APLICACIN DE LA GENETICA

bioqumica

I.- APLICACIN EN BIOTECNOLOGA

Biotecnologa. Es la utilizacin de clulas y componentes de clulas, microbianas, vegetales y animales en cultivo para la fabricacin de sustancias especficas. Ingeniera Gentica, rama que se concentra en el estudio del ADN, para su manipulacin La constitucin gentica de los individuos se denomina genotipo Los rasgos observables o medibles de un individuo se denominan fenotipo. El fenotipo es consecuencia del genotipo. La Ingeniera gentica busca cambiar el fenotipo manipulando del genotipo.

II.- HERRAMIENTAS DE MANIPULACION

Mutaciones Ingeniera gentica. Fusin de protoplastos ADN- recombinante. Permiten la propagacin de secuencias de DNA de cualquier organismo mediante su insercin en molculas de DNA de otro origen. PCR . Tcnicas de amplificacin, que permiten la obtencin in vitro de cantidades ilimitadas de copias exactas de una secuencia de DNA

2.1.- MUTACIN
Cualquier cambio heredable en el material gentico. Las mutaciones en un gen determinado crean variantes de este gen, denominadas alelos. TIPOS: Espontneas. Debidas a procesos celulares normales Dependen de la tasa de error de la DNA polimerasa y de la eficiencia de los sistemas de reparacin Suceden con baja frecuencia Inducidas Debidas a agentes fsicos o qumicos (mutgeno) que daan las molculas de DNA La frecuencia de mutacin es funcin de la dosis de mutgeno

Tipos de mutaciones
Mutacin por sustitucin de bases: Se producen al cambiar en una posicin un par de bases por otro. Distinguimos dos tipos que se producen por diferentes mecanismos bioqumicos: Mutaciones transicionales (transicion), cuando un par de bases es sustituido por su alternativa del mismo tipo. Las dos bases pricas son adenina (A) y guanina (G), y las dos pirimdicas son citosina (C) y timina (T). La sustitucin de un par AT, por ejemplo, por un par GC, sera una transicin. Mutaciones transversionales (transversion), cuando un par de bases es sustituida por otra del otro tipo. Por ejemplo, la sustitucin del par AT por TA o por CG. Mutaciones de corrimiento estructural. Cuando se aaden o se quitan pares de nucletidos alterndose la longitud de la cadena. Si se aaden o quitan pares en un nmero que no sea mltiplo de tres (es decir si no se trata de un nmero exacto de codones), las consecuencias son especialmente graves, porque a partir de ese punto, y no slo en l, toda la informacin queda alterada. Hay dos casos: Mutacin por prdida o delecin de nucletidos: en la secuencia de nucletidos se pierde uno y la cadena se acorta en una unidad. Mutacin por insercin de nuevos nucletidos: Dentro de la secuencia del ADN se introducen nucletidos adicionales, interpuestos entre los que ya haba, alargndose correspondientemente la cadena.

Tipos de mutaciones
GATCATAGATACCATGA GATCATAGATACCATGA GATCATAGATACCATGA GATCATAGATACCATGA GATCATAAATACCATGA GATCATA ATACCATGA GATCATAATACCATGA
Sustitucin Delecin

GATCATAGATACCATGA GATCATAG ATACCATGA GATCATAGATACCATGA GATCATAGCATACCATGA

Insercin

2.1.1.- Mecanismos endgenos

1.
2. 3.

4.

