BOLILLA 1

ENZIMAS: Naturaleza Qumica- Propiedades GeneralesNomenclatura y Clasificacion- Coenzimas y Grupos Prostticos. Actividad Enzimtica: Unidad de enzima- Actividad especficaActividad molecular. Complejo ES- Ecuacin de Michaelis Menten y Ecuacin de Lineweaver Burk- Significado e importancia de Km y KcatalticaInhibicin competitiva y no Competitiva. Factores que afectan la actividad enzimatica: [Enzima]- pH T[S] Regulacin Enzimtica: Enzimas alostricas (propiedades y cintica)- Zimgenos- Modulacin Covalente Isoenzimas: Propiedades e importancia.

ENZIMAS
Transformacin de nutrientes simples en molculas complejas y viceversa Extraccin de energa desde combustibles por oxidacin

Polimerizacin de subunidades para formar macromolculas, etc

CARACTERISTICAS DE LAS ENZIMAS

PROTEINAS y RNA (Ribozimas): Estructura terciaria y cuaternaria SITIO DE UNION AL SUSTRATO: Uniones no Covalentes (puente de hidrgeno, hidrofbicas, electrostticas NECESITAN DE FACTORES ENZIMATICOS: Inorgnicos (metales) y orgnicos (Coenzimas) ESPECIFICIDAD DE SUSTRATO: Estereoespecificidad y especificidad geomtrica SON REGULABLES: La sntesis de la protena, su actividad y degradacin.

DISTRIBUCION DE LAS ENZIMAS

COMPARTIMENTALIZACION: Diferentes localizacin dentro de la clula. SISTEMAS MULTIENZIMATICOS: Enzimas relacionadas agrupadas formando verdaderos complejos

ENZIMAS MULTIFUNCIONALES: Una enzima que presenta distintos sitios catalticos

USOS DE ENZIMAS EN BIOTECNOLOGIA

Mutagnesis Dirigida: - Estudiar mecanismos enzimticos - Cambiar especificidades enzimticas - Aumento de tolerancia a condiciones extremas. Enzimas hbridas. Proteinas de fusin Ej. Activ.de glucanasas y celulasas microbiana, Activ.Nucleasa estafilococica

Tipos de reacciones catalizadas por enzimas

Oxido-reduccin Rotura y formacin de enlaces C-C Reorganizaciones internas Transferencia de grupos Reacciones de condensacin

Cmo se clasifican las enzimas???

Clase
Lactato 1 deshidrogenasa

subclase
1

subsubclase
1

n de orden
27

1-OXIDORREDUCTASAS
Alcohol deshidrogenasa (EC 1.1.1.1)

2. TRANSFERASAS

Hexoquinasa (EC 2.7.1.2)

3. HIDROLASAS
Carboxipeptidasa A (EC 3.4.17.1)

4. LIASAS
Piruvato descarboxilasa (EC 4.1.1.1)

5. ISOMERASAS
Fumarasa malato isomerasa (EC 5.2.1.1)

6. LIGASAS
Piruvato carboxilasa
(EC 6.4.1.1)

VITAMINAS-COENZIMAS
Niacina NAD, NADP Ion Hidruro (:H -)

PDH GAD SDH PDH, TC Tiolasa

Ser-Treon. Deshidrat.

Riboflavina (Vit.B2) Tiamina (Vit. B1)

FAD, FMN PP-tiamina

Coenzima A

Electrones Aldehdos
Grupos acilo Grupos monocarbonados

Acido pantotnico

Acido flico

TH4 P-piridoxal

Piridoxina (B6)

Transferencia grupos aminos Electrones y grupos acilos.

GPT
AAC-DESC

Acido lipoico

Lipoamida

PDH

Ejemplos de Enzimas que requieren iones metlicos como cofactores

Citocromo oxidasa Catalasa Fe++ Fe+++

Peroxidasa
Anhidrasa carbnica Hexoquinasa Glucosa-6-fosfatasa Piruvato quinasa Piruvato quinasa K+ Mg++ Zn++

ACTIVIDAD ENZIMATICA
Unidades Internacionales Cantidad de enzima que cataliza la transformacin de 1 umol de S por minuto
1 katal = 6 x 107 U.I.E.
mmol de S transformados min

U.I.E. =

Actividad Especfica Actividad enzimtica por cada miligramo de protena U.I.E. presente en la muestra Actividad especfica =
mgr de protena

Actividad Molecular Numero de Recambio Molculas de S convertibles en P por unidad de tiempo y por molcula de enzima mmol de S transformados/min
Actividad molecular =

Mol de enzima

ACTIVIDAD ESPECIFICA

Prot.Tot:

+ +

Prot.Tot:

Prot.Tot:

+
D

Actividad = especfica

U.I.E. =

Activ. Enzimtica

mgr de protena

Prot. totales

Prot.Tot:

Como funcionan las enzimas??

