FACULTAD DE MEDICINA HUMANA Y CIENCIAS DE LA SALUD ESCUELA ACADEMICO PROFESIONAL DE TECNOLOGIA MEDICA

ASIGNATURA SEMESTRE DOCENTE ALUMNOS

: : III : :

CUSCO PERU

2012

INMUNOHISTOQUIMICA:
Estudio Histopatolgico que combina la

con la INMUNOLOGA en la diferenciacin de Antgenos celulares (su presencia y localizacin micro anatmica). Rama de la Inmunologa que estudia las Sust. qumicas y Reacciones del sistema inmunitario as como la interaccin entre Antgeno (Ag) y Anticuerpo (Ac), se desarrolla diversos Mtodos (Inmunoperoxidasa).
HISTOLOGA

LA IHQ SE BASA EN LA DETECCIN Y LOCALIZACIN DE COMPONENTES CELULARES (MEMBRANA Y NUCLEO) Y TISULARES (ANTGENOS) MEDIANTE EL USO DE ANTICUERPOS. LA IHQ ES UN MTODO QUE UTILIZA ANTICUERPOS (Acs) SELECCIONADOS PARA IDENTIFICAR ANTGENOS (Ags) ESPECFICOS.

La IHQ: Comprende un grupo de tcnicas de Inmunotincin que permite demostrar una variedad Ags. presentes en las cl. o tejidos utilizando Acs. marcados. Se basa en la capacidad de los Acs. de unirse especficamente a los correspondientes Ags. Esta Rx. es visible solo si el Ac. est marcado con una sust. que absorbe o emite luz o produce coloracin.

Las tcnicas de IHQ permite la identificacin sobre muestras tisulares o citolgicas de determinantes antignicos caractersticos de distintas lneas de diferenciacin y funcionalismo celular a la aplicacin directa del Acs. Policlonales o Monoclonales sobre secciones tisulares permite la localizacin microanatoma de su expresin y su correlacin con los parmetros morfolgicos, aumentando la sensibilidad y especificidad del estudio y proporcionan informacin adicional esencial en muchos casos.

Las Pruebas o Tcnicas IHQ: Extremadamente sensibles y pueden detectar cantidades muy pequeas (ng) de una sust.; hay muchos Mtodos, Reactivos y Kitts: El Mtodo de la PeroxidaAntiperoxida y La Tcnica del Complejo Avidina-Biotina.
La IHQ juega un rol de Confirmacin Diagnostica y soporte de los datos de

informacin que poseen.

UTILIDADES :

1. DETERMINACION DE LINAJE:
(histognesis/histoatipia). A. Clasificacin neoplasia indiferenciada. B. Determinacin de origen en enfermedad metastasica de primario no clasificable.

2. SELECCIN

DE REGIMENES TERAPEUTICOS:

A. Neoplasias hormono dependientes (receptore hormonales). B. Oncoproteinas sensibles a medicamentos especficos Her2, Neu CD117.

3. AYUDA PRONOSTICA:
* Metstasis ocultas . * Resistencia quimioteraputica. * Mutaciones (p53). * Indicadores de trasformacin (cl.mioepiteliales, cl. basfilas). * Indicadores de proliferacin celular y clonal. Ki67, Antgeno nuclear de proliferacin nuclear .

4. DIAGNOSTICO EN ENFERMEDADES
INFECCIOSAS: * Virus Hepatitis, HPV, Hiv1, Herpes.* Bacterias Histoplasma. * Hongos Criptococo. * Protozoos Giardia, Amebas.

ANTGENOS Y ANTICUERPOS: Ag Ac.

*Antgeno: Sustancia fornea o partcula que al ser introducido en el cuerpo estimula una respuestas inmunolgica produciendo Acs. El Husped especializa clulas especificas que producen Acs . El Ag. es la sustancia que se trata de demostrar (IHQ). *Anticuerpos: Protenas en la sangre que reaccionan y producen defensas inmunes contras los Ags. Protenas sricas formadas en repuesta a exposicin al Ag estos reacciona especficamente con el Ac. formando complejos inmunes (invitro, invivo).