Prdida de bases tipo purinas por ruptura espontnea del enlace con el azcar 5000/da/clula humana Deaminacin espontnea de citosinas y adeninas produce uracilo e hipoxantina Daos oxidativos. Molculas con oxgenos reactivos atacan los anillos de las bases nitrogenadas. (superxidos, perxidos y radicales hidroxilo) que se producen durante el metabolismo normal, el ozono y ciertas drogas pueden daar el ADN, ejemplo, la 8-oxi7,8 dihidrodesoxiguanina. Error de replicacin. La ADN polimerasa puede incorporar bases equivocadas en la replicacin. como por ejemplo el 5-bromouracilo o la 2-aminopurina, que se incorporan en el ADN que se replica en lugar de las bases correspondientes timina y adenina

Bases nitrogendas

A.- Perdida de base

Ocurre una delecin

B.- Desaminacin
La Citosina (C) por desaminacin se convierte en Uracilo (U) y el Uracilo empareja con Adenina (A) producindose transiciones: GCAT. El Uracilo (U) no forma parte del ADN, existindo un enzima llamada glucosidasa de uracilo encargada de detectar la presencia de U en el ADN y retirarlo. Al retirar el Uracilo (U) se produce una sede apirimidnica.

Efecto de deaminacin

C.- Daos oxidativos al ADN

El metabolismo aerbico produce radicales superoxido O2, perxido de hidrgeno H2O2 e hidroxilo.
Transformacin de Guanina (G) en 8-oxo-7,8dihidro-desoxiguanina que simula una Adenina (A). Esta alteracin del ADN produce transversiones: GCTA.

La Timidina se convierte en Glicol de timidina.

2.1.2.-Agentes mutagnicos exgenos

1. 2. 3. Radiaciones ionizantes: rayos gamma y rayos X causan rupturas en la doble hlice y delecin Luz UV causa formacin de dmeros de timina Qumicos ambientales como agentes alquilantes, deaminantes y otras sustancias qumicas forman derivados con las bases del ADN.

a.- Radiacin ionizante

Reacciones oxidativas. Produce iones (hidrgeno o de radicales hidroxilo (OH) ionizados). Estos radicales reaccionan con otras molculas de su misma clase para formar perxido de hidrgeno (H2O2) que puede destruir protenas y ADN. Daos cromosmicos. roturas fsicas lesiones cromosmicas que luego estimulan intercambios entre partes del mismo cromosoma o de diferentes cromosomas.

b.- Radiacin ultravioleta

La absorcin de rayos UV es principalmente en citosina y timina. La radiacin UV provoca la insercin de una molcula de agua en el doble enlace C-C. Cuando hay dos pirimidinas sucesivas en la misma hlice la luz UV hace que se produzcan puente de hidrgeno entre ambas. formando dmeros de Timina. Tales dmeros distorsionan la hlice de DNA e impiden su replicacin, como resultado la clula no se divide y puede morir.

Dimeros de timina

c.- Qumicos ambientales Agentes alquilantes

Etil metano sulfonato (EMS), metil metano sulfonato (MMS), dietil sulfato(DES) , etiletanosulfonato, mostaza nitrogenada, etc. El EMS introduce un metilo o etilo en la Guanina y produce transiciones GCAT. Etiletanosulfonato y mostaza nitrogenada, tambien adicionan grupos metilo o etilo a la Guanina, haciendo que se comporte como un anlogo de base de la Adenina.

Alquilantes
Introduccin de etilo en guanina y timina

Desaminantes
Iones bisulfito y cido nitroso. El cido nitroso transforma la Citosina (C) en Uracilo (U), el Uracilo (U) empareja con la Adenina (A) produciendo transiciones. La desaminacin de las Adenina (A) la convierte en hipoxantina (H) que empareja con la Citosina (C) produciendo transiciones. Hidroxilamina aade un grupo hidroxilo(OH) al grupo amino de la citosina, haciendo que la base sufra un cambio tautomrico.

Desaminacion

La aflatoxina B1 es un carcingeno poderoso que se une a la posicin N7 de la Guanina. La formacin de este producto da lugar a la rotura del enlace entre la base y el azucar, generando un sitio apurnico. El sistema SOS pone habitualmente en la sede apurnica una Adenina (A) dando lugar a transversiones. Es un potente carcingeno.

