CONSERVACIN Y CONTROL DE CEPAS MICROBIANAS

Coleccin de Cultivo y servicio que ofrece

Qu son las Colecciones de Cultivo? - Son organizaciones que principalmente se ocupan de guardar convenientemente cepas de microorganismos,clulas superiores o diversos materiales biolgicos y los suministran, previa peticin,a laboratorios microbiolgicos o de biologa celular. - Son por lo tanto servicios de apoyo a los trabajos de microbiologa

Cundo aparecieron las primeras colecciones de cultivo?

-Kral (Praga, siglo XIX) fue la primera en tener catlogo -La ms antigua Lobaina (Belgica) (Hongos) -La ATCC,en 1925.No vinculos directos con la Universidad,es de carcter comercial (Manassas,USA). -La CECT,nace en el CSIC(Villanueva)(1960). -PRCC ,Profesor J.L.Ramos (Pseudomonas putida)

A partir de 1972 las CC se agrupan en la organizacion internacional denominada World Federation for Culture Collection (WFCC). En Europa a su vez estan agrupadas en la European Culture Colletion Organization (ECCO) que se fund en 1982.

Servicios que prestan las Colecciones de Cultivos 1.-Recoleccin,conservacin y suministro de cepas microbianas. -Recoleccin: Es el servicio mas tpico de una CC.Las colecciones reunen cepas que les llegan a traves de distintos conductos,las conservan convenientemente y las suministra previa peticin. -Conservacin: -Suministro: Se hace por correo de superficie,areo o mensajera,pero siempre empaquetado correctamente (tres envueltas) siempre hay que considerarlo como material potencialmente patgeno

2.-Recopilacin de datos de las cepas microbianas y difusi de los mismos Fichas,ordenadores,redes electronicas,public.de catlogos

3.-Servicio de guardera de las cepas microbianas Se pueden guardar por encargo cepas microbianas,cobrando una tasa anual y manteniendo el secreto de este depsito. 4.-Identificaciones microbianas. 5.-Depsito de cepas microbianas.

-Depsito pblico: Cualquier microbilogo puede depositar una cepa, que considere interesante,en la coleccin. Esta cepa se incorpora en el catlogo y puede suministrarsela a cualquier otro microbilogo que la solicite.
-Depsito no pblico:Algunas CC reciben el nombramiento de Autoridad Internacional de Depsito para fines de patentes,de esta manera se garantiza la descripcin total y reproduccin del proceso patentado. Una vez conseguida la patente,la cepa puede suministrarse previa autorizacin escrita del propietario,aunque no figure en el catlogo.

6.-Organizacin de Cursos 7.-Investigacin. 8.-Asesoramiento en general

Normas generales para la conservacin de cepas microbianas

Los tres objetivos para una correcta conservacin:
1.-Mantenimiento en Cultivo puro.(PUREZA) 2.-Que este viva.(VIABILIDAD) 3.-La cepa debe guardarse geneticamente estable(ESTABILIDAD)

Lapage en 1977 deca que:

a) Un cultivo inicial de una especie es una poblacin b) Un subcultivo es una poblacin diferente derivada de este cultivo inicial. c) Una cepa es una sucecin de subcultivos del cultivo inicial

los datos del cultivo inicial seran los mismos en la cepa?

NO necesariamente porque se producen cambios en los subcultivos

Los mtodos en la conservacin de las cepas microbianas tienen Como objeto fundamental minimizar estos cambios

La conservacin de cepas microbianas

Mtodo de eleccin o de conservacin a largo plazo
Conservacin por congelacin Conservacin por liofilizacin

Mtodos Alternativos
Conservacin por transferencia peridica Conservacin por suspensin en agua destilada o en agua de mar esteril

 Mtodos Restringidos
Desecacin en papel de filtro Desecacin en suelos,arena silicagel,etc Desecacin en bolitas de alginato Desecacin en sal gorda para halobacterias

La conservacin de cepas microbianas

Mtodo de eleccin o de conservacin a largo plazo
Conservacin por congelacin Conservacin por liofilizacin

Mtodos Alternativos
Conservacin por transferencia peridica Conservacin por suspensin en agua destilada o en agua de mar esteril

Conservacin de microorganismos por congelacin

La crioconservacin consiste en la conservacin de los microorganismos a temperaturas inferiores a cero grados centgrados. Se basa en la paralizacin del metabolismo celular por la disminucin del agua disponible.
Objetivos de la crioconservacin - Mantenimiento de la viabilidad -crioprotectores -La temperatura de almacenamiento -El estado fisiolgico de la clula - Mantenimiento de la estabilidad - Mantenimiento de la pureza

Hielo Hielo Hielo

H2O H2O

BACTERIA
H2O

Hielo

H2O

Hielo

Hielo

Hielo

Hielo

AGENTES CRIOPROTECTORES
OBJETIVOS
Minimizar daos durante la congelaci. Limitar la formacin de hielo (tasa de congelacin) Vitrificacin del agua

CARACTERISTICAS
No txico para la clula. Penetrar facilmente en la menbrana celular. Unirse a los electrolitos o a las molculas de agua.

