Seleo de macrofungos produtores das enzimas lignina peroxidase, mangans peroxidase, lacase, lipase, protease e epxidohidrolase

Marcelo Mller dos Santos1, Maria Angela Lopes de Almeida Amazonas2, Nadia Krieger3, David Alexander Mitchell 4

Universidade Federal do Paran, Florestas

1,3,4

Embrapa

1. Introduo
Como macrofungos, so consideradas todas as espcies de fungos que produzem corpos de frutificao visveis a olho nu. A maior parte pertence classe dos basidiomicetos e o restante aos ascomicetos. Os basidiomicetos so os nicos organismos capazes de decompor eficientemente a lignina, da o seu papel chave no processo de reciclagem de nutrientes nos ecossistemas florestais. Esta propriedade decorre da presena de enzimas lignolticas entre o arsenal enzimtico do metabolismo desses organismos. Alm das enzimas lignolticas, de interesse para a indstria de papel e celulose e processos de biorremediao, muitas outras encontram aplicao em processos biotecnolgicos.

 Aplicao das enzimas estudadas: Lignina peroxidase, lacase e mangans peroxidase: processos de biorremediao (recuperao de solos contaminados e tratamento de efluentes, principalmente de origem txtil); instria de papel e celulose. Lipase: degradao de gorduras (indstria de detergentes); produo de compostos de alto valor agregado, como biodiesel, aromas, steres de sacarose, frmacos (p.ex.: ibuprofeno). Protease: degradao de substratos proticos (indstria de detergentes), panificao, cervejaria, sntese de peptdeos. Epxido-hidrolase: sntese orgnica. processos de detoxificao,

2. Objetivos
Investigao da ocorrncia de enzimas de interesse biotecnolgico em isolados de macrofungos depositados na coleo de culturas da Embrapa Florestas, Colombo, Paran.

3. Estratgia Tcnicas simples e rpidas de deteco qualitativa

de atividade enzimtica esto sendo empregadas, de modo a permitir a triagem de um maior nmero de isolados em um curto espao de tempo.

4. Material e Mtodos
4.1. Teste para seleo de linhagens

produtoras de lipase: O mtodo baseia-se na complexao de cidos graxos com o corante rodamina pela ao de lipases sobre o substrato (leo de oliva).

 Os pontos de hidrlise so visualizados quando as placas so irradiadas a 360 nm.

Tempo de cultivo: 7 dias

Inculo

Irradiao a 360 nm
Reao positiva

Placa com corante rodamina e substrato (leo de oliva)

4.2.

Teste

para

seleo

de

linhagens

produtoras de protease: O mtodo baseia-se na hidrlise da gelatina usada como substrato juntamente com o gar nutriente. A gelatina no hidrolisada precipita em soluo saturada de (NH4)2SO4 ; assim possvel visualizar se h atividade proteoltica.

Tempo de cultivo: 7 dias

Placa de gar nutriente com gelatina Halo de hidrlise

5. Resultados
Linhagens de macrofungos avaliadas quanto produo de lipase.
Agaricus blazei ABL 97/11, 99/25, 99/26, 99/28, 99/29, 99/30 (Botucatu, SP) e CNPF 72 (Colombo, PR). Lentinus crinitus (Colombo, PR), L. G. do complexo lucidum (Curitiba, PR), G. orbiformum (Paranagu, PR), G. australe (Colombo, PR). Pleurotus eringii (Fuzhou, China), P. djamor (Polo Base, RR), Pleurotus floridanus (Paranagu, PR) Polyporus arcularius (Polo Base, RR) Pereniporia Pinhais, PR) martiusii (S.J. dos

strigellus (Colombo, PR), L. strigosus (Polo Base, RR), L. velutinus (Balsa Nova, PR). Lentinula boryana (Quatro Barras, PR), L. edodes LE1 (Londrina, Japo), L. edodes 697 (Tottori, Japo). Ganoderma do complexo lucidum

Oudemansiella canarii (Curitiba, PR) Hennigsia brasiliensis (Curitiba, PR) Trametes versicolor Cotegipe, RS) (Baro de

(Chapada dos Veadeiros, GO),

Stropharia rugosoannulata (Colombo, PR) Hypholoma subviride (Colombo, PR)

 Linhagens de macrofungos avaliadas quanto produo de protease.

Agaricus blazei ABL 97/11, 99/25, G. do complexo lucidum (Curitiba, G. australe (Colombo, PR). PR), L. 99/26, 99/28, 99/29, 99/30 (Botucatu, PR), G. orbiformum (Paranagu, PR), SP) e CNPF 72 (Colombo, PR). Lentinus crinitus (Colombo, Pleurotus eringii (Fuzhou, China), P. djamor (Polo Base, RR), Pleurotus strigellus (Colombo, PR), L. strigosus floridanus (Paranagu, PR) (Polo Base, RR), L. velutinus (Balsa Polyporus arcularius (Polo Base, RR) Nova, PR). Lentinula boryana (Quatro Barras, PR), L. edodes LE1 (Londrina, Japo), L. edodes 697 (Tottori, Japo). Ganoderma do complexo lucidum Pereniporia Pinhais, PR) martiusii (S.J. dos

Oudemansiella canarii (Curitiba, PR) Hennigsia brasiliensis (Curitiba, PR) Trametes versicolor Cotegipe, RS) (Baro de

(Chapada dos Veadeiros, GO),

Stropharia rugosoannulata (Colombo, PR) Hypholoma subviride (Colombo, PR)

 Os macrofungos que produziram uma ou ambas as enzimas avaliadas esto sendo cultivados em substrato slido em frascos de Erlenmeyer para a produo de corpos frutferos.

A linhagem de Agaricus blazei CNPF 72 est sendo cultivada em fermentao submersa para quantificao e caracterizao da protease produzida.

 Padronizao do Inculo para Agaricus blazei tcnica de homogeneizao do miclio:

Curva de crescimento de Agaricus blazei - CNPF 72 em meio extrato malte
60 50 40 30 20 10 0 0 5 tempo (dias) 10 15

miclio em peso seco (mg)

6. Etapas Futuras
Testar outras 30 linhagens da coleo quanto produo de lipase e protease. Selecionar linhagens produtoras de lacase, lignina peroxidase, mangans peroxidase. Selecionar hidrolases. linhagens produtoras de epxido-