Reemplazo de una base en el ADN

Los anlogos de bases son compuestos qumicos que pueden remplazar a una base determinada. El 5-Bromouracilo (5BU) es anlogo de la Timina (T) y puede remplazarla. El 5BU en su forma cetnica empareja con la Adenina (A) mientras que en su forma enlica (5BU*) empareja con la Guanina (G).

bromouracilo

Remplazo de una base en el ADN

La 2-Aminopurina (2AP) es anlogo de la Adenina (A) y puede remplazarla. La 2AP aparea con la Timina (T) pero en su forma imno (2AP*) empareja con la Citosina (C). Esta alteracin produce transiciones.

Agentes intercalantes
La Proflavina, Naranja de acridina y otros Compuestos (ICR): son compuestos con estructuras planas que se meten o intercalan entre las bases nitrogenadas del ADN produciendo adiciones o deleciones de un solo par de nucletidos.

Mutgenos que producen prdida del emparejamiento especfico

Estos mutgenos daan muchas bases nitrogenadas y producen como consecuencia un bloqueo de la replicacin del ADN. La mayora de los compuestos cancergenos producen este tipo de alteraciones. Debido a la gran cantidad de alteraciones que producen en el ADN como primera medida se produce un bloqueo de la replicacin y se ponen en marcha un sistema de emergencia denominado abreviadamente SOS para reparar los daos y permitir que la clula se replique y pueda seguir viviendo. El sistema SOS consta de al menos tres genes denominados recA, umuC y umuD. Este sistema produce un relajamiento de la especificidad de apareamiento de la ADN polimerasa III de E. coli. Algunos ejemplos de esta situacin son: Benzopireno: es un producto resultante de los motores de combustin y es un potente carcingeno. Hidroxilamina (HA): produce especficamente transiciones GCAT.

Reparacion de dao al ADN

Reparacin de apareamientos incorrectos: la reparacin de apareamientos incorrectos posterior a la replicacin requiere la existencia de un sistema que sea capaz de realizar las siguientes operaciones: Reconocer las bases mal apareadas. Determinar cual de las dos bases es la incorrecta. Eliminar la base incorrecta y sintetizar. Esta reparacin la realizan los productos de los genes mutH, mutL, mutS y mutU.

Limitaciones de las mutaciones

El efecto principal de la mutagnesis es originar mutaciones aleatorias en el organismo, la mayor parte de las cuales son negativas para su supervivencia, o empeoran algunas de sus caractersticas originales. los programas de mejora suelen ser muy largos y tediosos, y a menudo no dan los resultados deseados.

2.2.- INGENIERA GENTICA

Surge en los aos 70 (siglo XX) cuando se consigue introducir material gentico de una especie en clulas de otra especie muy distinta. Tecnicas:
Fusion de protoplastos ADN recombinante (clonacion)

a.- Fusin de protoplastos

Fusin de protoplastos vegetales

Obtencin de clulas de las dos especies que se van ha hibridar. Aplicacin de una enzima (celulasa pectinasa) la cual destruye la pared celular, quedando la clula desprotegida de esa membrana, tomando el nombre de protoplastos. Se aplican pulsos elctricos a clulas en suspensin (electroporacin) o inducir la desorganizacin de las membranas empleando polietilenglicol.

Fusion

Luego ocurren las uniones de protoplastos y la mitosis de esas uniones celulares producen muchas clulas lo que origina un callo. Con ayuda de auxina y citoquinina, se estimula el desarrollo radicular y foliar y forma una plantita hbrida. Ejemplo. La hibridacin entre el tomate y la papa. Papaya con naranja.

En el campo de la Ingeniera gentica consiste en aislar y multiplicar un gen, o en general, un trozo de ADN

En Animales superiores consiste en obtener un individuo a partir de una clula o de un ncleo de otro individuo

Digestin con enzimas de restriccin

Ligacin en un vector adecuado (plsmido)

Inserto

Vector

Introduccin en el hospedador (E. coli)

El proceso de clonacin molecular persigue la propagacin de una molcula de DNA de forma estable en un hospedero distinto a aquel del que procede, mediante su insercin en un replicn del hospedero elegido.