SOLUCIONES DE ANTICUERPO:

Producidos en diferentes formas: Suero animal completo , Ig. solamente, reactivo purificado de afinidad y Acs. monoclonales. Contiene solamente los Acs. especficos.
REACCIONES DEL SUSTRACTO:

Las enzimas: Catalizadores que actan sobre un sustrato para acelerar su conversin aun producto (Peroxidasa - Rx. con el perxido de hidrogeno en la presencia de un electrn donante, para formar una molcula coloreada. La canalizacin de la Rx. continua formando muchas molecular coloreadas).

REACTIVIDAD ESPECIFICA:

Los Acs. primarios y secundarios pueden unirse a elementos de los tejidos sumamente cargados (Tc) resultando en una Rx. coloreada positiva en otro sitio, el cual contiene el antgeno primario. Estos sitios pueden llenarse previamente al teido con protenas no inmunolgicas del suero de la misma especia animal del cual fue producido.

METODOS: TECNICAS PARA LA DETECCION DE Ag:

METODO DIRECTO, METODO INDIRECTO, METODO DE LA PEROXIDASA ANTIPEROXIDASA Y METODO COMPLEJO AVIDINA-BIOTINA

1.- MTODO

DIRECTO:

Ac. primario ligado ala peroxidasa al aplicarse. Al tejido reaccin con el Ag. Sustrato (producir) color que se precipita marcando el Ag localizado.

Un marcador visual (fluorescente o enzimtico), se adhiere qumicamente al Ac Primario. El Ac Primario es un Ac dirigido contra el Ag que se puede quiere demostrar. (Sust - Marcador visual)
Ac. Ag.

2.- MTODO

INDIRECTO:

El marcador visual esta unido al Ac Secundario. El tejido es expuesto previamente al Ac Primario que no es marcado y luego el Ac Secundario, el cual es dirigido contra el Ac Primario y se unir con el.
Ac. no conjugado se aplica al tejido Ac. secundario ligado a la peroxidasa se une al primario: Ac secundario debe ser especifico. Sustrato se aade para darle color a al Ag. localizado. 2

3.- METODO DE LA
PEROXIDASA-ANTIPEROXIDASA (PAP):(2)

Complejo PAP

Usa Ac. Primario, Ac Secundario y un Ac. producido en contra.Conjugando con la enzima Peroxidasa (complejo PAP). El Ac. Secundario es producido en una especie animal diferente del Ac Secundario y del complejo Peroxidasa Antiperoxidasa , y el Ac. Primario y el Complejo Peroxidasa Antiperoxidasa. El Ac. Secundario acta como puente o Ac eslabn.

Tcnica PAP

Ac. primario Ac. secundario hecho en diferentes animal que el Ac primario y el complejo
PAP.

Complejo PAP

Complejo PAP producido en animal igual que el Ac. primario (Ac secundario acta como puente y liga a los dos). Sustrato que produce color identificando al Ag. localizada.

Tcnica PAP

4.- METODO COMPLEJO AVIDINA

BIOTINA(ABC)(3): (Biotina Avidina Biotina)

Un Ac. Primario, un Ac. Secundario que es qumicamente ligado a la Biotina (vitam.), y un Complejo de Avidina (glicoprot.) que est ligado a la Biotina y Peroxidasa. La Avidina tiene la habilidad de ligarse con cuatro molculas de Biotina en forma no inmunolgica (sensibilidad = mtodo).

(Sust)
2

Tcnica Avidina - Biotina

 Ac. primario Ac. Secundario qumicamente unido con biotina. Complejo de avidina que est unido a la peroxidasa. Sustrato que produce el color (identificacin al localizado)

(Biotina Avidina Biotina)

(Sust)
2

Ag. Tcnica Avidina - Biotina

OBJETIVOS DE LA TECNICA DE INMUNOPEROXIDASA:

Primordiales:

1.- Buscar e Identificar un Ag Especifico

en el Tejido : Desarrolla Ac. alta afinidad por el Ag. en estudio luego incubndola con el tejido - ligar qumicamente con el Ag.

