2.

Microorganismos de importancia industrial y formulacin de medios de cultivo

2.4. Medios para fermentaciones industriales

2.4.1. Conceptos Generales

Investigacin detallada para determinar el medio ms adecuado en un proceso de fermentacin Todos los microorganismos (m.o.) requieren de agua, fuentes de: energa, carbn, nitrgeno; elementos minerales y posiblemente vitaminas, as como oxgeno si son aerobios

Elementos principales requeridos por las clulas microbianas

ELEMENTO FUENTE
Compuestos orgnicos, CO2
O2, H2O, compuestos orgnicos, CO2 H2, H2O, compuestos orgnicos NH4+, NO3, N2, compuestos orgnicos

FUNCIN METABLICA
Componente principal del material celular
Componente principal del material celular Componente principal del material celular Componente principal del material celular

C O H
N

SO4-2, S2O3, HS-, S, compuestos orgnicos

Componente de la cis, met, pirofosfato de tiamina, coenzima A, c. a-liplico

(Cont.)
ELEMENTO P FUENTE
HPO4-2

FUNCIN METABLICA
Componente de los cidos nuclicos, ATP y otros nucletidos y fosfolpidos

K
Mg Ca

K+
Mg+2

Principal catin orgnico dentro de la clula, cofactor de algunas enzimas

Cofactor de muchas enzimas (particularmente cinasas) presente en paredes y membranas celulares Cofactor de enzimas; presente en exoenzimas importantes ( amilasas, proteasas), componente de las endoesporas (cadipicolinato) Componente de los citocromos, protenas fierro-azufre (ferredoxinas) cofactor de enzimas (hidratasa)

Ca+2

Fe

Fe+2 , Fe+3

Criterios para crear un medio

1. 2. 3. 4. 5. Mxima productividad Mxima concentracin de producto o biomasa Mxima velocidad de formacin del producto Productividad mnima de productos indeseables Econmico, calidad consistente, fcilmente disponible 6. Problemas mnimos en otros aspectos: aereacin y agitacin, extraccin, purificacin y tratamiento de desechos

Ejemplos de medios que cumplen con dichos criterios

Fuentes de carbono:
Mieles de caa, mieles de remolacha, cereales, almidones, glucosa, sacarosa y lactosa

Fuentes de nitrgeno:
Sales de amonio, ureas, nitratos, licor de maz, harina de soya, desechos de rastros y residuos de fermentacin

2.4.2. Formulacin del medio

Fuente de Carbn y Energa Fuente de Otros

+ nitrgeno

+ requerimientos

Biomasa celular

+ Productos + CO2 + H2O + Calor

2.4.2. Formulacin del medio

Cooney (1981): Demostr que algunos nutrientes frecuentemente estn adicionados en exceso, ejem: P y K, y otros muy cerca de los valores lmite (ejem: Zn y Cu) Incrementos en P, incrementan la capacidad buffer del medio Es necesario poner una atencin considerable al diseo del medio

2.4.2. Formulacin del medio

Algunos m.o. no pueden sintetizar nutrientes especficos, ejem: aminocidos, vitaminas y nucletidos Se identifica un factor especfico de crecimiento que deber incorporarse al medio en cantidades adecuadas como un componente puro o como el componente de una mezcla compleja

2.4.2. Formulacin del medio

El carbono tiene un papel importante en la biosntesis y generacin de energa Los requerimientos de carbono bajo condiciones aerbicas se pueden estimar a partir del coeficiente de productividad celular (Y, SoKo) definido como: Cantidad de material celular seco producido Cantidad de carbono del sustrato utilizado

Valores de Y para bacterias (Abbot y Clamen, 1973)

SUSTRATO Y

Metano
N. Alcanos Metanol Etanol Acetato

0.62
1.03 0.40 0.68 0.34

Maleato
Glucosa (mieles)

0.36
0.51

2.4.2. Formulacin del medio

Cooney (1979): Calcul Y tericas para la biosntesis de penicilina G sobre la base de balances de materia y energa, analizando la estequiometra de la reaccin:

a2C6H12O6 + b2NH3 + c2O2 + d2H2SO4 + e2PAA

n2PenG + p2CO2 + q2H2O (1)

2.4.2. Formulacin del medio

La solucin a la ecuacin (1) es: 10/6 C6H12O6 + 2NH3 + O2 + H2SO4 + C8H8O2 C16H18O4 N2S + 2CO2 + 9H2O Y terica = 1 g de penicilina G por g de glucosa

2.4.2. Formulacin del medio

USO DE LA GLUCOSA CONSUMIDA FERMENTACIN FERMENTACIN INTERMITENTE SEMICONTINUA

Produccin celular

28%

26%

Mantenimiento
Produccin de penicilina

61%
11%

70%
6%

Valor mximo de Y experimental = 0.053 g/g

2.4.2.1. Agua
En los procesos fermentativos se requieren grandes cantidades de agua limpia y de composicin consistente, ya que:
Es componente mayor de todos los medios de fermentacin Es necesaria en muchos servicios auxiliares pH Slidos disueltos Contaminacin del efluente Contenido mineral

