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Caldo de Fermentacin
Con Clulas
Protenas Intracelular
Separacin de Clulas
Rompimiento Celular
Sin Clulas
Refinamiento
Cundo se usa?
Los procesos de bio-separacin se inician con una separacin de la biomasa desde el resto del cultivo. En muchos casos los productos se encuentran en el medio. En estos casos la biomasa se descarta y hasta se puede vender como sub-producto.
Pero en otros casos el producto de inters se encuentra en el interior de las clulas, en particular la mayora de las protenas producidas por manipulacin gentica de bacterias que no segregan las protena al medio, pero que son precipitadas en el interior de la clulas en forma de cuerpos incluidos (inclusion bodies) . Se trata de protenas intracelulares.
Procesos y Equipos La liberacin de las protenas intracelulares involucra la ruptura o permeabilizacin de la pared celular. Los equipos involucrados en esta etapa no han sido diseados especialmente para el rea biotecnolgica sino que son prestadas de otras reas (rea de alimentos, de pinturas y pigmentos). Este rompimiento o permeabilizacin se puede llevar a cabo por dos mtodos: Mtodos No- Mecnicos Mtodos Mecnicos
La seleccin de una u otra tcnica depender las caractersticas del producto se desea purificar,tales como: Resistencia a: Medios alcalinos Solventes Detergentes Enzimas Temperatura Esfuerzo de corte.
Mtodos Mecnicos
El rompimiento se lleva a cabo por accin mecnica, pudiendo ser: Friccin Efecto de la presin Colisiones.
Estos mtodos incluyen las operaciones unitarias ultrasonido, homogenizacin , molinos de bolas, etc.
de
Estos mtodos resultan ser agresivos con las protenas de inters, debido principalmente a la generacin de calor. Adicionalmente, el escalamiento resultan ser un problema significativo.
Mtodos Mecnicos
Tcnicas
Homogenizador de cuchillos Homogenizador alta presin
Principios
Las clulas son rotas en un mezclador
Las clulas son forzadas a pasar a travs de un pequeo orificio lo que produce que se rompan por el esfuerzo de corte
Stress
Moderado
Costos
Moderado
Ejemplos
Rompimiento de tejidos y clulas animales.
Tratamiento a gran escala de suspensin de clulas.
Fuerte
Moderado
Ultrasonificacin
Fuerte
Caro
Molienda
Moderado
Barato
Molinos de bolas
Fuerte
Barato
Mtodos No-Mecnicos
Pueden ser de dos tipos: Agente qumicos Solventes orgnicos Detergentes Alcalis Agua (shock osmtico)
Enzimticos se trata de enzimas que permeabilizan en forma selectiva las membranas celulares, tales como lisozima, glucanasas, mananasas, etc.
Los mtodos no-mecnicos son fciles de escalar, si uno necesita tratar 10 veces ms materia orgnica basta con adicionar 10 veces ms reactivo qumico o enzimtico.
Mtodos No-mecnicos
Tcnicas
Permeabilizacin Enzimtico
Principios
Permeabilizacin de la pared celular, lo cual produce el rompimiento de la clula
Stress
Suave
Costos
Caro
Ejemplos
Tratamiento de M. lysodeikticus con lisozima.
Ruptura de Clulas de Glbulos Rojos.
Shock Osmtico
Solubilizacin
Suave
Suave
Barato
Moderadamente Caro
Disolucin de Lpidos
Modera do
Barato
Fuerte
Barato
MTODOS MECNICOS Los mtodos mecnicos se pueden dividir en dos tipos : Mtodos a pequea escala son : Ultrasonificacin Molina con abrasivos Homogenizadores Mtodos a gran escala Homogenizadores Molinos de bolas a alta presin
Para determinar el contenido de protenas total de una clula se debe realizar la desintegracin total de ellas, para ello se utiliza la siguiente metodologa:
1. 2. Se adicionan 1 volumen de bolas de vidrio en un ependorf. Se adiciona 1 volumen de las clulas a desintegrar (en forma de pasta, previamente
separadas del caldo)
1-3
4-5
3.
4. 5. 6.
Se agitan fuertemente en un vortex, entre 2 y 5 minutos (controlando que no se caliente) Se repite el punto 4 hasta asegurarse que no se rompen ms las clulas. Se separan los desechos de la solucin y se analiza la concentracin de protenas.
100% Rompimiento
Ultrasonificacin
Se utilizan frecuencias de 20 Khz esto produce vibraciones que provocan el fenmeno de cavitacin. Se producen zonas de baja presin en el lquido El lquido se transforma en gas formndose pequeas burbujas Las burbujas colapsan debido a los cambios de presin. Se producen fuertes esfuerzos de corte en el lquido que rompen las clulas.
Ultrasonicador
Homogenizadores
La idea es generar altos esfuerzos de corte que produzcan la ruptura de las clulas. Los altos esfuerzos de corte se pueden obtener por: 1. Embolos 2. Cuchillas 3. Pistones
mbolos
Cuchillas
Pistones