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GENERALIDADES
Uno de los requerimientos ms importantes para el manejo adecuado de una enfermedad es la identificacin correcta del agente fitopatgeno, de forma de iniciar un tratamiento adecuado lo ms temprano posible. Algunas enfermedades pueden diagnosticarse fcilmente por medio de una examinacin visual, pero otras requieren pruebas de laboratorio para su diagnstico. Estos procedimientos pueden algunas veces tomar varios das o semanas, y en algunos casos poseer escasa sensibilidad. Afortunadamente, producto del avance de la biotecnologa, existen hoy en da nuevos productos y tcnicas que estn disponibles para complementar o reemplazar los procedimientos de laboratorio, de forma de acelerar la obtencin de resultados y permitir un diagnstico ms temprano. Las enfermedades causadas por microorganismos pueden ser diagnosticadas por medio de la identificacin de una caracterstica nica del organismo, tales como su material gentico o una protena. Las tcnicas moleculares para la deteccin de fitopatgenos han sido impactadas profundamente por dos grandes advenimientos en los ltimos 30 aos. Primero fue la deteccin basada en el uso de anticuerpos, con el desarrollo de los anticuerpos monoclonales (2) y del test de ELISA (Enzyme Linked immunosorbent assay) (1). Estos avances impactaron especialmente a la virologa y bacteriologa, ya que estos agentes patgenos pudieron ser identificados y detectados mucho ms rpidamente (5). Luego vinieron las tcnicas basadas en la deteccin de cidos nucleicos, tales como la reaccin en cadena de la polimerasa y su capacidad de amplificar el ADN blanco millones de veces (6). Se espera que en el futuro cercano el diagnstico de patgenos enfrente una nueva revolucin tecnolgica, la que permitir una deteccin ilimitada de agentes por ensayo, con gran sensibilidad, exactitud y rapidez. Estos avances sern posibles gracias a los actuales esfuerzos que se desarrollan en el rea de la investigacin genmica y de la bioinformtica.
TCNICAS SEROLGICAS
Los mtodos inmunolgicos son ampliamente utilizados en la deteccin de patgenos en reas clnicas, agrcolas y ambientales. Un diagnstico inequvoco depende de la afinidad y especificidad del anticuerpo utilizado, lo que permite realizar la deteccin de bajas concentraciones de un patgeno. Las inmunoglobulinas (Ig) son una familia de glicoprotenas que se encuentran en el suero y otros fluidos de los mamferos y otros animales. Ellas forman parte del sistema inmune, son producidas en respuesta a un inmungeno y funcionan como anticuerpos (Figura 1). Estas Ig poseen una estructura bsica de cuatro cadenas polipeptdicas, dos cadenas idnticas livianas y dos cadenas idnticas pesadas, arregladas en una estructura tipo Y. La unin del antgeno al anticuerpo ocurre en el sitio Fab, unin que es de tipo de reversible y mediada por enlaces no covalentes.
EL TEST DE ELISA (ENZYME LINKED IMMUNOSORBENTpara detectar la presencia de ASSAY) Es una tcnica de laboratorio muy sensible que es usada
antgenos o anticuerpos de inters en una amplia variedad de muestras biolgicas. Una aplicacin comn del ELISA es adsorber anticuerpos a las paredes de una placa de plstico (poliestireno), a la que posteriormente se le agregar extractos de savia de la planta problema. Si el antgeno est presente en la muestra, stos sern inmobilizados a las paredes de la placa. Un segundo anticuerpo unido covalentemente a una enzima que reconoce el antgeno inmobilizado es agregado posteriormente. La presencia en cada pocillo de la placa del complejo anticuerpo-antgeno-anticuerpo+enzima es revelado por el cambio de color que ocurre al aplicar un sustrato cromognico que es utilizado por la enzima conjugada al segundo anticuerpo. El cambio de color, y por lo tanto la presencia del antgeno, es cuantificado por medio de la medicin de absorbancia que es efectuado es un lector de placa de ELISA . Existen numerosas variaciones de la metodologa de ELISA que se han descrito desde su desarrollo inicial en los aos 60s, pero el concepto es bsicamente el mismo, la deteccin inmunolgica de un antgeno o un anticuerpo en una muestra problema. El ELISA Directo es la forma ms simple de este ensayo. Es usado para detectar un antgeno que se ha unido a una fase slida (placa de poliestireno). Un anticuerpo conjugado con una enzima es incubado con el antgeno capturado y despus de lavar ele xceso del conjugado se agrega el substrato cromognico. El viraje a un color determinado indicar una interaccin especfica antgeno-anticuerpo. En el ELISA Indirecto , el antgeno es primero adsorbido a la placa, entonces acta un anticuerpo secundario y posteriormente el anticuerpo conjugado a la enzima. Para que se desarrolle color, el anticuerpo primario que es especfico para el antgeno debe estar presente en el complejo final. En el ELISA sndwich , un anticuerpo es
A. Ilustracin esquemtica de los pasos involucrados en la ejecucin del tets de ELISA. Pasos 1 y 2, produccin y purificacin de la inmunoglobulinas desde un conejo inmunizado. 3, activacin de la placa de poliestireno con el anticuerpo especifico; 4a, inmovilizacin del antgeno, 4b, aplicacin de extracto que no contiene el antgeno de inters; 5a y 5b , adicin del anticuerpo conjugado a la enzima y revelado de la placa con viraje del color de sustrato en caso de presencia del antgeno de inters (5a). B. Fotografa de un lector de ELISA C. Fotografa de una placa de poliestireno revelada con el sustrato cromognico. Los pocillos que delatan la presencia del antgeno de inters han virado a color amarillo.
