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Os assuntos abordados:
Grfico de Ramachandran
Na dcada de 1950, o fsico Ramachandran fez uma teoria sobre os ngulos possveis de toro da ligao peptdica. Sua teoria previa que somente nas reas sombreadas no grfico abaixo poderia ocorrer um enovelamento estvel das protenas.
Observe no grfico que a regies Posteriormente, com nas determinao indicadas pelos crculos vermelhos, em que experimental dos ngulos Y e F (pontos no Ramachandram previu que no seria grfico) em diversas protenas, a sua teoria possvel existir estruturas estveis, at hoje foi comprovada. no se descobriu nenhuma protena.
Nas regies de A a F ocorrem algumas formas tridimensionais tpicas de protenas.
D 3 E F
4
a-hlice (esquerda) a-hlice (direita) Anel
F
2
ngulos de rotao da cadeia polipepttica em torno de um carbono alfa (1) (2) (3) (4)
F=180o, Y=0o
F=0o, Y=0o
Algumas das restries de rotao da ligao peptdica implicam em coliso da nuvem eletrnica do O ou N (ex: 2 e 4), ou ainda no posicionamento dos tomos de tal modo que no possibilita a formao de pontes de H (ex: 1 e 3).3
Os assuntos abordados: Aminocidos proticos: propriedades gerais classificao isomeria ptica ionizao comportamento cido-base e tamponamento Ligao peptdica versus ligao amida: ressonncia e coplanariedade grfico de Ramachandran
Iniciaremos essa aula relembrando os conceitos de nveis organizacionais da estrutura de uma protena, como visto na aula anterior:
Heme (grupo prosttico) Subunidades beta
Para entender a estrutura 3D das protenas, vamos dissec-la em nveis organizacionais para facilitar o estudo:
aminocido
Estrutura primria: a sequncia dos aminocidos na cadeia polipeptdica; mantida por ligaes peptdicas
o esqueleto covalente (fio do colar), formado pela seqncia dos tomos (-N-C-Ca-)n na protena.
Para entender a estrutura 3D das protenas, vamos dissec-la em nveis organizacionais para facilitar o estudo: x4
Estrutura secundria: Enovelamento de partes da cadeia polipeptdica Formada somente pelos tomos da ligao peptdica, atravs de pontes de H. Ex: alfa-hlices e folhas beta.
Estrutura terciria: Enovelamento de uma cadeia polipeptdica como um todo. Ocorrem ligaes entre os tomos dos radicais R de todos os aminocidos da molcula
Estrutura quaternria: Associao de mais de uma cadeia polipeptdica No modelo, um tetrmero composto de 4 cadeias polipeptdicas 7
O primeiro passo para se estudar a estrutura de uma protena obt-la de forma purificada.
Geralmente a protena que se deseja estudar um componente minoritrio (0,01 a 1%) em uma complexa mistura de outras protenas que esto presentes em qualquer tipo de tecido ou clula.
Purificar uma protena significa separar a protena de interesse das outras presentes na fonte de origem, de modo a ter somente ela no meio.
Muitas vezes purificar uma protena a etapa limitante no estudo de suas caractersticas estruturais e propriedades biolgicas.
Em uma prxima aula estudaremos os mtodos disponveis para purificao de uma protena 8
Para determinar a estrutura primria de uma protena, necessrio primeiro conhecer a composio (nmero e tipos) de seus aminocidos.
fluorescncia Tempo de reteno (min)
A protena pura tratada com HCl 6N fervente para quebrar (hidrlise) as ligaes peptdicas.
A mistura resultante submetida a mtodos cromatogrficos (fase reversa, troca inica) para separar os diferentes aminocidos.