Crioprotectores ms comunes
Glicerol Dimetilfulfxido (DMSO) cido glutmico Glucosa Sacarosa Meso inositol Lactosa Leche Descremada

Conservacin de microorganismos por congelacin

La crioconservacin consiste en la conservacin de los microorganismos a temper.inferiores a cero grados centgrados. Se basa en la paralizacin del metabolismo celular por la disminucin del agua disponible. Objetivos de la crioconservacin - Mantenimiento de la viabilidad -crioprotectores -La temperatura de almacenamiento (-70,-139) -El estado fisiolgico de la clula (Final f.logartmica) - Mantenimiento de la estabilidad - Mantenimiento de la pureza

Conservacin de microorganismos por congelacin

La crioconservacin consiste en la conservacin de los microorganismos a temper.inferiores a cero grados centgrados. Se basa en la paralizacin del metabolismo celular por la disminucin del agua disponible. Objetivos de la crioconservacin - Mantenimiento de la viabilidad -crioprotectores -La temperatura de almacenamiento -El estado fisiolgico de la clula - Mantenimiento de la estabilidad (fenotpica y genotpica) - Mantenimiento de la pureza (Hacer alcuotas)

Conclusiones
Crecer los cultivos a conservar hasta la mitad o final de la fase logartmica, a la temperatura ptima, en el medio ms adecuado. Ajustar el n de clulas a una concentracin final de 2-6x106 cl/ml. Aadir los crioprotectores adecuados a una concentracin ptima. Repartir la suspensin en ampollas de congelacin,cerrarlas hermeticamente y mantenerlas 30 minutos a 30. Disminuir la t lo mas rpido posible. A la hora de recuperar los microorganismos, descongelar rpidamente, sumergiendo las ampollas con el cultivo congelado en un bao a 37-40C.

La conservacin de cepas microbianas

Mtodo de eleccin o de conservacin a largo plazo
Conservacin por congelacin Conservacin por liofilizacin

Mtodos Alternativos
Conservacin por transferencia peridica Conservacin por suspensin en agua destilada o en agua de mar esteril

FUNDAMENTOS TERICOS DE LA CONSERVACIN DE MICROORGANISMOS POR LIOFILIZACIN

Liofilizacin
Es un mtodo de conservacin a largo plazo. Se basa en la paralizacin del metabolismo celular por falta de agua:congelacin y sublimacin

PROCESO Congelar el agua libre de las clulas

Eliminacin del agua Agua congelada Vapor de agua

Sublimacin

1 Fase de la Desecacin

2 Fase de la Desecacin

PROCESO
P R O T E C T O R

Congelacin Rpida
T ambiente,4C,-196C Tubos marcados

BOMBA BOMBA

condensador

Sellado al vacio

Ampolla

Tipos de Liofilizadores
Liofilizador con centrifugacin
Se utilizan ampollas de vidrio taponadas La suspensin se centrifuga durante la 1 fase de la desecacin Se estrechan las ampollas y,despus de conectarlas a una bomba de vaco,se sellan.
Ventajas:Se utiliza la centrifugacin para que el proceso de congelacin sea suave y de forma homognea

Liofilizador con estantes

La suspensin se prepara en viales y,es precongelada a T muy bajas antes de aplicar el vaco. La segunda etapa de la desecacin se realiza tambin en el liofilizador.

Ventajas:La Desecacin es de manera progresiva y continuada

Cundo aplicar la Liofilizacin?

Es un mtodo ampliamente utilizado para conservar distintos Microorganismos. SI NO -Dificultad de un crecimiento -Bacterias,Levaduras, Adecuado. Hongos,Algunos virus,Algas -Microorganismos delicados que no resisten el paso de Ejemplos:Rhodospirillum, congelacin. ,Azospirillum,vibrio y dems -A tamaos de clulas mayores, bacterias marinas. menos efectivo es el proceso -Levaduras miceladas con difiProtozoos,Clulas animales, cultad en la esporulacin. Clulas vegetales,Arqueobac-Hongos con grandes conidios o terias y bacterias delicadas con dificultad en la esporulacin.

FACTORES IMPLICADOS EN LA CONSERVACIN POR EL PROCESO DE LIOFILIZACIN

Condiciones de Cultivo
El medio de cultivo Depender del tipo de microorganismo y sus requerimientos nutricionales. Fase de crecimiento del cultivo. F.exponencial. Suspenciones celulares de 108-109 Clulas/ml en bacterias, algo inferiores en hongos y levaduras. Condiciones de incubacin. T,aerobiosis, anaerobiosis, etc.

