Cromatografa de lquidos.

-Es

una tcnica de separacin ;Es una de las tcnicas analticas ampliamente utilizadas, la cual permite separar fsicamente los distintos componentes de una solucin por la absorcin selectiva de los constituyentes de una mezcla.

-En varios tipos bsicos de cromatografa la fase mvil es un lquido. A menudo, estos tipos se clasifican de acuerdo con el mecanismo de separacin o el tipo de fase estacionaria. Entre estos tipos estn:

Entre estos tipos estn:

1) Cromatografa de reparto.
2)Cromatografa de adsorcin. 3)cromatografa de intercambio de iones o

cromatografa inica. 4)Cromatografa de exclusin por tamao. 5)Cromatografa por afinidad. 6)Cromatografa quiral.

Campo de aplicacin de la cromatografa de lquidos de alta resolucin.

Su fcil adaptacin a las determinaciones cuantitativas

exactas. Son importantes en la industria, muchos campos de la ciencia y para la sociedad en general. Materiales mas utilizados son aminocidos, protenas, cidos nucleicos, hidrocarburos, carbohidratos, frmacos, terpenoides etc. Capacidad para separar especies no voltiles o termolbiles.

Seleccin de tipos de cromatografa de lquidos.

Los mtodos se escogen con base en la solubilidad y la masa molecular. En la mayora de los casos de molculas pequeas no inicas, son apropiados los mtodos de fase inversa. Las tcnicas que estn en la parte inferior del diagrama son mejores para las especies de alta masa molecular. Se pone de manifiesto que los distintos procedimientos que utilizan la cromatografa de lquidos tienden a ser complementarios en lo que se refiere a sus campos de aplicacin.

Eficiencia de la columna en la cromatografa de lquidos.

-Eficiencia de la columna en la cromatografa de

lquidos. Se aplica en general a la cromatografa de lquidos. En esta seccin se ilustra el importante efecto del tamao de las partculas del relleno que forman la fase estacionaria y se describen otras dos causas de la dispersin de zona, que a veces son importancia notable en la cromatografa de lquidos.

Efectos del tamao de las partculas del relleno.

 En la figura anterior se muestra el efecto del tamao de

las partculas del relleno y de la tasa de flujo sobre la altura de plato H en cromatografa de lquidos. Dimensiones de la columna: 30 cm x 2.4mm. Soluto N,N-dietil-p-aminoazobenceno. Fase mvil: mezcla de hexano, cloruro de metileno y alcohol isoproplico.

Ensanchamiento de banda extra columna en cromatografa de lquidos.

La cromatografa de lquidos a veces tiene lugar un

ensanchamiento de banda significativo fuera del relleno de columna. Este ensanchamiento de banda extra columna se presenta cuando el soluto se transporta a travs de tubos abiertos , en la regin de los detectores y en los tubos que conectan los distintos componentes del sistema. El ensanchamiento proviene de diferencias en las tasas de flujo de las capas de lquido adyacentes a las paredes del tubo.

Se ha demostrado que la contribucin de los efectos extra columna a la altura total de plato H est dada por :

U: Es la velocidad del flujo lineal en (cm/s). r : Es el radio del tubo en cm. DM: Es el coeficiente de difusin del soluto en la

fase mvil en ( cm2/s).

Instrumentos para cromatografa de lquidos.

Se requieren presiones de bombeo de varios cientos de

atmosferas. El equipo necesario para la cromatografa de lquidos de alta resolucin tiende a ser ms complejo y caro que el que se utiliza en otros tipos de cromatografa.

 Se muestra un esquema de los componentes fundamentales

de un cromatografo de lquidos caracterstico.

Cromatografa lquida de alta eficiencia

Caractersticas y ventajas Trabaja con partculas muy pequeas (< 10 mm) Presiones de 1000 - 6000 psi (pounds square inch

= libras por pulgada cuadrada, 1 atm = psi/14.7)

Rpida

Picos angostos (alta eficiencia)

Separa compuestos no-voltiles o trmicamente inestables

Esquema del equipo de HPLC

INYECTOR PRE-COLUMNA

BOMBA
CMARA DE MEZCLA COLUMNA

DETECTOR

Elucin isocrtica vs elucin con gradiente

Elucin isocrtica: solvente de composicin constante. Elucin con gradiente: solventes de distinta polaridad. Se vara la composicin de la FM en forma continua o escalonada. Elucin con gradiente

Elucin isocrtica

Solventes utilizados como FM

Solventes orgnicos, agua/solventes miscibles, agua/soluciones reguladoras Alta pureza

Tratamiento con He

Desgasificados Sistema de desgasificacin al vaco

Filtracin

Recipientes para la fase mvil y sistemas para el tratamiento del solvente.

Un aparato moderno para cromatografa de lquidos est equipado

con uno o ms recipientes de vidrio, cada uno de los cuales contiene 500 ml o ms de un solvente. Estn equipados con un sistema para eliminar los gases disueltos y el polvo de los lquidos. Los gases disueltos ocasionan flujos inestables y ensanchamiento de bandas; Una forma conveniente de tratar los solventes antes de introducirlos en el recipiente , consiste en hacerlos pasar al vaco a travs de un filtro millipore. Este tratamiento elimina los gases y la materia en suspensin. Una elucin que utiliza un solo solvente o una mezcla de solventes de composicin constante se denomina elucin isocrtica.