Factores a considerar:

2.4.2.2. Fuentes de energa y carbono

La energa para el crecimiento proviene de: La mayora de los m.o. industriales son quimiorganotrofos La fuente ms comn de energa es la fuente de carbono: carbohidratos, lpidos y protenas Algunos m.o. utilizan metano o metanol como fuente de carbono y energa
Oxidacin de los componentes del medio Luz

Crecimiento fototrfico
TIPO Donador de eH2O Fuente de carbono CO2 Organismo

Fotoliotrofa

Plantas, algas verde azules

H2S,S,H2 H2O Fotoorganotrofa Orgnico Orgnico

Chromatiaceae, Chlorobiaceae Rhodospirillaceae

Crecimiento quimiotrfico

Tipo

Donador Aceptor de ede eO2 NO3SO4-2

Fte. de carbono
Org. Org. Org.

Organismo
Pseudomonas, Bacilli,
levaduras

Quimioorganotrofa Org. Org. Org.

Bacillus licheniformis
Bacterias reductoras de sulfato Clostridia, bacilos del cido lctico, E. Coli, levaduras

Org.

Org.

Org.

Crecimiento quimiotrfico (cont.)

Tipo
Quimiolitotrofa Donador Aceptor de ede eH2 H2 S H2 S Fe+2 NH4+ NH2H2 H2 O2 O2 NO3O2 O2 O2 CO2 CO2 Fte. de carbono CO2 CO2 CO2 CO2 CO2 CO2 CO2 CO2

Organismo
Bacterias oxidantes de hidrgeno Tiobacilos

Th. Denitrificans Th. Ferrooxidans Nitrosomas Nitrobacter

Metangenos

Acetobacterium

Ejemplos de fuentes de carbn normalmente utilizadas

Carbohidratos:
almidn de maz, de cereales o de papas maz y cereales parcialmente molidos preparaciones de glucosa a partir de almidones hidrolizados malta (granos de cebada germinados parcialmente y tratados trmicamente) sacarosa de caa o remolacha como melazas (forma impura)

Composicin de malta de cebada (carbohidratos) (Haris, 1962)

CARBOHIDRATO Almidn Sacarosa Azcares reductores % b.s. 58 60 3 5 3 4

Otros azcares
Hemicelulosa Celulosa

2
6 8 5

Anlisis de melazas de caa y remolacha (Rhodes y Fletcher, 1966)

CARBOHIDRATO REMOLACHA (% w/v) CAA (% w/v)

Sacarosa
Rafinosa

48.5
1.0

33.4
0

Azcar invertida

1.0

21.2

Ejemplos de fuentes de carbn normalmente utilizadas

Aceites vegetales comerciales
Oliva, maz, semilla de algodn, linaza, soya, etc. Son fuentes de carbono fundamentalmente como cido oleico, linoleico y linolnico Acta como antiespumante en asociacin con un agente surfactante

Ejemplos de fuentes de carbn normalmente utilizadas

Licor de maz
Subproducto en la extraccin del almidn de maz Se utiliza principalmente como fuente de nitrgeno, pero adems contiene cido lctico, azcares reductores y polisacridos complejos

Protenas
Albmina bovina y harina de carne Se utilizan en la formulacin de medios para la produccin de vacunas

Factores que influyen sobre la seleccin de la fuente de carbono

El producto principal que se desea obtener La eliminacin de impurezas de la fuente de carbohidratos Legislaciones El mtodo de preparacin del medio, particularmente la esterilizacin

Influencia de la fuente de carbono sobre la formacin del producto

La velocidad a la cual la fuente de carbono es metabolizada puede influenciar la formacin de biomasa o la produccin de metabolitos primarios o secundarios Crecimiento rpido por la presencia de altas concentraciones de azcares rpidamente metabolizables genera baja productividad de metabolitos secundarios (Griseofulvina, Penicilina, Bacitracina, Estreptomicina y Actinomicina) El problema se resuelve usando azcares metabolizables ms lentamente (lactosa) o con sistemas continuos y semicontinuos

2.4.2.3. Fuentes de nitrgeno

La mayora de los m.o. industriales pueden utilizar fuentes orgnicas e inorgnicas de nitrgeno Nitrgeno inorgnico:

Nitrgeno orgnico:
Aminocidos Protena urea

amoniaco (gas) o nitratos: condiciones alcalinas sales de amonio: condiciones cidas

Ejemplos de fuentes de nitrgeno

Licor de maz Harina de soya Harina de cacahuate Harina de semillas de algodn Hidrolizado de casena Desechos de rastro Harina de pescado Extracto de levadura