FACTORES IMPLICADOS EN LA CONSERVACIN POR EL PROCESO DE LIOFILIZACIN

Preparacin de las clulas para su conservacin - Composicin del medio de la suspensin y adecuada densidad ptica El medio de la suspensin deber proteger la viabilidad de las clulas. Usar el crioprotector adecuado en cada caso. Glucosa 7,5% para Anaerobios Glucosa 15% para Levaduras. Glutmico 0,67M para Bacterias Lcticas. Inositol 5% para Bacterias. Leche descremada para Levaduras, Hongos y Actinomicetos. Tipos de ampollas,tubos y viales para la liofilizacin. Dependern del equipo del que se disponga o del tipo de muestra a liofilizar. Se aconseja que no sean de cristal de pyrex o borosilicato, porque por su elevada resistencia ofrecern muchas dificultad en su apertura.

FACTORES IMPLICADOS EN LA CONSERVACIN POR EL PROCESO DE LIOFILIZACIN

-Temperatura durante la sublimacin. Debe ser lo ms baja posible, sin subir por encima de 50C. -Grado de deshidratacin alcanzado. Lo ms alto posible. -Atmsfera de oxgeno en el tubo. Las clulas liofilizadas se guardan en tubos al vaco para evitar Rehidratacin o presencia de gases (como el oxgeno) que pueden daar las clulas. -Condiciones de almacenamiento. La temperatura debe ser constante a 18C y sin bajar de los 0C y, en oscuridad

LIOFILIZACIN
VENTAJAS
-Reduccin de la variabilidad del microorganismo. -Largo tiempo de conservacin. -Aplicabilidad para la produccin y distribucin de los lotes

DESVENTAJAS
-El alto coste inicial del equipo. -La preparacin de forma incorrecta de los distintos lotes puede desembocar en un estancamiento de la viabilidad y/o en prdidas en la estabilidad de los caracteres de los microorganismos

La conservacin de cepas microbianas

Mtodo de eleccin o de conservacin a largo plazo
Conservacin por congelacin Conservacin por liofilizacin

Mtodos Alternativos
Conservacin por transferencia peridica Conservacin por suspensin en agua destilada o en agua de mar esteril

Conservacin por transferencia peridica

Es un mtodo en el que los organismos permanecen activos durante el proceso. Consiste en la inoculacin de microorganismos en un medio de cultivo adecuado,la incubain a una T adecuada para obtener crecimiento y finalmente el almacenamiento bajo unas condiciones adecuadas. El proceso es repetido a intervalos que garanticen la obtencin de un cultivo fresco antes de la prdida del viejo.

PARA UNA BUENA RESIEMBRA PERIDICA

Medio de cultivo. Temperatura, tiempo y condiciones de incubacin. Intervalo entre dos resiembras
Reduccin de la temperatura de almacenamiento. Medios no enriquecidos,con limitacin de nutrientes. Restriccin de la accesibilidad de aire del cultivo.

La conservacin de cepas microbianas

Mtodo de eleccin o de conservacin a largo plazo
Conservacin por congelacin Conservacin por liofilizacin

Mtodos Alternativos
Conservacin por transferencia peridica Conservacin por suspensin en agua destilada o en agua de mar esteril

Conservacin por suspensin en agua destilada o en agua de mar esteril

Es un mtodo alternativo muy usado y que da altos porcentajes de viabilidad en diversos tipos de microorganismos, tanto hongos filamentosos como en levaduras y algunas bacterias. Consiste en Suspender en agua esteril unas cuantas clulas del cultivo que se quiere conservar. Para los hongos filamentosos que no esporulan, se puede poner en suspensin trocitos de agar con el crecimiento del Hongo. En el caso de microorganismos marinos, la suspensin se hace en agua de mar diluida.

La conservacin de cepas microbianas

Mtodos Restringidos
Desecacin en papel de filtro Desecacin en suelos,arena silicagel,etc Desecacin en bolitas de alginato Desecacin en sal gorda para halobacterias

Mtodos de desecacin
Paquete cerrado

Papel de filtro

Papel Watman n4

15 minutos 121C

Paquetes semicerrado

Desecador
P R O T E C T O R

Papel con cultivo

2-3 semanas 4C

Cultivo

Suspensin celular

Gotas de cultivo

Cerrado de Los paquetes

Mtodos de desecacin

Suelo

20 minutos 121C

Tierra esteril 4C

P R O T E C T O R

4-5das 25C

Cultivo esporulado

Suspensin de esporas

G E R M I N A Agotamiento C de I nutrientes N

Microorganismos en fase durmiente

Almacenamiento a 18C

Mtodos de desecacin

Bolas de Alginato

Gotas

Placa petri con Papel secante

Alginato 3% 13 minutos 121C CaCl2 0,03M esteril Gotas de alginato con cultivo 30 minutos Cultivo Suspensin en agua esteril Medio de Cultivo 0,75M Sacarosa 48horas Gotas de alginato con cultivo

DESECACIN
Corriente de aire estril bomba de vaco a Temperatura controlada

Polimerizacin del Alginato

Prdida del 30% del peso