MUTACIN Y AGENTES MUTAGENICOS

El DNA

* Cada molcula de DNA esta compuesta por una secuencia de nucleotidos ligados uno atrs del otro.
Nucleotdo

* Cada nucleotido consiste de 3 partes: grupo fosfato,

una desoxirribosa (azcar) y

una base nitrogenada.

fosfato

base

azcar

Estos nucleotidos pueden ser de 4 tipos:

timina

adenina

citosina

guanina
Purinas

Pirimidinas

En cada hebra simple de DNA, el grupo fosfato de un nucleotido se liga al azcar del otro nucleotido formando una cinta contnua.

- Las 2 cintas de nucleotidos se enrollan entre si formando una doble-hlice.

- Ellas estn unidas por puentes de hidrogeno (que mantienen la estructura estable) entre las bases complementarias (A-T) y (C-G).

- Cada cromosoma est formado por ua molcula doble-cinta de DNA.

El DNA de un organismo no es una molcula esttica. transcripcion replicacin = exposicin de las bases Modificaciones en estructura o composicin qumica

Cuando esas modificaciones no son corregidas por el Sistema de Reparacin de DNA, los errores se fijan permanentes y son llamados MUTACIONES

Dos clases de mutaciones, segun el tipo de clula en que ocurren y sus efectos:

mutaciones somticas

mutaciones germinativas

Mutacin Mutacin gnica el alelo de un gen muta, volviendose un alelo diferente Ellas pueden envolver substitucin, adicin o perdida de una nica base Mutacin cromosmica las modificaciones son mayores, alterando los cromosomas mutaciones estructurales mutaciones numricas

modifican la alteran el nmero estructura de los de cromosomas cromosomas

MUTACIONES GNICAS

1) sustitucin

2) delecin

3) insercin

MUTACIONES CROMOSMICAS

Una mutacin cromosmica es un proceso de cambio que resulta en alteraciones

Estructurales

Numricas

partes rearregladas del cromosoma

nmeros anormales de cromosomas individuales

nmeros anormales de conjuntos cromosmicos

Muchas mutaciones cromosmicas llevan a anomalas de funcionamiento de la clula y del organismo.

pueden resultar en nmero o posicin anormal de genes

si una mutacin cromosmica implica quiebre de cromosomas, el quiebre puede ocurrer en el medio de un gen, perturbando asi su funcionamiento.

Todos los organismos sufren un cierto nmero de mutaciones como resultado de funciones celulares normales o interacciones con el medio ambiente.
MUTACIONES ESPONTANEAS La tasa en que ocurren = NIVEL BASAL

La ocurrencia de las mutaciones puede aumentar con la presencia de determinados compuestos = Agentes mutagnicos
MUTACIONES INDUCIDAS El efecto de un agente mutagnico es medido por el grado en que eleva la tasa de mutacin encima del nivel basal

Son clasificados 4 principales grupos de mutgenos qumicos, con base en sus reacciones con el DNA: 1- Agentes alquilantes interactan con los centros nucleoflicos del DNA, adicionando grupos alquilo. Pueden producir apareamentos errados, llevando a transiciones

2- Anlogos de base son molculas cuya estructura es muy parecida a la de una base estructural y que a veces son incorporadas en el DNA en su lugar, aunque tienen propiedades de apareamiento diferentes. Pueden llevar a una mutacin por sustitucin de base 5-Bromouracil: Anlogo de la timina Normal- pareja con la adenina Ionizado- pareja con la guanina 2-aminopurina (2-AP): anlogo de base de la adenina Normal- pareja con la timina Protonada- pareja con la citosina

3- Agentes desaminantes reaccionan con las bases que poseen grupo amino (adenina, guanina y citosina), causando desaminacin. Provocan transiciones CG TA, en ambas direcciones

4- Agentes intercalantes son compuestos que se intercalan en el DNA, entre las bases nitrogenadas. Pueden causar inserciones o deleciones Pueden intercalar en cinta simple