Factores que influyen sobre la seleccin de fuentes de nitrgeno

El amoniaco o in amonio se prefiere como fuente de nitrgeno, pues la enzima nitrato reductasa es inhibida en presencia del mismo. Adems, el in amonio controla la accin de ciertos sistemas enzimticos en hongos para la incorporacin de aminocidos al m.o. (aminocido permeasas)

Factores que influyen sobre la seleccin de fuentes de nitrgeno

En Aspergillus nidulans el amoniaco regula la produccin de proteasas alcalinas y neutrales La fuente de nitrgeno influye el patrn de fermentacin. La produccin de antibiticos puede ser inhibida por una utilizacin rpida del nitrgeno. Ejemplo: en la produccin de polienantibiticos, la harina de soya es buena fuente de N.

Factores que influyen sobre la seleccin de fuentes de nitrgeno

Rhodes (1963) Demostr que la concentracin ptima de la fuente de nitrgeno disponible para la produccin de griseofulvina varan en funcin de la forma del inculo y del tipo de fermentador

Mejores fuentes de nitrgeno seleccionadas mediante planes de desarrollo

PRODUCTO Penicilina Bacitracina Rivoflavina Novobiocina Rifamicina Giberalinas Butirosina Polienos PRINCIPAL FUENTE DE N Licor de maz Cacahuate granulado Digerido pancretico de gelatina Solubles de destilera Pharmamedia, Harina de soya, (NH4)2SO4

Sales de amonio y ftes. nats. de N vegetal Sangre seca o hemoglobina con (NH4)2SO4 Harina de soya

2.4.2.4. Minerales y vitaminas

a. Minerales
En muchos medios Mg, P, K, S, Ca y Cl son componentes esenciales en concentraciones tales que es necesario adicionarlos Otros elementos como Co, Cu, Fe, Mn, Mo y Zn son esenciales pero estn presentes como impurezas en otros ingredientes

Elementos traza requeridos por las clulas microbianas

Elemento Zn Mn Na Cl Mo Funcin metablica Componente de la alcohol deshidrogenasa, fosfatasa alcalina, aldolasa, RNA y DNA polimerasa Componente de la superxido dismutasa bacteriana, PEP, carboxicinasa, citrato sintetasa Requerido por bacterias haloflicas Requerido por bacterias haloflicas Componente de la nitrato reductasa, nitrogenasa, formato deshidrogenasa

Elementos traza requeridos por las clulas microbianas (cont.)

Elemento Se Co Funcin metablica Componente de la glicina reductasa, formato deshidrogenasa Componente de la vitamina B12 y enzimas con vitamina B12 (glutamato mutasa, metilmalonil CoA mutasa) Componente de la citocromo oxidasa y oxigenasas Componente de algunas formato deshidrogenasas Componente de la ureasa y del crecimiento auttrofo de bacterias que oxidan hidrgeno

Cu Cr Ni

Intervalos de concentraciones tpicas de componentes minerales (g/dm3)

COMPONENTE KH2PO4 MgSO4-7H2O KCl CACO3 FeSO4-4H2O ZnSO4-8H2O MnSO4-H2O CuSO4-5H2O NaMoO4-2H2O INTERVALO 1.0 4.0 0.25 3.0 0.5 12.0 5.0 17.0 0.01 0.1 0.1 1.0 0.01 0.1 0.003 0.01 0.01 0.1

Minerales
La concentracin de los minerales puede ser muy crtica en ciertos procesos (metabolitos secundarios) La concentracin de fosfato inorgnico influye sobre la produccin de bacitracinas, cido ctrico, monomicina, novobiocina, oxitetraciclina, polienos, ristomiocina, rifamicina Y, estreptomicina y vancomicina

Minerales

Garner y col. (1950) sugirieron que una funcin importante del calcio en el medio de fermentacin era precipitar el exceso de fosfatos inorgnicos y sugirieron que el calcio mejora indirectamente la productividad de estreptomicina

Minerales
Weinberg (1970):
Mn, Fe y Zn son los minerales ms crticos en el metabolismo secundario La productividad del producto vara linealmente con el logaritmo de la concentracin del metal clave (No. atmico. 23-30, 42) La relacin lineal no se aplica a concentraciones insuficientes o txicas para el crecimiento

Elementos trazas requeridos en la obtencin de metabolitos

PRODUCTO Bacitracina Riboflavina Proteasa Actinomicina ELEMENTOS TRAZA Mn Fe, Co Mn Fe, Zn

Cloramfenicol

Fe, Zn

Elementos trazas requeridos en la obtencin de metabolitos (cont.)