2.- Hacer Visible el Complejo Ag y Ac: Marcando el sitio con molcula de tinte que son visibles con el microscopio(Cromog.)

FIJACION

La formalina tamponada al 10% (PH 7.0 - 7.6 formalina neutra estabilizada. IHQ). Recomendaciones: * Poner el tej. (biopsia) al f ijador inmediatamente despus que ha sido obtenido. El tejido debe ser fijado por un tiempo suficiente (preser, conser. Morfol.).
PREPARACIN DEL TEJIDO POR CONGELACIN:

* Congelar el tej. con nitrgeno licuado. Las secciones son cortadas a 3-6u (crio) y fijadas en el fijador recomendado. Conservar el tejido sobrante a -70C.

PROCESO DEL TEJIDO (PROCESAMIENTO):

Inclusin en parafina (adecuada). La temperatura no debe exceder los 60C durante

su procesamiento (destr. Ag y morfolo.). Usar compuestos de parafina sin impureza. Al desparafinar remover bien los vestigios de parafina y aditivos plsticos (causa teido no esptico o incompleto, enmascarar lo Ag). Para enviar al Lab. De Mayor Complejidad: Taco de parafina y una lamina con el tejido cortado.

ADHESIVOS:

El continuo manejo y los numerosos pasos envueltos especialmente cuando la digestin enzimtica es empleada, impide que las secciones del tej. adhieran a la lmina y subsecuentemente se desprenden. Por tal se usa una solucin de pegamientos = Casena. Las laminas tienen un tratamiento especial .

CONTROLES :

Evaluados durante el proceso de teido. Estos nos proveen informacin si el teido (Inmunoperoxidasa) es especifico o solamente teido de propiedades contenidas en el tejido. Lleva todo el procedimiento igual que el tejido en estudio excepto el Ac. Primario se sustituye con suero normal (ratn o conejo).

Control Positivo: Son secciones de tejidos que contienen el Ag. Supuesto, que han demostrado una fuert e Rx. Positiva y que estn teidos con e l Ac. Primario. Verifica la validez de l Ac. Y el procedimiento usado. Cada Ag. Necesita un control positivo (cada Ac. tiene afinidad por un Ag . en particular tejidos fijado adecuadamente para prevenir la destruccin de los Ag.)

LAMINAS QUE SON COLOREADAS (4)

LAMINA

SOLUCIN

RESULTADOS

Tejido del paciente Ac. primario Tejido del paciente Suero normal

? Negativo

Positivo comprobado Negativo comprobado

Ac. primario Suero normal

Positivo Negativo

Apndice = Usados como controles (cl. con afinidad con varios Ac que indican tumores de tipo linfoide, epitelial, tejido blando e histiocitos). La seleccin del control positivo: Fijacin y validez de Ag. A ser ligados con los Acs.

REACCIONES DE LOS Ag: MARCADORES DE INTERS EN TUMORES.

* FILAMENTOS INTERMEDIOS:

Filamentos citoplasmticos o intermedios ubicados en el citoplasma. Son protenas que juntos con los micro filamentos y los micro tbulos pertenecen a los compuestos estructurales de la clula (Armazn 7 a 10nm). Las mas importantes y con Aplicacin a la practica de la IHQ son:
KERATINA, VIMENTINA, DESMINA Y NEUROFILAMENTOS

KERATINA (citokeratina): Marcador de

diferenciacin epitelial (Cl. del tipo epitelial de no epitelial). Ejm. Carcinoma vs. Linfoma o sarcoma.

VIMENTINA: Protena (17KDa)

presente en todas las cl. Mesenquimatosas y muchas cel. epiteliales especializadas. Util: Dx. De neoplasias de cl. fusiformes La mayora de sarcomas son positivo.