Puente intracadena

Puente intercadenas

Monoadicin

Mutgenos qumicos

Componentes de alimentos
Ej. - derivadas de plantas; - De los 5000 a 10000 pesticidas naturales, 63 han sido estudiados, y de estos, 35 producen cncer en roedores - El cocimiento de comida frecuentemente produce material quemado, algunos de los que tambien pueden ser carcinognicos para roedores - El caf contiene cerca de 1000 qumicos diferentes y de los 28 estudiados, 19 son carcinognicos para roedores

- aflatoxina B1 causa cancer de hgado en humanos

Formacin de stios apricos lleva a mutaciones

 Drogas terapeuticas - previenen la divisin celular, siendo la fase de replicacin del DNA su principal meta.
Ej. - Mitomicina C usada en el tratamiento de carcinomas gastrontestinales y cancer de vejiga: causa cruce ligado en el DNA - Mostaza nitrogenada: agente alquilante antineoplsico - Bleomicina usada en el carcinoma testicular, canceres de cabeza y cuello: causa remocin de bases y quiebres en el DNA - Inibidores de topoisomerasas: Las drogas pueden inhibir la actividad de las topoisomerasas, dejando hebras de DNA quebradas, con eventual muerte de las clulas afectadas

Mutgenos fsicos Radiaciones ionizantes Utilizados para diagnstico mdico porque penetran en tejidos vivos por considerable distancia.

causa el quiebre de las uniones azcar-fosfato del DNA, lo que puede llevar a aberraciones cromosmicas estructurales.

Muchos tipos diferentes de oxigeno reactivos son producidos

Radiaciones Ionizantes por Terapia Anticancer Aumenta la frecuencia de quiebres cromosmicos Letalidad en clulas que estn en mitosis Las clulas tumorales estn mas frecuentemente en mitosis en relacin a los tejidos normales

mas frecuentemente mueren las clulas tumorales

Radiacin no-ionizante

auncuando la luz ultravioleta (UV) no tenga energia suficiente para inducir ionizaciones, carga energia suficiente para causar mutaciones en la molcula.
- La UV es absorbida por muchas molculas organicas como purinas y pirimidinas en el DNA, que se vuelven mas reactivas. Formacin de un fotodmero de ciclobutano Interfieren en el apareamento normal de bases. Genera transiciones, transversiones, corrido del marco de lectura, duplicaciones y deleciones.

Tipos de daos en el DNA

Puente DNA-protena Stio apurnico Alquilacin Intercalaciones

Formacin de radical
Adutos tipo bulky Stio apirimidnico Quiebres simples Dmeros de pirimidina

Datos de base

Quiebres dobles Puente intracatenario Puente intercatenario

Gene, 250:15-30, 2000

Gentica Toxicolgica

Agentes genotoxicos y la induccin de dao gentico

Agente genotxico Agente directo

Agente indirecto Interaccin con el DNA

Reparacin

Eficiente DNA no alterado

Ineficiente

Dao gentico
Clula somtica Clula germinativa

Mecanismo bsico de reparacin del DNA Reparacin Libre de error Sujeta a error

Eliminacin del problema Fidelidad Gentica

Fijacin de las mutaciones Dao gentico

Metabolismo de Agentes Xenobiticos

Xenobitico

Biotransformacin
Biodegradacin Bioactivacin

Nucleoflico
Daos a tejidos

Electroflico

Destoxificacin Eliminacin

Reacciones inmunolgicas

cidos Nuclicos

Biotransformacin del B[a]P

CROSBY; 1998

Hgado

Respuestas celulares a daos en el DNA

Genotoxinas Radicales libres

Inhibicin de la transcripcin

Bloqueo en la replicacin

Estabilizacin de p53 Apoptosis

parada del ciclo celular Induccin genica

* Mutaciones puntuales * Translocaciones * Recombinacin * Rearreglos en el genoma Sndromes Envejecimento y dolencias genticos degenerativas Cancer

Reparacin del DNA

Mutagnesis vs. Carcinognesis

La mayoria de los productos carcinognicos son tambin mutagnicos; Los tumores no son el resultado de un evento gentico aislado, sino de mltiplos eventos. Diversas mutaciones pueden ocurrir en una misma clula iniciando una neoplasia. Por este motivo es necesario probar la actividad mutagnica de las nuevas drogas.