PRODUCTO Neomicina Acido ctrico Penicilina Griseofluvina ELEMENTOS TRAZA Fe, Zn Fe, M, Zn Fe, Zn, Cu Zn

Patulina

Fe, Zn

Vitaminas
Muchas de las fuentes de carbono y nitrgeno contienen todas o algunas de las vitaminas necesarias Para evitar una deficiencia de vitaminas es conveniente utilizar una mezcla cuidadosa de materiales Cuando slo se requiere de una vitamina, resulta ms econmico adicionarla en su forma pura Ejemplos: uso de pantotenato de calcio en la formulacin del medio destinado a la produccin de vinagre y biotina para cido glutmico

Vitaminas y compuestos relacionado requeridos para el crecimiento

Compuesto
c. p-aminobenzico

Funcin metablica
Precursor del tetrahidrofolato, utilizado en la transferencia de unidades de un carbono Coenzima que participa en reacciones de carboxilacin Tetrahidrofolato necesario en la transferencia de unidades de un carbono Precursor de NAD y NADP Precursor de coenzima A (portador de grupos de acilo)

Biotina

Ac. flico
Ac. nicotnico Ac. pantotnico

Vitaminas y compuestos relacionado requeridos para el crecimiento (cont.)

Compuesto
Vitamina B2 Vitamina B6 Vitamina B1

Funcin metablica
Fosfato de piridoxal usado en reacciones de transminacin y descarboxilacin Componente de los grupos prostticos FMN y FED de las flavoprotenas Componente del pirofosfato de tiamina en descarboxilasas, transaminasas y transcetolasas

Vitaminas y compuestos relacionado requeridos para el crecimiento (cont.)

Compuesto
Vitamina B12 Vitamina K

Funcin metablica
Coenzima que intervine en reacciones de rearreglo (glutamato mutasa) Precursor de la menaqinona un portador de electrones (por ejemplo, fumarato reductasa) Interviene en la metanognesis

Coenzima M

Recirculacin del nutriente

Los fermentadores continuos de gran escala, utilizados en la produccin de SCP, se disean para operarse con recirculacin de la alimentacin lquida

Es necesario ajustar en forma adecuada los niveles de nutrientes

Buffers

El control de pH es extremadamente importante si se quiere alcanzar una productividad ptima Se debe adicionar al medio de cultivo un compuesto que sirva como buffer pH 7 Carbonato de calcio Los fosfatos juegan un papel importante como buffers Uso balanceado de fuentes de carbono y nitrgeno control de pH Control externo del pH: adicin de amoniaco o hidrxido de sodio y cido sulfrico

Adicin de precursores y reguladores metablicos al medio

Manipulan el progreso de la reaccin

Precursores
Inhibidores Inductores

Regulan la generacin de producto en lugar del crecimiento de m.o.

Precursores
Algunos compuestos qumicos cuando se adicionan a ciertas fermentaciones se incorporan directamente dentro del producto deseado Ejemplo: incremento de la productividad de penicilina (de 20 a 100 unidades/cm3) al adicionar licor de maz

Precursores

Fenilmetilamina contenida en el licor de maz

Penicilina

Bencil penicilina (Penicilina G)

Precursores

Precursor Ac. Fenilactico

Producto Penicilina G

Microorganismo

Ac. Fenoxiactico
Cloruro

Penicilina V
Clorotetraciclina

Penicillium chrysogenum Penicillium chrysogenum Srepomices aureofaciens

Precursores (cont.)

Precursor D-treonina

Producto L-isoleuina

Microorganismo

Glicina
Ac. a amino butrico

L-serina
L-isoleucina

Serratia Marscescens Corynebacterium glycinophilum Bacillus subtilis

Inhibidores

Al adicionar ciertos inhibidores a las fermentaciones se puede producir ms de un producto especfico o un producto metablico intermedio Ejemplo: produccin de glicerol
+ SO3

CH3CH=O + Na

CH3CH

OH
+ SO3 Na

Inhibidores
Producto
Glicerol

Inhibidor
Bisulfito de sodio Bromuro

Efecto principal
Reprime la produccin de acetaldehido Reprime la formacin de Clorotetraciclina Permeabilidad de la pared celular Inhibe otras rifamicinas

Microorganismo
S. cerevisiae

Tetraiclina

Streptomyces aureofaciens Micrococcus glutamicus Nocardia mediterranei

Ac. glutmico Penicilina Rifamicina B Di-etil barbiturato

Inductores

La mayora de la enzimas de inters industria son inducidas Las enzimas inducidas son sintetizadas slo en respuesta a la presencia en el medio de un inductor El inductor normalmente es el sustrato para la enzima o un compuesto estructuralmente relacionado

Precursores
Enzima
a-amilasa

Inductor
Almidn Maltosa Celulosa

Microorganismo

Aspergillus spp Bacillus subtilis Trichoderma virde

Celulasa

Pectinasas

Pectina

Aspergillus spp