Modelo llave-cerradura
Sitio activo

Modelo inducido
Sitio activo

Estado de transicin (ES)

Ejemplo: REACCION CATALIZADA POR LA HEXOQUINASA

D-Glucosa

Factores que afectan la actividad enzimtica

Concentracin de Sustrato Concentracin de Enzima pH Temperatura

EFECTO DE LA CONCENTRACION DE SUSTRATO SOBRE LA VELOCIDAD INICIAL

Velocidad inicial (vo)

[S]

Efecto de la concentracin de enzima sobre la actividad

v

[E] Concentracin saturante de sustrato, pH y temp. constantes

Influencia del pH sobre la actividad enzimtica

Actividad enzimtica

pH

Ejemplos de enzimas con diferentes pH ptimo

Influencia de la Temperatura sobre la actividad enzimtica

Actividad enzimtica

T. ptima

T(C)

ISOENZIMAS
Diferentes formas moleculares de una
misma enzima. Son sintetizadas por genes diferentes

Tienen diferente composicin aminoacdica

por lo que pueden separarse por electroforesis.

Catalizan la misma reaccin, actuando sobre

el mismo sustrato para dar el mismo producto

Dos isoenzimas presentan en general diferentes valores de Km y Vmx. Se encuentran ubicadas en diferentes compartimentos de la clula en diferentes tejidos. Son utilizadas en clnica para determinar el origen del tejido daado

Lactato deshidrogenasa (LDH)

Presenta 5 isoenzimas con distinta composicin en cuanto a sus subunidades y c/u es especfica de un tejido. H4 H3M H2M2 HM3 M4

M > Msculo H > Corazn

Ejemplo de isoenzima: Glucoquinasa y hexoquinasa

Actividad enzimtica

Glucoquinasa

Hexoquinasa

Km. hexq

Km. glucq

[glucosa mmol/l

Energa de activacin de una Reaccin catalizada y una reaccin no catalizada

REACCION NO CATALIZADA

REACCION CATALIZADA

Diagrama de coordenadas de una reaccin enzimtica catalizada y sin catalizar

Energa Libre (G) Estado de transicin

(*)
G* reaccin no catalizada

(*)
DG* cat

ES

EP

P
Progreso de la reaccin

Relacin entre velocidad y concentracin de sustrato

E + S

k1 k-1

ES

k2

E + P

v o= k2[ES] [S] >>> [E]

[E]t = [E] + [ES]

Concentracin saturante de sustrato

Medida de velocidad inicial

Paso limitante: Descomposicin de ES

k1

k2

E + S
k-1

ES

E + P

V. de Formacin de ES = k1 ( [Et ] [ ES ] ) [S]

V. de Descomp.de ES = k-1 [ ES ] + k2 [ ES ]

ESTADO ESTACIONARIO
k1 ( [Et ] [ ES ] ) [S] v o= k2[ES] Km = (k-1 + k2)/k1 Vmx = k2 [Et] = k-1 [ ES ] + k2 [ ES ]

Representacin de la ecuacin de Michaelis - Menten

Vo

[S]

SIGNIFICADO DE Km
k1
E + S k-1 ES

k2

E + P Km = (k-1 + k2)/k1

k2<<< k-1

Km = k-1 /k1

Km =Ks

Km se considera una medida de la afinidad de la enzima por el sustrato

SIGNIFICADO DE Vmx
E + S k1 k-1 ES k2 E + P

E + S

k1 k-1

ES

k2
k-2

EP

k3

Vmx = k2 [Et]

[Et] = [E] + [ES]

No siempre el paso limitante de la velocidad est dado por k2

Vmx = k3 [Et]
Vmx = kcat [Et]

kcat

Constante de velocidad del paso limitante

Nmero de recambio (t-1)

Eficiencia cataltica de una enzima

Vmx = kcat [Et]

CUANDO [S] <<<< Km La velocidad depende de la concentracin de enzima total y de la concentracin de sustrato
kcat/Km es una constante de velocidad y es el mejor parmetro para conocer la eficiencia cataltica de una enzima

GRFICA DOBLE RECPROCA O DE LINEWEAVER-BURK

Ordenada al origen = 1/Vmx.

Pendiente= Km/Vmx

Interseccin c/eje x = - 1/Km

INHIBICION ENZIMATICA
COMPETITIVA

INHIBICION REVERSIBLE

NO COMPETITIVA ACOMPETITIVA

POR ENLACE COVALENTE

INHIBICION IRREVERSIBLE

DIFP Penicilina

Quimotripsina Transpeptidasa

(Anlogos del estado de transicin) INHIBIDOR SUICIDA Alopurinol Xantina oxidasa

INHIBICION REVERSIBLE
INHIBICION COMPETITIVA E + S
+ I

ES

E + P

E
EI Ki = [E] [I] [EI]

KM ap = Km(1 + [I]/Ki)

Ejemplo de Inhibidor competitivo

Succinato + FADH2
Succinato deshidrogenasa

Fumarato + FAD+

COO(CH2)2 COOSuccinato

COOCH2

COOMalonato

Grfica de M-M

Km

Km ap

[S]

1/v Grfica de L-B

-1/Km

-1/Kmap

1/[S]

INHIBICION NO COMPETITIVA

E + S
+
I

ES
+
I

E + P

I
E
ESI

EI + S

E I

Grfica de M-M

Km 1/v

[S]

Grfica de L-B
Vmax.s/I Vmx ap.= Km(1 + [I]/Ki)

-1/Km

1/[S]

INHIBICION ACOMPETITIVA
E + S ES
+ I

E + P

E E

ESI

Inhibicin acompetitiva
1/ Vmx
C/ Inhibidor

1/Vmax. Inh.