Propagacin por divisin celular

Las herramientas de la clonacin

Enzimas para la manipulacin del DNA Enzimas de restriccin Ligasas Polimerasas Kinasas y fosfatasas Vectores de clonacin. a) un plsmido (fragmento extra de ADN bicatenario circular de unos 4,3 kb, que existe en algunas especies de bacterias). b) un csmido (similar al plsmido pero de mayor longitud, unos 40 kb). c) un virus vector ( en este caso el ADN extrao que se quiere transferir se incorpora al ADN vrico y funciona como ADN recombinante).

Tecnologa del ADN recombinante

Plsmido

Plsmidos
gen de resistencia a la ampicilina

2
Extremos cohesivos

Molcula de ADN recombinante

Plsmido

Virus

Ciclo lisognico

PCR
La reaccin en cadena de la polimerasa, PCR (Polymerase Chain Reaction), es una tcnica de biologa molecular desarrollada en 1986 por Kary Mullis, cuyo objetivo es obtener un gran nmero de copias de un fragmento de ADN particular, partiendo de un mnimo; en teora basta partir de una nica copia de ese fragmento original, o molde. Esta tcnica se fundamenta en la propiedad natural de las ADN polimerasas para replicar hebras de ADN, para lo cual emplea ciclos de altas y bajas temperaturas alternadas para separar las hebras de ADN recin formadas entre s tras cada fase de replicacin y, a continuacin, dejar que vuelvan a unirse a polimerasas para que vuelvan a duplicarlas.

Se basa en el proceso de replicacin del ADN, para ello se utilizan unos oligonucletidos que se han de disear como cebadores que inician la replicacin "in vitro. Esta tcnica tiene mltiples utilidades: realizar pruebas de paternidad o averiguar la autora de un delito; realizar secuenciaciones de genomas (mucho ms rpido que a partir de la clonacin en clulas), etc.

PCR
Inicialmente la tcnica era lenta, ya que las polimerasas se desnaturalizaban al realizar los cambios de temperatura y era necesario agregar nuevas polimerasas en cada ciclo. (95 C en las fases de desnaturalizacin del ADN) Hoy se emplean ADN polimerasas termoestables, extradas de microorganismos adaptados a vivir a esas temperaturas. Dichos microorganismos son: Thermus aquaticus (polimerasa Taq), Pyrococcus furiosus (Pfu), Thermococcus litoralis (Vent) y Thermus termophilus (Tth). Hoy, todo el proceso de la PCR est automatizado mediante un aparato llamado termociclador, que permite calentar y enfriar los tubos de reaccin para controlar la temperatura necesaria para cada etapa de la reaccin.

Obtencin de protenas de inters mdico, comercial, etc. (insulina, hormona del crecimiento, factores de coagulacin)

Obtencin de vacunas recombinantes

(aternativa al uso de organismos patgenos inactivos)

Extraccin del ADN del virus

ADN plsmido bacteriano

Integracin del plsmido hbrido en el ncleo de una clula de levadura

La levadura fabrica las protenas vricas con poder inmunolgico

Inyeccin de protenas vricas en un chimpanc

As, se ha conseguido obtener la vacuna de la hepatitis B mediante la tecnologa del ADN recombinante. El gen de la subunidad proteica del virus de la hepatitis fue introducido en la bacteria Escherichia coli y en la levadura Saccharomyces cerevisiae, las cuales produjeron en cultivo la protena del virus. Los anticuerpos sirven como defensa frente a enfermedades infecciosas y sustancias extraas, pero adems son un medio de curacin para aquellos enfermos que no son capaces de producirlos. La tcnica de los anticuerpos monoclonales permite obtener gran cantidad de ellos y sin impurezas; consiste en inmortalizar las clulas responsables de su fabricacin, las clulas plasmticas que se forman por activacin de los linfocitos B. La forma de conseguirlo es hibridando clulas plasmticas y clulas tumorales con capacidad para multiplicarse indefinidamente (clulas de mielomas), el resultado son clulas hbridas llamadas hibridomas que se pueden clonar. Cada clon (procedente de un solo hibridoma) producir un anticuerpo monoclonal.