Existem vrios mtodos para se determinar a sequncia de aminocidos de uma protena. Aqui veremos como funcionam os dois mtodos atualmente mais utilizados:
a) Mtodo de Edman: reao do aminocido N-terminal da protena com fenil-isotiocianato . A protena modificada submetida a hidrlise cida liberando o aminocido N-terminal modificado, e este identificado por cromatografia. Segue-se novo ciclo de reao com o prximo aminocido na protena, que se tornou o novo N-terminal.
b) Espectrometria de massa: determinao das massas de fragmentos correspondendo a aminocidos, retirados sequencialmente da protena. Veremos mais sobre esse mtodo na aula sobre eletroforese e protemica.
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ciclo 1
(1)
acoplamento
(2)
hidrlise com cido trifluoroactico Cada ciclo de reao compreende 3 etapas: ciclo 2 acoplamento 2. hidrlise cida 1. Reao da protena com PITC, que se acopla ao grupo amino NH2- livre do aminocido 1 (no exemplo, uma lisina, K); Hidrlise cida da protena conjugada com PITC libera a feniltiohidantona (PTH) do aminocido 1 e o restante da protena, tornando o aminocido 2 o novo resduo N-terminal (no exemplo uma serina, S); 3. Anlise cromatrogrfica do PTHaminocido e novo ciclo de reao com o novo N-terminal da protena.
(3)
Sequenciadores automatizados fazem todas as etapas, com capacidade para realizar 30 ciclos por dia, a partir de 100-200 picomoles de protena.
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Quando uma protena possui mais de 20-30 resduos de aminocidos, no possvel sequenci-la diretamente pelo mtodo de Edman.
Protena Total 150 a.a
Para obter a sequncia completa de uma protena, necessrio sequenciar vrios peptdeos da mesma protena, obtidos por diferentes tipos de quebra da cadeia, at haver sobreposio de suas sequncias.
protena inteira peptdeos mtodo A peptdeos mtodo B
Diferentes mtodos so utilizados para obter-se diferentes peptdeos da protena: A) enzimas proteolticas, como tripsina (quebra em resduos de Lys ou Arg) e quimotripsina (quebra em resduos de Phe); B) tratamento com brometo de cianognio (quebra em Met); e outros. 12
Estudos da estrutura tridimensional de protenas tiveram grande impulso na dcada de 1950 com Linus Pauling, e o uso de raios-X para analisar cristais de protena.
Na queratina (protena da l de carneiro), Pauling viu um padro repetitivo de zonas claras (eletrondensas) e escuras na difrao de raios X. Para explicar esse padro, foi proposto o modelo da a-hlice, com as seguintes caractersiticas: esqueleto covalente C-C-N-C-C-N da protena assume a forma de espiral ou mola, enrolada para a direita, com um espaamento de 3,6 resduos de aminocido por volta;
Raio X
Filme fotogrfico
o enovelamento estabilizado por pontes de hidrognio entre tomos das ligaes peptdicas de qualquer aminocido, exceto prolina;
a-hlice
Linus Pauling tambm props o modelo da folha pregueada ou estrutura b para explicar o padro de difrao de raios X pela b-queratina, protena presente na unha, chifres e cascos de animais.
Na folha pregueada as cadeias polipeptdicas dispem-se lateralmente (em paralelo) e fazem pontes de H entre os tomos da ligao peptdica. As cadeias laterais R dos aminocidos voltam-se para cima ou para baixo do plano da folha
Vista lateral Folha anti-paralela -C N Folha paralela
-C
-N
Pontes de H
-C
N 14
antiparalela
Folhas b paralelas e antiparalelas podem se formar em uma protena atravs de pequenas tores da cadeia polipeptdica.
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A a-hlice e a folha b so os tipos de estrutura secundria mais comum entre as protenas, por que no dependem da composio e sequncia de aminocidos, sendo estabilizadas apenas por pontes de H dos tomos da ligao peptdica. Entre os 20 aminocidos, apenas a prolina no pode fazer nenhuma das duas estruturas, por formar uma ligao peptdica mais rgida em torno do Ca. Existem outros tipos de estruturas secundrias conhecidas, como a dobra b ou alas (domnios) de ligao a ons, como Ca2+ ou Zn2+.
tipo 1
tipo 2
Dobra b
hlice-dobra-hlice
Zinc-finger
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Beta-alfa-beta
S beta
S alfa
Barril beta
Barril alfa-beta
A estrutura terciria descreve a forma tridimensional final de uma cadeia polipeptdica, resultando da associao de partes organizadas da molcula, chamadas de domnios ou motivos proteicos.