Carcinognesis Productos o procesos que influyen en la iniciacin, promocin o expansin de un tumor (neoplasia). Neoplasia crecimiento nuevo y fuera de control de clulas del propio organismo.

La falla en el sistema de control gentico, no necesariamente es mutacin.

Mas Por presentar una actividad similar en cuanto a dosis y capacidad de inducir neoplasia se puede inferir que un producto mutagnico es potencialmente carcinognico.

Ejemplo resumido del proceso de carcinogenesis Carcingeno directo Pr mutgeno metabolito reactivo Latencia

Clula normal
Activacin Iniciacin

Clula iniciada
Clula promovida Clula tumoral

Promo cin

Cocarcingeno
Proliferacin celular autonoma

Progreso

Neoplasia Invasin de otros tejidos Metstasis

Una lesin que parece mala a corto plazo no siempre es la peor a largo plazo.

Por este motivo es que la evaluacin de bajas dosis es tan importante.

Importancia del estudio de la mutagnesis Mutacin: si no mata a la clula, ella puede proliferar en el cuerpo en crecimiento (mutacin somtica) o ser transmitida a las prximas generaciones (mutacin germinal).

Se estima que las mutaciones somticas y germinales son responsables del: 50% de las muertes fetales, 30% de los problemas de aprendizaje, 20% de los defectos congenitos, y 2% de la infertilidad masculina.

Ninguna prueba aislada es capaz de detectar todos los tipos de mutaciones inducidas.

Baterias de bioensayos genticos fueron desarrolladas para identificar los tres mayores blancos de daos genticos: Mutacin genica (mutacin gnica)
Clastognesis (aberraciones cromosomicas estructurales) Aneugnesis (aberraciones cromosomicas numricas)

Bioensayos genticos

Principales ensayos genotxicos

In vitro Ensayos para Mutaciones gnicas Salmonella typhimurium reverse mutation assay (Ames test, bacteria) Escherichia coli reverse mutation assay (bacteria) Gene mutation in mammalian cells in culture Drosophila sex-linked recessive lethal assay (fruit fly) Gene mutation in Saccharomyces cerevisiae (yeast) Mouse Spot test Pruebas para mutaciones cromosomicas y genomicas In vitro cytogenetic assay (CHO/SHE/Human lymphocyte) In vivo cytogenetic assay Micronucleus test Dominant lethal assay Heritable translocation assay Mammalian germ cell cytogenetic assay Pruebas para efectos en DNA DNA damage and repair: unscheduled DNA synthesis in vitro Mitotic recombination in Saccharomyces cerevisiae (yeast) In vitro sister chromatid exchange(SCE) assay X X X X X X In vivo

X X X X X

X X X

Bateria de pruebas de genotoxicidad (de acuerdo con el ICH*) usada en el registro de nuevas drogas:
Un test de mutacin gnica en bacteria.

Un test in vitro para evaluacin citogentica del dao cromosomal con clulas de mamfero.
Un test in vivo para dao cromosmico con clulas hematopoyeticas de roedores.

International Conference on Harmonization of technical requirements for registration of pharmaceuticals for human use. Guidance on Genotoxicity Testing and Data Interpretation for Pharmaceuticals Intended for Human Use S2(R1).