S/ Inhibidor

1/Vmax. s/Inh.

-1/Km c/inh
-1/Km s/inh

1/[S]

Caractersticas de los diferentes tipos de inhibicin reversible

Tipo de inhibicin El Inhibidor se une a
E

Efecto s/Vmx
Ninguno

Efecto s/Km
Aumenta

Competitiva No competitiva Acompetitiva

Kma c/I. = Km s/Inh. (1+ [I]/Ki) E y ES Disminuye Ninguno

Vmx c/I= Vmx. s/Inh. / 1 + [I]/ Ki ES Disminuye Disminuye

Accin de inhibidores a distinta concentracin

COMPETITIVA

NO COMPETITIVA

Pendiente = Km / Vmx

INHIBICION IRREVERSIBLE
. Por unin covalente del inhibidor

- Acetilcolinesterasa - Quimotripsina

Enzima inactivada

Diisopropilfluorfosfato (DFP)

INHIBICION IRREVERSIBLE
. Inhibidor suicida

Se une al sitio activo de la enzima y sta cataliza la modificacin del inhibidor a otro compuesto que permanece unido a la enzima.

El ALOPURINOL es un inhibidor suicida que acta sobre la enzima xantina oxidasa (degradacin de purinas). Se forma el oxopurinol el cual queda unido a la enzima.

REGULACION DE LAS REACCIONES CATALIZADAS POR ENZIMAS

REGULACION DE LA ACTIVIDAD DE LAS ENZIMAS

ENZIMAS ALOSTERICAS

REGULACION COVALENTE

REGULACION POR PROTEINAS

REGULACION POR PROTEOLISIS

REGULACION DE LA SINTESIS DE LAS ENZIMAS

ENZIMAS INDUCIBLES

ENZIMAS ALOSTERICAS
Enzima 1 Enzima 2 Enzima 3 Enzima 4

Enzima 1

ENZIMA ALOSTERICA

MODULADORES POSITIVOS

MODULADORES NEGATIVOS

Bifurcacin de una va metabolica

PROPIEDADES DE LAS ENZIMAS ALOSTERICAS

Poseen un sitio de unin a un metabolito regulador (sitio alostrico) La unin del metabolito a la enzima es de carcter reversible y no covalente. Son homotrpicas o heterotrpicas. En general poseen dos o mas sitios reguladores. La mayora posee dos o mas cadenas polipeptdicas o subunidades. En general tienen un comportamiento cintico sigmoideo

CINETICA DE UNA ENZIMA ALOSTERICA Curva Sigmoidea

Regulacin de la actividad de la Aspartato transcarbamilasa (ATCasa)

v

Aspartato (mM)

EJEMPLOS DE ENZIMAS ALOSTERICAS

Hexoquinasa, Fosfofructoquinasa y Piruvato Quinasa Va glicoltica AcetilCoA carboxilasa Aspartato Transcarbamilasa Biosntesis de lpidos

Biosntesis de nucle tidos pirimidnicos Glutamato Deshidrogenasa Degradacin de aminocidos Citrato sintasa, isocitrato y a-cetoglutarato deshidrogenasas Ciclo de Krebs

ASPARTATO TRANSCARBAMILASA (ATCasa)

Dominio aspartato

Dominio Zinc

Dominio alostrico
Dominio carbamil fosfato

REGULACION POR MODIFICACION COVALENTE

Enzima Enzima Enzima

Enzima

Fosforilacion
Enzima Enzima

Fosfoadenilacion

ADP-Ribosilacin

Ejemplo de regulacin covalente

HO-CH2 CH2- HO (Cadena lateral de Ser)

Fosforilasa b
(menos activa)

Fosforilasa quinasa

ATP ADP

2 Pi

Fosforilasa fosfatasa

2 H2O

P -O-CH2

CH2- O- P

Fosforilasa a

REGULACION POR PROTEOLISIS

Por eliminacin de una cadena peptdica, enzimas inactivas se convierten en enzimas activas y viceversa.

ZIMOGENOS
Las enzimas digestivas: pepsingeno y quimotripsingeno se convierten en las enzimas activas pepsina y tripsina. Suele ocurrir una activacin secuencial producindose una cascada de activaciones. Ej. Coagulacin sangunea.

REGULACION POR PROTEINAS

Modifican la actividad de enzimas involucradas en el metabolismo celular. Por ej. Indirectamente activando o inhibiendo la actividad de la glutamina sintetasa. RNA polimerasa: Asn, Gln, Glu, Lys y Arg forman enlaces hidrgenos con las bases del DNA