Alguns modelos de organizao estrutural, como os barris b e ab, aparecem 17 em vrios tipos de protenas, s vezes no relacionadas.
Protenas com estrutura quartenria so composta de mais de uma cadeia polipeptdica, que podem estar associadas covalentemente (pontes dissulfeto) ou no.
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Protena
Protena
NH2
CH2 OH
FORAS NO COVALENTES
Pontes de H -Aminocidos polares Quais so os tipos de foras que mantm a estrutura tridimensional de C CH2CH2
CH2CH2NH+ O 3
Ligao Inica
Ponte de Hidrognio
CH2
CH3
uma protena ?
CH CH3 CH3
Interaes hidrofbicas -Aminocidos apolares Foras de Van der Waals -Qualquer aminocido
20
NH2
CH2 OH
Pontes de H ocorrem: - entre os tomos da ligao peptdica (por exemplo, a a-hlice e a folha b); - entre cadeias laterais de aminocidos polares, carregados ou no; - para os grupos NH3+ e COO- dos aminocidos N- e C-terminal, respectivamente.
Ponte de Hidrognio
CH2CH2NH+ O 3
Ligao Inica
C CH2CH2
CH2
CH3
CH CH3 CH3
NH2
CH2 OH
Ligaes inicas: - ocorrem entre as cadeias laterais de aminocidos com cargas contrrias; - dependem do estado de ionizao dos aminocidos e do pH do meio;
Ponte de Hidrognio
CH2CH2NH+ O 3
Ligao Inica
C CH2CH2
CH2
CH3
CH CH3 CH3
-Interaes hidrofbicas: - ocorrem entre as cadeias laterais de aminocidos apolares; - radicais apolares so repelidos pela gua, aproximando-se uns dos outros;
NH2
CH2 OH
Ponte de Hidrognio
CH2CH2NH+ O 3
Ligao Inica
C CH2CH2
CH2
CH3
CH CH3 CH3
Foras de Van der Waals - uma fora eletrosttica que ocorre entre dipolos temporrios; - dipolos temporrios (durao de nanosegundos) so criados devido rbita errtica dos eltrons; - pode envolver qualquer tipo de aminocido; - geralmente coincidem com as regies da protena onde ocorrem as interaes hidrofbicas, pois a aproximao dos radicais apolares facilita a interao entre os dipolos.
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NH2
CH2 OH
Ponte de Hidrognio
CH2CH2NH+ O 3
Ligao Inica
C CH2CH2
CH2
CH3
CH CH3 CH3
Alm dos laos no covelentes, uma protena pode ter pontes dissulfeto formada a partir de dois resduos do aminocido Cys (cistena).
Pontes dissulfeto so covalentes e s podem ser rompidas por agentes redutores, como 2-mercapto-etanol.
A
O hormnio insulina composto por duas subunidades, A e B, unidas por duas pontes 25 dissulfeto intercadeia. Alm disso, a cadeia B possui uma ponte dissulfeto intracadeia
A conformao proteica depende basicamente de foras fracas, como a ponte de H e interaes hidrofbicas.
A tabela mostra que a fora das ligaes entre os tomos do esqueleto covalente de uma protena C-C-N-C-C-N da ordem de 70 a 80 kcal/mol. (No esquecer que a ligao C-N tem carcter parcial de dupla ligao C=N, por causa da ressonncia da ligao peptdica.)