Las enfermedades genticas debidas a un solo gen defectuoso ascienden a ms de 4000, de las cuales 345 afectan al cromosoma X, por lo que sern transmitidas a los nios varones, si su madre posee uno de esos defectos genticos. La terapia gnica est siendo considerada la cuarta revolucin de la medicina (despus de las medidas de salud pblica, la anestesia, y las vacunas y antibiticos). Para su aplicacin se siguen dos estrategias: a) Insertar una copia sana de un gen en las clulas del paciente con una enfermedad gentica, para compensar el efecto del gen defectuoso ( esto se consigui con una nia que tena una inmunodeficiencia grave). b) Introducir un gen especialmente diseado para que proporcione una nueva caracterstica a las clulas (por ejemplo, introducir en linfocitos un gen que produzca un inhibidor del virus del sida en pacientes afectados por el VIH).

La clonacin en plantas se consigue sobre todo mediante la manipulacin de cultivos celulares. La principal tcnica empleada es la micropropagacin o propagacin vegetativa in vitro, la cual permite clonar en corto tiempo un gran nmero de especies. Este procedimiento se utiliza para la seleccin y produccin de plantas en grandes cantidades, as como para la investigacin en biologa vegetal.

Se consigue mediante la obtencin de unos fragmentos o explantes de la planta madre. Los explantes se colocan en un medio de cultivo adecuado y produce un callo (masa de clulas sin diferenciar); los callos pueden dividirse en multitud de fragmentos o incluso hacerse una suspensin de clulas. En el momento que se desee, se cambian las concentraciones de hormonas auxina y citoquinina, esto hace que se diferencien las clulas de los callos con lo que originarn plantas enteras. Se usa para hacer ms rentables la produccin de flores o de metabolitos secundarios (perfumes, pigmentos, etc.)

Se trata de disparar bolitas de oro que llevan fragmentos de ADN adheridos, con una especie de pistola, sobre una poblacin de clulas. Las bolitas que queden en el citoplasma pueden transferir el ADN que transportan a algn cromosoma de la clula bombardeada. Las aplicaciones agrcolas van desde el mejoramiento de procesos bsicos como la fotosntesis y la fijacin de nitrgeno atmosfrico por parte de las plantas, hasta la resistencia a herbicidas, agentes patgenos y factores de estrs (salinidad del suelo, sequa, etc.), as como la obtencin de productos agrcolas de mejor calidad y caractersticas nuevas.

Figura 6: Obtencin de una planta transgnica por transformacin biolstica

Plantas transgnicas

Agrobacterium tumefaciens es patgena de plantas.Produce tumores

Agrobacterium Plsmido Ti

ncleo cromosoma

Transgnesis= introduccin de ADN extrao en un genoma, de modo que se mantenga estable de forma hereditaria y afecte a todas las clulas en los organismos multicelulares.
Ingeniero gentico natural tras sutitucin de genes onc por genes de inters

inductor de tumores contiene oncogenes (genes onc)

cromosoma clula vegetal tumores Proliferacin de hormonas crecimiento. Se forman tumores en las zonas de la lesin

Resistencia a herbicidas, insectos y enfermedades microbianas El maz transgnico de Novartis Resistente al herbicida y al gusano barrenador europeo (contiene el Gen de resistencia a la toxina Bt de Bacillus thuringiensis) Problemas:Larvas de especies de insectos predadores benficos (larvas verdes de crisopa) murieron cuando fueron alimentadas con el gusano barrenador europeo Gold rice de Monsanto con color amarillo por los altos niveles de vitamina A Sintesis de productos de inters comercial

