TCNICAS MICROBIOLGICAS DE RESIDUOS INHIBIDORES

Xornada tcnica do leite 12 de Noviembre de 2007

M Teresa Fernndez Fernndez Laboratorio de Salud Pblica de Lugo

Cul es la justificacin del control de residuos en leche?

Residuos y Salud pblica EFECTOS TOXICOLGICOS
v Resistencias microbianas v Alergias v Toxicidad v Efectos sobre la flora intestinal

Residuos y Industria Lctea EFECTOS TECNOLGICO ECONMICOS

qInhibicin bacteriana: Efectos sobre las caractersticas organolpticas del producto qEnmascaramiento de los controles microbiolgicos: fallan los controles qTermorresistencia:superan las barreras trmicas (pasteurizacin,UHT,etc.)

Residuos y Productor EFECTOS ECONMICOS

Sanciones Pago por calidad Descarte de leche Contaminacin cisterna-silo

Xornada tcnica do leite

Cules son los posibles residuos y contaminantes en la leche?

vResiduos de medicamentos veterinarios vSustancias anabolizantes vDetergentes y desinfectantes. vPesticidas vMicotoxinas vPCBs, Dioxinas, metales pesados,etc.
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DEFINICIONES
Residuo
(Codex Alimentarius)
Define los residuos de medicamentos veterinarios como los productos originales y sus metabolitos en cualquier porcin comestible del producto animal

(P.N.I.R.)
Residuo de:
Sustancias de accin farmacolgica Sus productos de transformacin Otras sustancias

que se transmitan a los productos animales y que puedan resultar nocivos para la salud humana

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DEFINICIONES
Promotor de crecimiento
Sustancia que en s misma proporciona el crecimiento del animal (Clembuterol,Hormonas)

Precursor de crecimiento
Sustancia que favorece las condiciones del entorno del animal para favorecer su crecimiento (antibiticos , vitaminas,tranquilizantes,etc.)
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DEFINICIONES
LMR = Limite Mximo de Residuo
(g/kg = ppb)

Es el contenido de un determinado producto veterinario que se considera admisible en un producto alimenticio; este lmite se basar en el tipo y en la cantidad de residuos que se consideren no constituyen ningn riesgo toxicolgico para la salud humana

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DEFINICIONES
Antibitico: (1942) compuestos qumicos de origen microbiano ,con actividad antimicrobiana. Quimioterpico: compuestos de sntesis (distincin con los de origen natural) Antibacteriano: Para distinguir los antimicrobianos activos frente a bacterias de los activos frente a hongos (Antifngicos). Inhibidor: Se denominan as a los residuos de antibiticos detectados mediante tcnicas microbiolgicas

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Normativa sobre residuos de medicamentos veterinarios (Reglamento UE 2377/90)

Anexo I: Lista de sustancias farmacolgicas activas,

cuyos LMR se han fijado definitivamente (medicamentos con limitacin de uso)

Anexo II: Lista de sustancias que no estn sujetas a

LMR (medicamentos de libre uso)

Anexo III: Lista de sustancias para las que se han

fijado LMR provisionales (medicamentos con limitacin de uso provisional)

Anexo IV: Lista de sustancias para las que no se

pueden establecer LMR (medicamentos prohibidos)
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Grupos antibiticos
Tetraciclinas
Clortetraciclina Oxitetraciclina Tetraciclina Doxiciclina Rolitetraciclina

Macrlidos y Lincosaminas
Epiramicina Kitasamicina Lincomicinsa Tilosina etc.

Penicilinas
Amoxicilina Ampicilina Bencilpenicilina : Cloxacilina
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Oxacilina,etc.

Grupos antibiticos
Cefalosporinas
Cefalotina Cefaloxina Cefoperazona Cefuroxima Cefazolina etc.

Aminoglucsidos
Espectinomicina Estreptomicina Kanamicina Gentamicina etc.

Anfenicoles
Cloranfenicol Tianfenicol Fluorfenicol.

Quinolonas
Cirofloxacino Enrofloxaino Ac Nalidxico

Nitrofuranos
Furaltadona : Furazolidona
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Grupos antibiticos
Ionforos
Monensina Salinomicina Lasalocid

Otros Peptdicos
Bacitracina Colistina Polimixina B Avoparcina Virgiamicina Gramicidina Novoviocina A.Fusidico Trimetroprima Dimetridazol Griseofulvina Nistatina Carbadox Ronidazol Metronidazol

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Dapsona etc.