TEST DE AMES
OECD Guidelines for the Testing of Chemicals / Section 4: Health Effects. Bacterial Reverse Mutation Teste: No. 471

Esquema del funcionamiento del sistema regulatorio SOS

En las lineas de Salmonella typhimurium utilizadas en el test

Salmonella/Microsoma, la respuesta SOS es optimizada por la presencia

del plasmido pKM101, cargando los genes mucAB, alelos de umuCD de bacterias, implicados en la reparacin sujeta a error. Al

transformarse en co-proteasa, RecA, adems de desreprimir al sistema

SOS, tambin corta UmuD, generando una forma activada, UmuD, que se une con UmuC. Este complejo se une a la subunidad ede la DNA polimerasa I, permitiendo que esta realice la sntesis de la lesin, llevando por lo tanto a una mutagnesis

TEST DE MICRONCLEOS (MN)

OECD Guidelines for the Testing of Chemicals / Section 4: Health Effects. Erythrocytes Micronucleus Test: No. 474

Maduracin
Agentes Genotxicos Quiebre Fragmento cromosomico

Dao en el huso Profase Metafase

Cromosoma entero
Anafase Telofase

Clulas con MN

Tratamiento in vivo de 5 animales de cada sexo en cada dosis. Mnimo 3 dosis.

Preparacin de laminas con extendido de la medula sea de ambos fmures de cada animal.

Tres dias de tratamiento. Sacrificar en el cuarto dia

Anlisis de los microncleos en eritrocitos de medula sea.

EPC Eritrocito Policromtico. Clula mas joven, con mayor cantidad de RNA en el citoplasma y presentando coloracin roja. ENC Eritrocito Normocromtico. Clula mas antigua, que ya perdi el RNA del citoplasma y presenta coloracin naranja. Anlisis en microscopio de 500 celulas observando la proporcin de PCE y NCE Puede indicar toxicidad, cuando el nmero de clulas jovenes decae en relacin al nmero de clulas antiguas. Analisis de 1000 PCE por lamina observando la presencia de microncleos Indica una induccin de dao al DNA.

TEST DE ABERRACIONES CROMOSOMICAS (AC)

OECD Guidelines for the Testing of Chemicals / Section 4: Health Effects. In Vitro Mamm Chromosome Aberration Test: No. 473

Aplicacion desde el incio del siglo 20; Necesidad de anlisis complicada y demorada; Es el mtodo mas confiable para evaluar daos al material gentico;

Se basa en la observacin en el microscopio de la morfologia de preparaciones cromosomicas del material biolgico de interes.

Cultivo celular

70 h

Colchicina (2 h) Tratamiento hipotonico (20 min)

48 h incubacin 4 h tratamiento

Fijacin

Analisis Cromosomico

Coloracin

Anlisis de 2000 clulas por lamina evaluando el ndice Mittico. Anlisis de 200 clulas por dosis evaluando Aberraciones Cromosomicas.
AB. NUM.
ABERRACIONES CROMATDICAS ABERRACIONES CROMOSOMICAS

b Mult.

Endo Poli GAP Del. redu. ploid.

Trocas intra inter

Frag. Min. GAP Del. Dic

Trocas Tri Anel

Frag. Min.

Mas de 7 aberraciones

Aberraciones Cromosomicas en linfcitos humanos

Cromosomas normales de linfocitos humanos

Otras pruebas de genotoxicidad comumente utilizadas

ENSAYO COMETA Eletroforesis en gel en clula nica Desarrollado por Singh e cols. (1988) para detectar el dao primario al DNA Es bastante sensble, detectando quiebres simples y dobles en stios alcalinizables en las molculas de DNA;

Microeletroforesis de clulas suspendidas en una fina capa de agarosa dispuesta sobre una lamina y lisadas por detergentes en alta concentracin de sales.

Test indicativo Simple, sensble y rpido Daos en clulas individuales Pequeo nmero de clulas Puede ser realizado en cualqiuer clula nucleada

Dao y reparacin en el DNA

Muy usado en estudios de gentica toxicolgica

Despues de la eletroforesis las clulas (nucleoides) adquieren una morfologia semejante a la de un cometa; La cabeza representa el segmento de DNA intacto y la cola, fragmentos provenientes de lesiones al DNA.

25 m

Villela et al., 2006

Intercambio de cromtides Hermanas (SCE)

Una de las manifestaciones de dao al DNA son los eventos de recombinacin (crossing-over) mittica; Utilizando tcnicas apropiadas es posble identificar la composicin de las cromtides en la metafase; Cromosomas Arlequin.

Nuevas tendencias en toxicologia