DESMINA: Protena presente en las cl. Normales

del sist. muscular, asociado a la diferenciacin tanto del musculo esqueltico como liso. Util: Dx de neoplasia muscular, sarcoma de Ewing, Rabdomiosarcoma, Leiomiomas, leiomiosarcomas.

NEUROFILAMENTOS: Protenas con mltiples

sub unidades. Constituidos por 03 protenas. Util: Dx de tumores de cl. Redondas y pequeas, de tumores de origen neurolgico (SNC), siendo positivo para estos. Ganglioneuroma, neuroblastoma, ganglioneuroblastoma, paraganglioma, carcinoma de piel, rabdomiosarcoma.

MARCADORES DE DIFERENCIACIN NEURAL:

PROTEINA S-100, P7SNRT, CD57,

PROTENA S-100: Protena ligada al transporte del calcio (100% de solubilidad en sulfato de amonio) Compuestos por dos subunidades alfa y beta que se combinan en tres isotipos. El alfa alfa (miocardio, musculo esqueltico y neuronas). El alfa beta (melanocitos, gla, condrocitos) y el beta beta (Cl. de Langerhans y Schwann). Util: Dx. de tumores benignos o malignos de la vaina del nervio perifrico (VNP), tumores adiposos, condroides, tumores epiteliales.

P7SNTR: Receptor de crecimiento neural y se observa

en los axones neuronales, cl. Schuwann, cel. perineural fibroblastos perivasculares y mioepiteliales. til en el Dx. De tumores de partes blandas: 100% de tumores benignos de las vaina del nervio perifrico, en el 80% de los tumores malignos de la VNP y sarcomas sinoviales
CD57: Protena que se encuentra en la superficie de los

linfocitos T y cl. Natural Killer. til:Dx. De oligodentrogliomas, tumores de la VNP, sarcomas sinoviales, leiomiosarcomas. (Uso en panel de Acs).

MARCADORES DE DIFERENCIACIN MUSCULAR:

ACTINA MUSCULO LISO, ACTINA MUSCULO ESPECIFICO, MYOD1

ACTINA MUSCULO LISO: (AML) Esta actina se

encuentra como actina alfa del musculo liso. Util.Dx: Leiomiosarcoma, miofibroblastoma. Miofibroblastico: Positivo para actina musculo liso, negativo para musculo especifico y desmina.

ACTINA MUSCULO ESPECIFICA: (AME) Protena

que se encuentra como alfa actino del musculo esqueltico, liso y cardiaco. til: Dx. de los tumores rabdomiosarcomas y leiomiosarcomas (Ac. monoclonal = positivo).
MYO D1: Factor de transcripcin miogenico y la

protena de la diferenciacin del musculo esqueltico (miogenoma). Util: Dx. Rbdomiosarcoma.

* MARCADORES DE DIFERENCIACION ENDOTELIAL:

FACTOR VIII, CD34, CD31,

FACTOR VIII: Protena utilizado en las cl.

endoteliales y megacariocitos (Especif.) Util: Dx. Tumores benignos o bordelineo

(tumores vasculares menos diferenciados = negativo)

CD 34: Ag. de las cel. progenitoras

hematopoyticas (linfoides, Mieloides y endoteliales. Tumores de partes blandas = diferenciacin vascular, angiosarcomas). Util: Dx. leiosarcomas, sarcomas epitelioides, dermatofibrosarcomas, lipomas fusiformes y tumores fibrosos solitarios.

CD31: Glicoprotena de adhesin endotelial y plaquetaria. Util: Dx. De los angiosarcomas, hemangiomas y hemangioendoteliomas (positivo 100%).

MARCADORES DE DIFERENCIACIN

FIBROHISTIOCITICA:

CD68: Glicoprotena (lisosomas de los

monocitos, macrfagos y en los grnulos primarios de los neutrofilos). Util: Dx. fibrohistiocitomas.

