Rolando Macas Moreno A00988401 Daniel Muoz Mayorga A00988085 Rolando Pia Flores A00987927 Betzaira del C.

Aceves Muoz A01062852

COMPARACIN DE TCNICAS DE MICROPROPA-GACIN EN Coffea arabica

Introduccin
Estimulante

del sistema nervioso, debido a la alta concentracin de la cafena. Fuente de antioxidantes fenlicos. Industrialmente muy rentable. - Pulpa - Cscara - Residuos industriales

Introduccin
Uno

de los principales cultivos econmicos de Centroamrica. De gran importancia econmica para Mxico gracias condiciones climticas. Elevar rendimientos, seleccionar variedades apropiadas, mejores sistemas de cultivo, mantener adecuado control de insectos y proteccin contra las enfermedades (UDLAP,2012).

Introduccin
Principal

fuente de ingreso para casi cuatro millones de mexicanos. Cultivado en 4,500 comunidades. 5% del Producto Interno Bruto (PIB) y el 14% de las exportaciones agrcolas. (Saharrea., 2007)

Introduccin
Importancia

de tener un proceso estandarizado para el cultivo de caf. - libre de patgenos - sano - optimizacin de recursos - mejor calidad - reduccin del tiempo de cultivo

Introduccin
Necesidad

de implementacin de las tcnicas de cultivo de tejidos vegetales. - Estimulacin de yemas axilares o adventicias. - Embriognesis (directa o indirecta)

Reguladores de crecimiento
Fitohormonas:

pueden inhibir o promover algunos procesos en los vegetales. 4 Grupos: Auxinas Giberelinas Citocininas Etileno.

Auxinas

Estimulan la elongacin de las clulas. (Universidad Politcnica de Valencia, 2003) - ANA (cido naftalenactico) - IBA (cdo indolbutrico) - 2,4-D (cido 2,4 diclorofenoxiactico) - NOA (cido naftoxiactico) - 2,4-DB (cido 2,4 diclorofenoxibutilico) - 2,4,5,-T (cido 2,4,5 triclorofenoxiactico)

Citoquininas
Gobiernan

divisin celular y diferenciacin en tejidos vegetales. Control del desarrollo y la senescencia. Se adicionan a los medios de cultivo para estimular la divisin celular, inducir la formacin de vstagos e inhibir la formacin de races. (Universidad Politcnica de Valencia, 2003)

Efecto de las hormonas

El tipo de morfognesis que ocurra en un tejido vegetal depende de la concentracin y la relacin auxinas/citoquininas en el medio de cultivo. Las relaciones son las siguientes: - Citoquinina/Auxina elevada, da lugar a la formacin de tallos. Citoquinina/Auxina baja, da lugar a la formacin de races. (Buchanan, 2000)

Vitaminas
Necesarias

por las clulas vegetales como productos intermedios esenciales o catalizadores metablicos. Clulas y tejidos de plantas son deficientes productores en algunos factores; por esta razn es necesaria la adicin de vitaminas al medio de cultivo. (Sarkar, 2009)

Vitaminas

Las vitaminas que sern utilizadas para el cultivo in vitro de coffea arabica son: Mioynositol, estimula el crecimiento de cultivos de clulas determinadas. (P.T., 2003) La tiamina es una serie de elementos clave del metabolismo de carbohidratos y la biosntesis de algunos aminocidos. (SigmaAldrich, 2012)

Aminocidos
Cistena:

desempea un papel indirecto muy importante de la proteccin de las clulas del estrs oxidativo. (SigmaAldrich, 2012)

Antecedentes
La

utilizacin del caf data del ao 800 d.C. El primer registro histrico del caf se sita en la regin etope de Kaffa, en torno al siglo X. Los primeros documentos atribuan a la planta del cafeto propiedades curativas. (Club Salvador, Maestros del Caf, 2011)

Antecedentes
En

el siglo XVI se cnvierte en la bebida social por excelencia del mundo rabe y posteriormente en Amrica y Asia. (Club Salvador, Maestros del Caf, 2011) El caf lleg a Mxico en 1795, su cultivo se concentr en el estado de Veracruz, para luego expandirse a Chiapas y Oaxaca durante el siglo XIX. (ReyesLoperena, 2008)

Antecedentes

Primer informe registrado sobre tejido de cultivos de coffea arabica realizado por Staritsky (1970). Us segmentos de entrenudos de los tallos jvenes como explantes. Obtencin de rpido crecimiento de callo utilizando una versin modificada Linsmaier y Skoog (1965) suplementado con sacarosa (30 gL1), tiamina HCl (1 mg.L-1), L-cistena HCl (10 mg.L1), mioinositol (100 mg.L-1), kinetina (0,1 mg.L-1), cido 2,4-diclorofenoxiactico (2,4-D, 0,1 mg.L-1) o naftaleno actico (NAA, 1 mg. L-1). (Staritsky, 1970)