Tipo de ligao Energia * (Kcal/mol) Tipo de ligao Energia * (Kcal/mol)
A ligao peptdica muito forte e s se rompe em condies qumicas drsticas, como 6N HCl a 100C. A ponte dissulfeto (-S-S-) relativamente rara entre as protenas. Por ser um lao covalente, no se rompe quando uma protena desnatura em meio cido ou por calor.
Protenas so molculas frgeis e podem ser desnaturadas, com perda de suas propriedades biolgicas, por pequenas variaes do pH ou da temperatura do meio. A ponte de H uma das principais foras envolvidas na estabilidade da conformao 26 nativa.
P 120 LIGAO TRIPLA 195 C C PONTE DE HIDROGNIO NH ...O OH ... N 4-5 NH ... N OH ... O
N C O
147
146
* O valor indicado para cada ligao refere- se quantidade de energia necessria para romp-la.
As interaes que as protenas estabelecem com o meio so importantes na determinao de sua conformao.
A bacteriorhodopsina formada por 7 segmentos de a-hlices apolares, que delimitam um canal interno de natureza polar.
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O ndice hidroptico dos aminocidos reflete a tendncia que as suas cadeias laterais tm para interagir com o meio aquoso. Quanto mais negativo esse ndice, mais polar o aminocido.
O perfil hidroptico de uma protena calculado como a soma dos ndices hidropticos a cada 9 resduos de aminocidos na cadeia polipeptdica. Permite prever regies da protena que interagem com a membrana plasmtica ou com os meios interno/externo.
citoplasma
A bacteriorhodopsina (bR) da arqueobactria Halobacterium salinarum, o sistema fotossinttico mais simples conhecido, permitindo a sobrevivncia do organismo em situaes de baixo O2, ao converter luz solar em energia qumica. Quando a molcula de bR absorve um fton, ela se torna uma bomba de prtons, bombeando H+ do meio intracelular para o exterior da clula. A energia do gradiente eletroqumico formado ento utilizada para sntese de ATP por uma ATP sintase.
Para ter esse tipo de estrutura, a protena apresenta as cadeias laterais de seus aminocidos apolares voltadas para fora, em contacto com os lipdeos da membrana da clula. Aminocidos polares esto voltados para dentro, delimitando o canal 29 de prtons da molcula.
Por que diferentes molculas de uma protena apresentam sempre a mesma estrutura 3D ? De onde vem a informao para a estrutura tridimensional de uma protena ? O pesquisador sueco Cristian Anfisen foi um pioneiro no estudo da estrutura 3D de protenas, e recebeu o Prmio Nobel (195..) por suas descobertas. Anfisen estudou a Ribunuclease (14.000d), protena com 8 cistenas formando 4 pontes dissulfeto. Ele demonstrou que era possvel fazer uma desnaturao reversvel da protena, adicionando uria e 2-mercaptoetanol para abrir as suas 4 pontes dissulfeto. Ao retirar lentamente (por dilise), esses reagentes, a protena volta a ter atividade biolgica, mostrando que voltou sua conformao nativa.
Esse fato surpreendente pois as 8 cistenas, combinadas 2 a 2, dariam 28 = 256 possibilidades, de formar diferentes pontes dissulfeto, mas apenas o arranjo original de pontes se forma.
A concluso de Anfisen foi a de que a sequncia dos aminocidos (no alterada na desnaturao) o que determina a estrutura 3D das protenas. 30
Como possvel termodinamicamente que as protenas tenham estruturas to altamente organizadas ? De onde vem a energia que estabiliza a estrutura 3D das protenas ?
entropia
energia
A energia que estabiliza a estrutura 3D de uma protena vem do aumento da entropia da gua, representando desorganizao da gua medida que interagem com a protena.
Estrutura nativa
In vivo conformaes intermedirias das protenas so estabilizadas por chaperonas durante o processo de sntese proteica.
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A PARTIR DISTO IMPORTANTE RELACIONAR A ESTRUTURA TRIDIMENSIONAL COM AS PROPRIEDADES BIOLGICAS DAS PROTENAS!
UM ABRAO!
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