNA/RNAasas de 0.2 ml se agreg los componentes del mix de PCR, cuidando de no formar burbujas. Amplificacin La amplificacin se realiza a 39 ciclos. Denaturacin a 94C por 20 segundos, Anneling 62C por 15 segundos, extensin a 72C por 40 segundos y extensin final 72C por 10 minutos.
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transparente, de no ser as se debe volver a incubar unos segundos ms. (Paso peligroso, mxima precaucin) 4. Se deja enfriar la agarosa hasta aproximadamente 50 C y se agregaron 2 l de Red Gel concentrado 10.000X. 5. Se mezcl hasta que estuvo bien homogenizado. 6. Mientras se enfra la agarosa, se prepar el molde para verter la solucin. Se sellan con masking tape los extremos abiertos del molde y se coloca el peine. 7. Se aadi la agarosa suavemente y con mucho cuidado al molde y se espero a que solidificar. Preparacin de muestras de ADN para cargar al gel. En un trozo de parafilm se coloco 1 gotas de 5ul de buffer de carga. Se tomo con una punta nueva 10ul de la muestras de ADN amplificado y se deposito sobre la gota de buffer de carga. Se mezclo con la misma punta y se depositaron 10ul en el gel de agarosa. Se repiti lo mismo con las otras muestras. Tapar conectar la cmara a la fuente de poder.

Figura 2. Termociclador para PCR.

La digestin enzimtica Mnl1. 1. La reaccin de digestin se realiz en un volumen final de 25 l. 2. Colocar en un tubo de 0.65 l libre de DNA/RNAasas 15 l del producto de PCR. 3. Se agregaron 2.5 l de buffer de reaccin segn y 0.2 l de BSA. Nota: cuando se realiza un experimento para estudio de polimorfismo con enzimas de restriccin, siempre agregar BSA aunque el fabricante no lo recomiende. 4. Se agregar enzima Mnl1 en exceso al final. Mezclar con pipeta cuidando de no formar burbujas. 5. Se colocar en bao termorregulado a 37C por mnimo 7 horas. Preparacin gel de agarosa al 3% 1. Se realizo un gel de agarosa a una concentracin de 3%. Para la cmara de electroforesis pequea pesar 0.6 gr. de agarosa para 20 ml de buffer de corrida.. 2. Disolver la agarosa por agitacin suave y posterior incubacin a 100C en microondas por unos segundos. 3. Se sac el matraz del microondas con mucho cuidado y se agito suavemente. La agarosa debe estar totalmente disuelta y verse una solucin
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Figura 3. Cmara de electroforesis con las muestras corriendo.

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Se tap la cmara con cuidado y se conecto los cables (rojo con rojo y negro con negro). El electrodo negro debe ir al lado donde se cargan las muestras. Los cables se conectaron a la fuente de poder con sta APAGADA. Se ajusta la fuente de poder a 80 volts. Luego se encendi la fuente de poder Visualizacin del gel de agarosa 1. Se coloc el gel en el transiluminador y se observ las bandas que se ven por la excitacin de la sonda intercalante Red Gel. 2. Finalmente se fotografi el gel. Resultados Los resultados obtenidos al final del laboratorio, se pudo visualizar y fotografiar el gel y se pudo observar de la siguiente manera en la cmara del transilumonador.
PM 1 2 3 4 5 6 7

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Discusin Una banda de 267 pb es el resultado de la amplificacin de la PCR. Los productos que se obtienen con la enzima de restriccin (Mnl1) consisten en 3 fragmentos de 163, 67 y 37 pb en individuos para el alelo normal. En presencia del FV Leiden, es decir, que sean portadores de una adenina en la posicin 1691 del gen. Un sitio de restriccin y/o corte se pierde y solo 2 fragmentos de 200 y 67 pb se pueden observar. En el caso de individuos heterocigoto habrn dos alelo uno portador del polimorfismo y el otro no, por lo tanto se observa una mezcla de bandas en el gel de electroforesis. Analizando las muestras cargadas al gel despus de la corrida electrofortica, se observan 2 bandas bien marcadas en la parte superior del gel que corresponderan a individuos heterocigotos, las de 200 y 163 pb, porque esa tiene la de los dos alelos. Para el caso de homocigotos normales se observa una sola banda de 163pb. Las bandas de menor tamao la de 67pb y la de 37pb, no se observan claramente en el gel de electroforesis. Esto pudo haber ocurrido porque le falto tiempo de incubacin durante el proceso de digestin y tiempo de corrida de la electroforesis. Se puede obtener un mejor resultados en PCR-RFLP considerando todos los posibles interferentes que ya se mencionaron, tratando de evitarlos y as obtener una PCR de rendimiento optima la prxima ves que se trabaje con este tipo de metodologas.
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8 PM 9

10 11

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Figura 4. Electroforesis de agarosa. PM (marcador de peso molecular) y muestras.

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Referencia bibliogrfica.
Ivn Palomo G. y colaboradores.

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Factor V Leiden y mutacin de la protrombina G20210A en pacientes con trombosis venosa y arterial. Revista Mdica. Chile v.133 n.12 Santiago dic. 2005 Juan Martn Arriaga. Paula Roberti. Maestra Biologa Molecular Mdica Medicina Molecular ao 2011.
http://www.jmordoh.com.ar/clases/maest ria2011.pdf.

Dra. Daniela Lens y colaboradores. Diagnstico molecular de factores protrombticos: primeros casos de factor V Leiden y protrombina 20210A en Uruguay. Revista Mdica Uruguay 2000.http://www.rmu.org.uy/revista/200 0v1/art7.pdf

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