Produo de Glucose Oxidase

Glucose Oxidase
Fontes: Aspergillus niger (principal); Penicillium notatum; Penicillium glaucum; Penicillium amagasakiense; Penicillium purpurogenum Obtida, essencialmente, como um produto ou co-produto da produo de gluconato

Glucose Oxidase
Catalisa a reao:

Fig. 1. Representation of the GOD reaction (Witt et al., 2000)

Glucose Oxidase
produzida tanto no meio intracelular quanto no meio extracelular, e ambas contribuem para a produo de cido glucnico.

Glucose Oxidase
Enzima de grande interesse e importncia para as indstrias alimentcias, farmacuticas e em pesquisas cientficas.

utilizada em anlises clnicas como principal reagente para a determinao dos nveis de glicose sangunea devido ao seu custo relativamente baixo e a sua boa estabilidade.

Glucose Oxidase
Na indstria alimentcia, a GOD empregada como antioxidante evitando alteraes de cor e sabor dos alimentos devido presena de O2. Tem sido usada, satisfatoriamente, para remover resduos de glicose e oxignio em alimentos, com o objetivo de aumentar a sua vida de prateleira.

Glucose Oxidase
Na indstria de vinho, seu papel diminuir o teor alcolico, pois capaz de remover um pouco da glicose, a qual posteriormente seria convertida em lcool. Estudos mostram que vinhos tratados com glicose oxidase tm um teor alcolico 2% menor. Alm disso, essa enzima possui efeito bactericida, sendo assim, a necessidade de conservantes menor.

Glucose Oxidase
Pode ser usada como anti-microbiano em produtos de higiene oral. A cavidade oral abriga vrias espcies de estreptococos, como o Streptococcus mutans, que um importante contribuinte para a crie dentria. O H2O2 produzido pela glicose oxidase age como um til bactericida.

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1. Escolha do microorganismo: Aspergillus niger 2. Preparo dos meios: Meio de Ativao Meio inclinado de PDA (gar Batata Dextrose) - Infuso de 20 g de batata - Dextrose ou Glucose - gar - gua destilada

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Meio de Esporulao de Moyer et al. - Infuso de 20 g de batata - Dextrose ou Glucose - gar - gua destilada

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Meio de Germinao de Moyer et al. Meio de Propagao - gua de milho ou Peptona - Glucose - MgSO4 - KH2PO4 - (NH4)2HPO4 - Uria - CaCO3 - Cerveja - gua destilada

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Meio de Fermentao de Moyer et al. (pH 6,0) - Glucose - CaCO3 - Borato de sdio - MgSO4 - KH2PO4 - (NH4)2HPO4 - Uria - Peptona

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3. Preparo do Inculo: Ativao do Aspergillus niger em meio inclinado de PDA esterilizado. Incubou-se a 28o C por 72 horas; Inoculou-se o Aspergillus niger ativado no meio de esporulao de Moyer (frasco de Roux) e incubou-se a 25 - 30oC por 5 a 7 dias;

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Preparo da suspenso de esporos: foi adicionado assepticamente ao frasco de Roux contendo os esporos, 20 ml de gua deionizada estril para ressuspender os esporos; Filtrar em funil de vidro com gaze adaptado a um Erlenmeyer, na capela e utilizando apenas materiais estreis;

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Realizou-se a contagem de esporos/mL de filtrado em cmara de Neubauer;
- Contagem de clulas em grande nmero

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Determinou-se o volume da suspenso de esporos a ser inoculado no meio de Moyer et al. para germinao:

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O volume anteriormente calculado foi inoculado no meio de germinao de Moyer et al., e incubados sob agitao (200 r.p.m.) por 48 horas; Transferiu-se a cultura para um frasco de 2 litros contendo 500 ml do meio, mantendo as condies de aerao e agitao at o dia seguinte;

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Repetiu-se a operao at obteno de volume de inculo suficiente para a produo em biorreator. 4. Produo em Biorreator: O biorreator, os equipamentos auxiliares e os materiais necessrios foram devidamente preparados e esterilizados

Manmetro Tacmetro Eletrodo + pHmetro Bomba peristltica Manta eltrica Coletor de amostra