Antecedentes

Sharp et al. (1973) establecieron callo a partir de semillas, tallos, hojas y las anteras de Coffea arabica Encontraron condiciones como ausencia de iluminacin y una temperatura de 28 C en la que las clulas proliferan callos de manera ms eficiente. (Sharp, et al., 1973) Mnaco y colaboradores (1974) obtuvieron una rpida proliferacin celular en la superficie de los explantes de las frutas en desarrollo con semillas inmaduras de Coffea arbica y Coffea stenophylla que fueron cultivadas en la oscuridad a 25-28 C y en un medio utilizado por Staritsky (1970), pero en ausencia de 2,4-D. (De los Santos, 2006).

Antecedentes
Herman

y Haas (1975) obtuvieron la propagacin clonal de C. arabica mediante la formacin de callos. Sndahl y Sharp (1977, 1979) establecieron las condiciones para la formacin de embriones somticos a partir de callos de hoja inducida por auxinas. (De los Santos, 2006).

Antecedentes
Base

para el desarrollo y la optimizacin de las tcnicas de cultivo de tejidos vegetales en las especies de caf. (De los Santos, 2006) Otros trabajos: Dublin 1981, Pierson 1983, Yasuda 1985, Garca and Menndez 1987, Hatanaka et al.1991, Neuenschwander and Bauman 1991, Bieysse et al, 1993, Menndez and Nieto 1994, Menndez and Garca 1997.

Antecedentes
No

se ha logrado estandarizar un protocolo general para el cultivo de las especies de caf

Justificacin

El cultivo in vitro tiene un rol muy importante en la mejora agrcola mundial. Multiplicacin de caf por semillas, da como resultado una redistribucin de los genes en la progenie que conduce a la heterogeneidad considerable y una prdida de las caractersticas de la planta seleccionada. Hasta hace poco, la multiplicacin idntica a gran escala, de una seleccin de los rboles de caf con una estructura gentica hbrida era imposible. (Vsquez, 1997)

Justificacin

Con el cultivo in vitro, un conjunto de variedades se pueden presentar en menos de 10 aos. Velocidad es esencial cuando la aparicin de nuevas enfermedades tiene que ser contrarrestada. (CIRAD, 2008) A partir de fragmentos de hojas simples tomadas de los rboles seleccionados, la embriognesis somtica genera enormes cantidades de los llamados embriones somticos.(CATIE, s.f.)

Justificacin

Obtencin de hbridos de caf con caractersticas deseables en cuanto a calidad de bebida, productividad, tolerancia a enfermedades ha impulsado al desarrollo de tcnicas de clonacin, Si no se contarn con este tipo de herramientas biotecnolgicas, el tiempo de desarrollo de nuevos hbridos bajo el mtodo de multiplicacin por semilla podra ser de 30 a 35 aos.

Objetivo general
Determinar

mediante embriognesis indirecta, induccin de brotes y germinacin in vitro las condiciones ms efectivas para propagar Coffea arabica, estableciendo la concentracin ideal de hormonas que debe contener el medio para el desarrollo ptimo de la planta de caf.

Objetivos especficos

Obtencin de una planta de Coffea arabica para extraer diversos explantes. Establecimiento del protocolo para obtener plantas de Coffea arbica mediante los mtodos de embriognesis indirecta, indiccin de brotes y germinacin in vitro. Preparacin de medios de cultivo necesarios para cada tcnica utilizando las concentraciones y barridos hormonales necesarios. Siembra de explantes en cada tcnica.

Mtodos
Desinfeccin

y definicin de medio de cultivo para aplicar: germinacin in vitro, generacin de brotes y generacin de callo. Medio MS Basal

Tabla 1 . Composicin de sales del medio de cultivo MS basal.

Medio MS Basal
Al

medio MS fue suplementado con: - 10 ml de Hierro-EDTA. - 10 ml de vitaminas esenciales. - 10 ml de inositol. - 40 gr de sacarosa.

Germinacin in vitro

Medio de cultivo a 50% sin hormonas (De Garca y Rafael, 1989). Sumergir en H2SO4 durante 25 segundos y enjuagar con agua destilada. Colocar en un papel filtro y lavar en agua destilada con agitacin por 30 minutos. Desinfectar usando 50 ml de agua destilada con 3 gotas de Mycrodin por 25 minutos en agitacin. Transferir a 50 ml de etanol al 70% por 2 minutos en agitacin continua. Transferir a NaOCl al 20% con 3 gotas de Tween 80 durante 15 minutos en constante agitacin. Colocar en un frasco con medio de cultivo e incubar.