Propiedades de los mtodos de deteccin

Falsos Positivos Selectividad Falsos Negativos Lmites de deteccin Sensibilidad para los LMRs Reproducibilidad, Precisin, Exactitud

OBJETIVO DEL MTODO DE CONTROL

ELEGIREMOS EL MTODO DE DETECCIN

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Cul sera el mtodo ideal?

Detecta todos los residuos posibles Con sensibilidad alrededor de los LMRs Pocos resultados falsos negativos (proteccin del consumidor) Pocos resultados falsos positivos (proteccin del productor y del comercio nacional e internacional) Econmico y de fcil uso
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ESTRATEGA ANALTICA

Tcnicas de Cribado o de Screening

Tcnicas de Post-Cribado

Tcnicas de Confirmacin

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Propiedades de los mtodos de deteccin: Fundamento

Tcnicas de Cribado o de Screening

Microbiolgicas

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Propiedades de los mtodos de deteccin: Fundamento

Tcnicas de Post-Cribado

Inhibicin microbiana: PostCribado HPTLC(Cromatografa de capa fina) Inmuno-enzimticos: *Inmunolgicos (ELISA, RIA,etc.). *Enzymticos (Pezym) De Unin a Receptores: *Receptores microbiolgicos (Charm). *Receptores proteicos (Beta-star, Snap)

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Propiedades de los mtodos de deteccin: Fundamento Cromatografa

HPLC/UV HPLC/DAD HPLC/FLUO HPLC/MS-MS GS GS/MS etc.

Tcnicas de Confirmacin

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TCNICAS MICROBIOLGICAS DE Screening o Cribado

Todas se basan en el cultivo de un microorganismo en agar que tiene resistencia o sensibilidad frente a un antibitico o grupos antibiticos determinados que se ecuentran como residuos en los tejidos de origen animal o en sus productos . Para conseguir un amplio espectro de identificacin , se juega con la siembra en agares de distinta composicin y pH.

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TCNICAS MICROBIOLGICAS de Screening o Cribado

qTcnica de Cribado de residuos antibacterianos con 5 placas qTcnica Stop (Swab test on premises) qTcnica STAR (screening test for antibiotic residues) qTcnica de cribado de residuos antibacterianos en leche por inhibicinde B. stearotermphilus: * En placa. * Delvotest. * Eclipse 50

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Tcnica de Cribado de residuos antibacterianos con 5 placas

Ph 6
30ml de agar + B. subtilis

DST(pH7,4)
30ml de agar+ solucin de Trimetoprima + B. subtilis

Ph 8
30ml de agar + B. subtilis

Ph 8
30ml de agar + Kocuria rhizophila

DST PH 8
30ml de agar + E. coli

30C

30C

30C

37C

30C

Disco control Bencilpenicilina 0,01 UI /disco

Disco control Sulfadimidina 0,5 g/disco

Disco control Estreptomicina 0,5 g/disco

Disco control Estreptomicina 0,5 g/disco

Disco control Ciprofloxacino 0,003 g/disco

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Xornada tcnica do leite

Xornada tcnica do leite

Leche cruda

En bao a 80C

durante 10 mit

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Medida con calibre de los halo de inhibicin

Positivas las muestras con halos mayores iguales 2mm

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Tcnica Stop (Swab test on premises)

Johnston et al. 1981 Utilizada por su sencillez en mataderos sin necesidad de remitir muestras al laboratorio en EEUU y pases de influencia
Agar n 5 + B. subtilis Disco control de Neomicina

Xornada tcnica do leite

Tcnica STAR (screening test

for antibiotic residues)

Fu una de las propuestas del laboratorio Comunitario de Referencia en atencin a las necesidades de los planes de residuos

MEDIO Medio pH 6 Medio DST pH 7,4 + Trimetoprima Medio pH 7,2 Medio pH 8 Medio pH 8

MICROORGANISMO B. cereus

DISCO CONTROL Clortetraciclina

30C 55C 30C 37C 37C

B. stearotermphilus B. subtilis E. coli M. Luteus

Sulfadimidina Estreptomicina Ciprofloxacino Tilosina

Tcnica de Post-cribado
de residuos de antibiticos por bioensayo mltiple
Es una tcnica con la que se pretende identificar el grupo de antibiticos al que podra pertenecer el residuo Se utiliza desde hace tiempo en EEUU y su puesta a punto para el PNIR fu a cargo del Centro Nacional de Referencia de Majadahonda (V. Caldern)