LINAJE ANTGENOS RESTRINGIDOS:

CEA, PSA, HMB45 , CROMOGRANINA, LCA

Ag. limitados que pueden distinguir un tipo de cl. determinadas (Tej. altamente especifico). CEA: Antgeno Carcino Embrionario Marcador = Adenocarcinoma derivado del sist. gastrointestinal y pulmn. PSA: Antgeno Especifico de Prstata. Neoplasia de prstata.

HMB-45: Protena, marcador celular de cl.

De melanoma maligno.
CROMOGRANINA:

Lesin de origen

neuroendocrino.
LCA: Ag. comn para linfocitos.

Util: Dx. linfoma no Hodgkinde cl. grandes, tumores diferenciados de origen epitelial y mesenquiomatoso.

EJEMPLOS DE MARCADORES INMUNOHISTOQUIMICOS

ANTICUERPO CELULAS/ANTIGENOS DETECTADOS

CDla CD4 CD8 CD30

Clula de Langerhans Linfocito T de auxilio Linfocito T citotxico Clula de Reed-Sternberg

CD45
CD68 S100 HMB-45 AE1

Leucocitos
Macrfagos Clulas de Schwann Melanocitos Citoqueratinas de bajo peso molecular

AE3

Citoqueratinas de alto peso molecular Clulas musculares Gla Antgeno carcino-embrionario Alfa-fetoprotena Receptores nucleares de estrgenos Sarcomas

DESMINA GFAP CEA AFP

REN VIM

TUMORES:

Sarcoma sinovial - Epitelioide : Keratina T. De la vaina del nervio perifrico : S-100 NGFR
CD57

Tumores musculares

: Desmina , AME,
AML MyoD1

Tumores endoteliales : CD31 CD34 FVIII. Tumores epiteliales y epiteliodes : Keratina AE1,
AE3.

Tumores fibrohistiociticos Tumores Vasculares

: CD68, CD34. : CD31, CD34,

FVIII

ABORDAJE DIAGNSTICO Filamentos Intermedios (citoesqueleto) 1. Citokeratina 2. Vimentina 3. Desmina 4. Neurofilamentos 5. Protena Glial Fibrilar Acida (GFAP) EXPRESIONES Citokeratina: Carcinomas, Vimentina: Sarcomas Desmina: Rabdomiosarcomas Neurofilamentos / GFAP: Gliomas Otras: S-100: Diferenciacin Neural, Clulas de Langerhans, Melanomas. CD45 (Antgeno Leucocitario comn): Linfomas

CARCINONA DE MAMA:

Receptores de estrgenos y progesterona (IHQ). Oncogen HER-2/ney (c-erbB-2). Sobreescripcion.

(IHQ) y amplificacin (FISH) Gen supresos P53 (IHQ, RT-PCR, secuenciacin). LOH cr 17 . Actividad proliferativa. Ki-67 (IHQ). P27 (IHQ) Ciclina D1 (IHQ) Bcl-2 (IHQ)
RGFR (IHQ, FISH)

Ganglio centinela. Estudio inmunohistoqumico.

CARCINOMA DE COLON:
LOH cr. 18.

Inestabilidad de microsatlites . Estudio de mutaciones de BRAF. Expresin de IHQ m de genes del DNA (MLH1, MSH-6). Gen supresor sintasa (IHQ). Timidilato sintasa (IHQ). Actividad proliferativa. Ki-67 (IHQ).

CARCINOMA DE VEJIGA URINARIA:

Gen supresor p53 (IHQ, RT PCR, secuenciacin) Actividad proliferativa. Ki-67 (IHQ) Gen del retinoblastoma.
CARCINOMA DE PRSTATA:

P27.
Actividad proliferativa. Ki-67 (IHQ).
CARCINOMA DE PULMN:
EGFR (IHQ, FISH, Secuenciacin)

Actividad proliferativa. Ki-67 (IHQ)

SUBCLASIFICACION DEL LINAJE EPITELIALES Summary of Predominant CD7/CK20 Immunophenotype of Varius Epithelial Tumors. Immunophenotype: CK7+/CK20+ Tumors: Transitonal cell carcinoma Pancreatc Carcinoma Ovaran Mucinous carcinoma Immunophenotype: CK7+/CK20-Tumors: Non-smallcell adenocaxdnoma of the lung, Broncholoalveolar carcinoma of the lung, Breast carcinoma, ductal and lobular types. Ovaran carcinoma other than mucinous tumor, Endometrial carcinoma.