Sistemas de bombeo
Requerimientos Generacin de altas presiones (1000 - 6000 psi) Flujo libre de pulsaciones Caudales 0.1 10 mL/min Componentes resistentes a la corrosin (acero inoxidable, tefln)

Sistemas de bombeo.
Entre los requisitos para las bombas en cromatografa

de lquidos est: 1) La generacin de presiones de hasta 600psi( lb/in.2) o 414 bares. 2) Salida libre de pulsos. 3) Tasas de flujo de 0.1 a 10 ml/ min. 4)Reproducibilidad del flujo de 0.5 % relativo o mejor. 5)componentes resistentes a la corrosin a causa de la diversidad de solventes.

Bomba recproca o de movimiento alternado

etapa de aspiracin
pistn

etapa de descarga hacia la columna

fase mvil Ventajas: pequeo volumen interno, resiste presiones > a 10.000 psi, permite elucin con gradiente, caudales constantes e independientes de la contrapresin de la columna y la viscosidad del solvente Desventaja: produce flujo pulsado (amortiguar)

Sistemas de inyeccin de muestra

Llenado del bucle

muestra

Inyeccin de muestra en columna

eluyente
columna

eluyente columna

Sistemas de inyeccin de muestra

Sistemas de inyeccin de muestra

Precolumna

Composicin similar a la columna cromatogrfica

Elimina materia en suspensin y componentes de la muestra que se unen irreversiblemente a la FE

Se usa para mejorar la vida de la columna. Se reemplaza cuando se contamina.

Columna
Tubos de acero inoxidable. Ocasionalmente de vidrio resistente

Rectas (10 - 30 cm de longitud) y 4-10 mm d.i.

Tamao partculas de relleno: 510 mm Columnas termostatizadas: en general se trabaja a T ambiente. La T constante mejora el cromatograma

Columna

Columna
Rellenos
Relleno pelicular. Esferas de vidrio o polmero no porosas de 30 40 mm de dimetro. En la superficie de las esferas se deposita una capa delgada y porosa de slica, almina, polmero.
Relleno de partculas. Micropartculas porosas de slica, almina o polmero de 3 10 mm de dimetro. Se recubren con pelculas orgnicas que unen qumicamente o fsicamente a la superficie.

Detectores
Basados en la medida de una propiedad del eluyente (ndice de refraccin, constante dielctrica, densidad) Basados en la medida de una propiedad del soluto (absorbancia, fluorescencia, corriente lmite) Requisitos

Sensibilidad adecuada
Respuesta lineal amplia Respuesta rpida y reproducible

Manejo sencillo

Celda del detector UV-visible en HPLC

De la columna

Ventanas de cuarzo

Fuente UV

Detector

Al desecho

Eficiencia de la columna

Tamao partculas de empaque

Tamao de muestra

Ensanchamiento extracolumna

H vs m para partculas de diferentes dimetros

H 10 mm

5 mm 3 mm

m (cm/min)

Tamao de muestra
H
adsorcin L-L (k = 2.3) fase ligada (k = 4.3) fase ligada (k = 1.2) mg muestra/ g empaque

De acuerdo al tipo de FE el efecto es ms o menos pronunciado

Ensanchamiento extracolumna
Se origina en los tubos que conectan los componentes del sistema cromatogrfico (puerto de inyeccin y columna, columna y detector, etc.)

radio del tubo [cm]

pr2m Hex = 24 DM

velocidad lineal de FM [cm/s]

coeficiente de difusin del soluto en fase mvil [cm2/s]

Seleccin de la fase mvil en cromatografa de reparto.

El factor de retencin k

facilidad , debe comprendido 2 y 10.

se puede manipular con estar en el intervalo real

Influencia de la fuerza del solvente en los factores de retencin.

La fuerza del solvente depende de la naturaleza del analito y de la fase estacionaria, el mas til para la cromatografa de reparto es el ndice de polaridad P . P: Es una medida numrica de la polaridad relativa de varios solventes.

Propiedades de las fases mviles cromatogrficas ms comunes.

 Cualquier ndice de polaridad que se desee entre esos

lmites se puede conseguir por mezcla de dos solventes apropiados. Entonces, el ndice de polaridad PAB de una mezcla de solvente A y B es :

P'AB =AP'A+B+P'B
Donde: -P'A y P'B :son los ndices de polaridad de los dos solventes -A y B: son las fracciones en volumen de cada uno de los solventes A Y B.

 La forma mas fcil de mejorar la resolucin cromatogrfica de

dos especies es manipulando el factor de retencin k, el cual puede modificarse a su vez cambiando el ndice de polaridad del solvente. Para una separacin en fase normal:

=10(P1-P2)/2
Donde: K1 y k2: son los valores inicial y final de k para un soluto. P1 y P2: Son los valores correspondientes de polaridad.

En el caso de una columna vertical en fase inversa.

=10(P2-P1)/2

EJEMPLO:
En una columna de fase inversa, un soluto tena un

tiempo de retencin de 31.3 minutos y una especie no retenida requera de 0.48 minutos para la elucin cuando la fase mvil contena un 30% en volumen de metanol y 70% de agua. Calcule. A) k. B) Una composicin de agua-metanol que produzca un k de aproximadamente 5.

Solucin:
A) Al aplicar la ecuacin se obtiene: K=(31.3-0.48)/0.48=64 B) Para obtener P para la fase mvil se sustituyen los ndices de polaridad del metanol y del agua de la tabla en la ecuacin y se obtiene : P=(0.30x5.1)+(0.70x10.2)=8.7 Al sustituir este resultado en la ecuacion, se llega a

=10(P2-8.7)/2

 Si se calculan los logaritmos de ambos miembros de la

ecuacin se tiene que P2 es:

= 0.5P2-4.35 P2=6.5

-Sea x la fraccin de volumen de metanol en la nueva mezcla de solventes y si se sustituye de nuevo en la ecuacin entonces:
6.5=(x X 5.1) + ( 1-x) X 10.2 X=0.73 73%