Inmuno-impresin de tejidos. A la izquierda se representan los pasos claves de esta metodologa (ver texto).
adsorbido a la placa con el objetivo de capturar el antgeno. Un segundo anticuerpo conjugado, es utilizado despus de agregar la muestra con el antgeno de inters. De esta forma se obtiene el viraje del color del substrato que indica la presencia del antgeno en la muestra. Esta forma es considerada la ms especfica y sensible de las metodologas de ELISA hasta ahora descritas. Otra tcnica que es tambin utilizada en el diagnstico de fitopatgenos en la inmunoimpresin de tejidos, tcnica que tambin utiliza reacciones especficas antgenoanticuerpo, y que es muy similar al test de ELISA en placas, con la excepcin que en este caso la matriz slida es una pieza especial de papel (membrana). Con esta tcnica, la localizacin del patgeno o agente causal de la enfermedad puede ser determinada dentro del tejido del hospedero. El tejido de la planta es presionado contra una membrana (nitrocelulosa o nylon) a la que despus se le unirn los anticuerpos que se unen especficamente al patgeno. Un cambio de color indicar un resultado positivo y mostrar la localizacin del patgeno en el tejido del hospedero (Figura 4). Finalmente, otra de las tcnicas serolgicas disponibles para el diagnostico de agentes fitopatgenos son los test de flujo lateral, que en esencia son muy similares a los test de ELISA tradicionales efectuados en placas. En estas pruebas, la forma ms utilizada es el inmunoensayo en formato sandwich. Un anticuerpo especfico para el antgeno blanco (patgeno) es inmobilizado en una fase slida (membrana de nitrocelulosa). Un segundo anticuerpo conjugado a oro coloidal, que tambin reconoce al antigeno blanco, es depositado sobre esta membrana. Cuando la muestra que contiene el antgeno es aplicada a la membrana, sta migra a travs del conjugado solubilizndolo y formando un complejo que se mueve a travs de la membrana. Este complejo es atrapado al alcanzar el anticuerpo que est inmobilizado en la matriz, formndose un sandwich
A la derecha, en A se presenta la impresin de un tallo sano de pomelo que fue incubado con un anticuerpo anti-CTV (Virus de la Tristeza de los ctricos). En B, C y D, impresiones de tejido infectado con CTV, donde se puede ver claramente la localizacin del virus en el tejido floemtico del pomelo en las reas teidas de prpura oscuro (indicadas con una flecha negra).
La PCR ha sido aplicada primariamente a la deteccin e identificacin de fitoplasmas, virus y viroides. Sin embargo, hongos, bacterias y nemtodos pueden tambin ser detectados. En general la aplicacin de esta tcnica al diagnstico de enfermedades en plantas se ha centrado en organismos que no son fcilmente detectados por medio de otros mtodos o en aquellos casos en que la obtencin de resultados es lenta. Entre las ventajas que presenta esta tcnica se destacan su sensibilidad (100 a 1000 veces ms sensible que ELISA), la rapidez en la obtencin de resultados y el potencial para detectar varios patgenos simultneamente. Las desventajas que presenta son el alto costo de sus reactivos y equipos y la necesidad de un entrenamiento adecuado para su ejecucin debido a la posibilidad de contaminacin y la consecuente obtencin de falsos positivos.
La posibilidad de utilizar varios partidores en una reacci n de PCR que den origen a productos amplificados de diferentes tamaos abre la posibilidad de detectar varios patgenos en una misma reaccin. Adems, una variacin interesante de esta tcnica ha sido desarrollada recientemente, y ha sido llamado PCR en Tiempo Real. Esta tcnica facilita un monitoreo dinmico (ciclo a ciclo) de la reaccin de PCR permitiendo la cuantificacin del cido nucleico presente en la muestra y de esta forma conocer la concentracin del patgeno de inters . El desarrollo de la investigacin en el rea genmica, donde se utilizan microarreglos para establecer qu genes son sobre-expresados o silenciados despus de un determinado tratamiento abre nuevas posibilidades en el rea del diagnstico de fitopatgenos. Recientemente se han desarrollado biochips compuestos de sondas de cidos nucleicos anticuerpos arreglados en pequeas reas de vidrio. Este formato es robusto y flexible y tiene adems el potencial de incrementar la capacidad del diagnstico ya que es posible detectar mltiples patgenos simultneamente . Sin duda, el descubrimiento y descripcin de nuevos genes, molculas o secuencias son la base para el desarrollo de nuevas herramientas que permitan realizar un diagnstico rpido y preciso de enfermedades en plantas. Estos resultados sern tambin de vital importancia en la comprensin de las relaciones globales e interacciones existentes entre las plantas y sus patgenos u otros microorganismos asociados.