Immunophenotype: CK7 /CK20+ CK7Tumors Colorectal adenocarcinoma Tumors: Immunophenotype CK7 /CK20 Immunophenotype: CK7Tumors Carcinoma Hepatocellular , Renal Cell Carcinoma, Prostatic Tumors: Hepatocellular, Adenocarcinoma, Squamous cell carcinoma of lung , Small cell lung, neuroendocrine carcinoma of lung . lung//CK20-

LINFOMAS / LEUCEMIAS
Lymphomas Panel: CD45 ( common Leukocyte antigen antigen)

CD20 (B cell cell, L26)

CD23 (B cell cell) CD75 ( follicular center B cells cells, LN1) CD74 (B cell and histiocytes histiocytes, LN2) CD45RA (B cell cell, MB1) MB2 (B cell cell) BCL BCL-2 oncoprotein BLA BLA-36 ( activated B cell cell) light chainlight chain light chain light Heavy chains (A, M, G, D) CD5 (T cell cell, UCHL , UCHL-1) CD3 (pan T) CD43 (T cell cell, MT1, , Leu 22, L60) CD8 (T T-cell subset/ suppressor ) CD68 ( macrophages ) Lysozyme (histiotytes ) CD15 ( Leu M1) CD11 C(hairy cells cells, , Leu MS)

HODGKIRTS PANEL CD15 (Leu MI) CD30/BER H2 (Reed-Sternberg ceUs, Ki-1 L-26 (Reed-Sternberg cels, CD20) BLA-36 (ReedSternberg cells, B cells)
BONE MARROW AND LEUKEMIA PANEL Granulocyte antigen (BM1) Lysozyme Myeloperoxidase CD45 (common leukocyte antigen) Hemoglobin A Hemoglobin F

MATERIALES EQUIPOS

MATERIALES (SUSTRATO):

1. Se utiliza tejido viable Antignicamente fijado en formol u otro y procesado en parafina. 2. Productos de citolgica. 3. Tejido congelado. Antigenicamente .

EQUIPO:

Cuchillas descartables.
Procesador de tejidos (+ bao de o parafina) Incubadora. Cmaras de humedad. Cmara de flujo laminar o termorregulacin.

Equipo Automatizado.

MATERIALES:

Reactivos: Solucin de rescate antignico. Enzimas proteolticas (predigestin proteasa) Buffer. Controles negativos y positivos. Anticuerpos: Goteros , liofilizados o Kitts. Concentracin (dilucin). Especifidad y sensibilidad.

FACTORES IMPORTANTES:

1.

Adecuado

procesamiento

del

tejido

(UNIVERSAL).

* Formol Bufferado * No subfijacin ni sobre fijacin (no <24 Hrs. Ni > 72 Hrs.) * Buena inclusin en parafina. * Cortes adecuados( 3u). * Seleccionar la zona sospechosa con un lpiz marcador.

2. Adecuada interpretacin de microscopa en

contexto clnico. 3. Seleccin correcta de Paneles de Anticuerpos. 4. Adecuado manejo de reactivos (Ac. diluyentes) y del mtodo. 5. Correcta Interpretacin de Resultados. Se reporta en cruces(+). Marcador de Membrana o Nucleares. 6. Apoyo y respaldo financiero necesario y acadmico que permitan mantener la tcnica vigente.

RESULTADOS: Ncleos = violeta azul, sustancias antihiginicas = caf.

LABORATORIO DE INMUNOHISTOQUIMICA

MAQUINA DE IPX