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O meio de fermentao de Moyer et al. foi adicionado ao biorreator e inoculado com o Aspergillus niger obtido na propagao com cerca de 10% do volume a ser trabalhado;

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Temperatura de 30oC Agitao de 200 r.p.m Aerao pH inicial CaCO3 a 30% Soluo de Borato de sdio v.v.m. :

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5. Amostragem: Coleta de 50 mL de amostra Aps homogeneizao: Tempo zero Intervalos de tempo ( 6 horas) 4 dias

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Amostragem: As amostras coletadas eram identificadas (GO0 GO17) e registrados o pH, temperatura, agitao e aerao correspondentes ao tempo da coleta;

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Amostragem:
Filtrou-se as amostras atravs de gaze. O filtrado (enzima extracelular) era coletado em frasco rotulado e identificado e armazenado em congelador;
Os miclios retidos foram lavados, retirou-se o excesso de gua e transferiu-se para papel alumnio contendo folha de PVC onde foram embalados e levados para o congelador;

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6. Anlise das amostras:
O peso seco e a acidez total (cido glucnico) foram determinados na produo de gluconato; De cada amostra coletada, determinou-se a [acar redutor], a atividade da enzima intracelular e extracelular e, o teor de protenas;
A partir das anlises, calculou-se as atividades enzimticas

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Trmino da produo: Tempo 105 (horas)

Volume final no biorreator: 8,9 L

 [Grfico peso seco]

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A recuperao de enzimas ocorre atravs das etapas de extrao e purificao Na extrao da enzima intracelular, usouse areia (2x o peso micelial) para romper os miclios (mtodo de cisalhamento) . Adicionou-se um tampo (6x o peso micelial) e triturou-se at obteno de um material lquido;

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Transeriu-se o material lquido para um tubo de centrfuga e centrifugou-se por 5 minutos a 1000 r.p.m.; O sobrenadante foi transferido para um tubo de hemlise = EXTRATO BRUTO.

Purificao de Enzimas

Purificao de Enzimas

Purificao de Enzimas
A pureza da enzima determinada atravs de eletroforese de protenas Consiste na aplicao de um campo eltrico numa matriz slida (gel de poliacrilamida) e baseia-se na migrao das molculas em relao a um campo eltrico, devido sua carga.

Purificao de Enzimas
O gel funciona como uma peneira molecular, permitindo a separao das macromolculas por peso molecular

Biochemical Engineering Journal 40 (2008) 5463

Joint effect of nitrogen and phosphorous on glucose oxidase production by Aspergillus niger: Discussion of an experimental design with a risk of co-linearity
J. Mirn, J.A. Vazquez, Ma.P. Gonzlez, M.A. Murado

Materiais e Mtodos
Aspergillus niger CBS 554-65 Cada unidade do experimento foi inoculada em uma soluo de esporos at a concentrao requerida pra se obter uma populao inicial de 0,5 x 106 esporos/ml Temperatura: 30C Agitao: 200rpm

Materiais e Mtodos
Componentes bsicos do meio: - Glicose (120g/l) - Carbonato de clcio (22,3g/l) - Sulfato de Magnsio hepta-hidratado (0,1g/l) Como fontes de nitrognio foram usados: - Nitrato de Clcio - Peptona Como fonte de fsforo: - Bifosfato de Potssio

Materiais e Mtodos
As concentraes de nitrognio e fsforo foram realizadas da seguinte maneira: - Cominao de nveis iniciais de nitrognio de 350. 650, 950 e 1259 mg/l com 30, 80, 130 e 180mg/l de fsforo - Concentrao de 800 e 150mg/l de N e P, respectivamente

Resultados e Discusso
Resultado expresso em N2P e NP2 (parecem mais realsticos) R2 ajustado = 1 - (ESS X T/ TSS X E)

Resultados e Discusso

Concluso
A produo de Glicose Oxidase dependente da origem da fora de nitrognio; Fontes de nitrognio inorgnico melhoram a produo de glicose oxidase, em relao a nitrognio orgnico;

Concluso
Na presena de nitrognio orgnico, pouca varincia de resultado observado com o aumento na concentrao de fsforo; Na presena de nitrognio inorgnico, a produo de glicose optimizada quando h um aumento na concentrao de fsforo.