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PREPARACIN DE PLACAS
PLACA MEDIO MICROORGANISMO
B. cereus CECT 193 B. cereus CECT 5314 Kocuria rhizophila CECT 4070 Kocuria rhizophila CECT 4070 B. subtilis CECT 356 B. subtilis CECT 356 Kocuria rhizophila CECT 4070 Kocuria rhizophila CECT4093 S. epidermidis CECT 231 S. epidermidis CECT 231 E. coli CECT 4201 E. coli CECT 4201

PENICILASA HEPARINA 200 UI/ml 200 UI/ml

A a B C D d E F G ? Q K

N 8 N 8 N 2 N 2 N 5 N 5 N 11 N11 N 11 N 11 N 7,4 N 7,4

NO NO NO NO NO 40 mg/ ml NO NO NO 40 mg/ ml NO 40 mg/ ml

NO
200 UI/ml 200 UI/ml 200 UI/ml 200 UI/ml 200 UI/ml 200 UI/ml 200 UI/ml 200 UI/ml 200 UI/ml

Leche cruda

A 80 C durante 10 mit para inactivar los posibles inhibidores naturales

cilindros de 8 mm de externo y 10 mm de altura

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Tcnica de Post-cribado de residuos de antibiticos por bioensayo mltiple Lectura de resultados

Placas A y a: Deteccin de Tetraciclinas Placa B y C: Deteccin de -lactmicos Placa D: Deteccin de aminoglucsidos (estreptomicina) Placas E y F : Deteccin de macrlidos (eritromicina) Placa G: Deteccin de aminoglucsidos (Neomicina y Gentamicina) Placa Q: Deteccin de Quinolonas
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Tcnica de Post-cribado de residuos de antibiticos por bioensayo mltiple Informe de resultados

Si no se puede interpretar el resultado Inhibidor no identificable

Si no se detecta el halo

Negativo

Se detecta una inhibicin con el grupo....

Actividad antibacteriana concordante

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Tcnica de cribado de residuos antibacterianos en leche po inhibicinde B. stearotermphilus en placa ( mtodo de Kundrat)
Agar N 2 adicionado con 1 g de D(+) Glucosa+ Prpura de Bromocresol + suspensin de esporas B. stearothermophilus + solucin de Trimetoprima

En ausencia de sustancias inhibidoras el germen se desarrolla en el curso de la incubacin, fermentando la glucosa presente en el medio, formando cido, el cual har virar a amarillo el Prpura de bromocresol (violeta) de todo el agar de la placa o del tubo.

disco control de 0,01 UI de penicilina G T de incubacin 64C durante 3h - 4h

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Delvotest y test Eclipse 50

Aadir una tableta nutritiva (solo en el Delvotest)

Aadir 100 l de muestra en Delvotest y 50 l en el Eclipse 50

Tapar los viales e incubar a 64C 2C

Leer los resultados aproximadamente 3h

Eclipse 50

Delvotest

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Fundamento de la tcnica del Delvotest y Test Eclipse 50 Son tests que vienen preparados para su utilizacin en tubo. Se basa igualmente que el anterior en la inhibicin o no del desarrollo de Bacillus stearothermophilus(var. calidolactis) a 64C, en un agar compuesto de nutrientes seleccionados y con un indicador de color que har virar el medio a amarillo en caso de ausencia de sustancias inhibidoras debido a la formacin de cido por parte del germen que se ha desarrollado en el medio, y permanecer con el color violeta original del medio, en el caso de la presencia de sustancias inhibidoras, que no permitirn el desarrollo del germen. Negativo cuando en todo el agar del tubo hay un cambio de color manifiesto de violeta a amarillo. Positivo cuando veamos con claridad que se mantienen el color violeta original del medio
Xornada tcnica do leite

Xornada tcnica do leite

Un buen diagnstico:
Nos lleva a la eleccin del mejor tratamiento La adecuada duracin del tratamiento Eleccin del mejor producto

La mejor dosificacin

Y en consecuencia

La favorable evolucin del proceso patolgico a curar