Generacin de brotes
Barrido

hormonal de BA y ANA. Identificacin de concentracin ideal de ambas hormonas para el ptimo desarrollo de brotes.
ANA \ BA 0 0.1 0.2 0.3 0 0/0 0.1/0 0.2/0 0.3/0 1 0/1 0.1/1 0.2/1 0.3/1 3 0/3 0.1/3 0.2/3 0.3/3 5 0/5 0.1/5 0.2/5 0.3/5

Tabla1.Barridohormonaldeauxinasycitoquininasexpresadoenmg/l.

Generacin de brotes
Explante

a partir de corte de hoja sana, de aproximadamente 7mm2 o 1cm2 y que no incluy nervadura central, para evitar la propagacin de bacterias. No se us etanol ya que es txico para las plantas de Coffea arabica (Sndhal, 1985).

Generacin de brotes
Preparacin

de una solucin hipoclorito de sodio al 20% (v/v). Aadir 3 gotas de detergente Tween 80 por cada 200 ml de agua destilada. Mantener los explantes en agitacin suave durante 20 minutos. Colocar en cajas Petri con medio de cultivo e incubar.

Generacin de callo
Diferentes

tipos de medio de acuerdo con la etapa en la que se encuentre el proceso. Para obtencin de callo es necesario aadir al medio de cultivo hormona KIN a una concentracin de 20 M y 2,4Diclorofenoxiactico a una concentracin de 0.05 M (Sndhal, 1985).

Generacin de callo
Los

callos deben ser transferidos a un medio similar al de induccin de callo, pero con ANA y KNO3 en las combinaciones mostradas en la Tabla 3 (Moncada, Vielma & Mora).

Tabla 3 . Combinacin de tratamientos para diferenciacin en embriones.

Generacin de callo
Los

embriones somticos diferenciados deben ser transferidos a un medio de cultivo con las mismas caractersticas que el de induccin de callo, pero con sacarosa 20 g / l y sin reguladores de crecimiento, con 16 horas de fotoperiodo (Moncada, Vielma & Mora).

Resultados
Monitoreo

de cajas Petri. Las cajas se pesaron al inicio y al final del periodo de incubacin. Contaminacin por hongos y bacterias en algunas cajas.

Generacin de brotes
.05/ 0 0/1 0/1 0.5/0 1/0 1/0 0/0 0/0 0.5/1 ANA/BA ANA/BA ANA/BA ANA/BA ANA/BA ANA/BA ANA/BA ANA/BA ANA/BA 42.77 gr 37.38 gr 41.54 gr 38.13 gr 38.60 gr 39.77 gr 36.92 gr 37.05 gr 43.24 gr 43.45 gr 37.09 gr 41.28 gr 37.89 gr 38.30 gr 39.49 gr 36.65 gr 36.79 gr 42.95 gr

Tabla1.Pesosobtenidosalinicioyalfinaldelexperimento.

Generacin de brotes
ANA/BA 0 0.1 0.5 0 0.27 0.26 0.30 0.28 0.68 0.24 5 0.29 Contaminada 0.26 Contaminada Contaminada Contaminada Contaminada Contaminada 0.29 Nogelific Contaminada Nogelific 1

Tabla5.DiferenciadepesosinicialesyfinalesdelosexplantessometidosabarridohormonaldeANAy BAenconcentracionesdemg/L

Generacin de callo
No.de caja 1 2 3 4 Dif.depeso. Contaminada Contaminada Contaminada Contaminada

Tabla6.Diferenciasdepesosinicialesyfinalesdelosexplantessometidosamedioparainduccinde callo.

Interpretacin de resultados

Cotizacin

Conclusiones

Referencias

Barrios, L. (2000). Las principales enfermedades del caf. Recuperado el 17 de abril del 2012 de: http://www.critica.com.pa/archivo/01052000/reporta.html Brazilian Journal of plant physiology (2006). Biotecnologia do caf. Recuperado el 17 de abril del 2012 de: http://www.scielo.br/scielo.php?pid=S167704202006000100015&script=sci_arttext Composicin y preparacin del medio Murashige y Skoog. Recuperado el 17 de abril del 2012 de: http://farmacia.udea.edu.co/~biotecnolab/ms.pdf De Garca, E., Rafael, M. (1989). Propagacin clonal de plantas de caf ( coffea arabica L. Catimor) a partir de microesquejes cultivados in vitro. Recuperado el 17 de abril del 2012 de: http://sian.inia.gob.ve/repositorio/revistas_ci/Agronomia%2 0Tropical/at3946/Arti/de%20garcia_e.htm

Referencias

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Referencias

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Referencias

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