La obtencin de un gran numero de animales con cierta caracterstica (producir mas leche, engordar rpidamente, producir lana azul, etc.) . Se usan para ello dos tcnicas: a) la disgregacin de clulas embrionarias a partir de un embrin, de modo que cada clula separada funciona como un zigoto y originar un animal. b) la transferencia nuclear; sta consiste en obtener vulos enucleados (se les ha extrado el ncleo por microsuccin) y conseguir introducir un ncleo de una clula embrionaria o de una diferenciada (especializada), con esta ltima modalidad se obtuvo la famosa oveja Dolly. Cuanto ms diferenciada est una clula ms difcil es conseguir su reprogramacin para que funcione como un zigoto y origine un nuevo animal.

Clonacin de animales
(TRANSFERENCIA NUCLEAR DE CLULAS EMBRIONARIAS)

Aparato de microinyeccin

Clonacin de animales

(TRANSFERENCIA DEL NCLEO DE UNA CELULA SOMATICA: CLULA DIFERENCIADA)

Clonan terneros en EE UU para producir anticuerpos humanos

efe- Washington - agosto 2002

Terneros clonados y manipulados genticamente (fbrica de anticuerpos humanos) genes para anticuerpos humanos recombinantes clulas drmicas clonacin

Objetivo: Tratamiento de enfermedades inmunolgicas Futuro: Tratamiento de una amplia gama de enfermedades ocasionadas por bacterias y virus, como hepatitis, ntrax (utilizada como arma biolgica)

Clonan cerdos destinados a trasplantar sus rganos a humanos

La empresa escocesa PPL Therapeutics logra retirar de los cerditos el gen que provoca el rechazo en transplantes a humanos "alfa 1,3
galactosil transferasa"

Enero 2002. AP Photo/Roanoke Times, Gene Dalton (IDEAL-EFE)

Paso importante en favor del xenotrasplante (transferencia de clulas u rganos de una especie a otra)
Ayudar a superar la escasez de rganos humanos para hacer trasplantes de todo tipo

La posibilidad de clonar animales mamferos, tanto a partir de clulas embrionarias como de clulas diferenciadas , abre la puerta para la clonacin de humanos. En 1993 un experimento de clonacin humana hecho con embriones humanos que no podran haber sobrevivido, pero que mediante la disgregacin de sus clulas se obtuvieron 48 embriones clnicos (idnticos genticamente) que fueron posteriormente destruidos. Clonar personas enteras est prohibido en muchos pases y condenado por muchas instituciones, pero clonar tejidos humanos con fines teraputicos es pedido por multitud de cientficos, sobre todo desde que se puede dirigir la diferenciacin de clulas madre hacia la obtencin de tejidos concretos.

Tcnica de clonacin

La clonacin humana ya se est intentando de forma clandestina por varios laboratorios en el mundo
La clonacin reproductiva no arroja los resultados suficientes, no existen garantas como para decir 'Vamos a clonar un ser humano' Por cada intento de clonacin hay detrs miles de fallos, abortos y malformaciones genticas Para obtener a Dolly: 277 fusiones de ovocitos con clulas mamarias, solo 29 embriones fueron aptos. De estos solo uno result un xito

Declaracin Universal de Derecho Humanos y Genoma Humano de la UNESCO (1997), adoptada en 1998 por la Asamblea General de ONU (busca un balance entre una
continuacin en las investigaciones y la salvaguarda de los derechos humanos)

Frente a los mltiples beneficios de la ingeniera gentica pueden surgir algunos problemas

Problemas sanitarios nuevos microorganismos patgenos,

efectos secundarios de nuevos frmacos de diseo, etc...

Problemas ecolgicos

desaparicin de especies con consecuencias desconocidas, nuevas contaminaciones debidas a un metabolismo incontrolado, etc...

Problemas sociales y polticos en el campo de la produccin industrial, agrcola y ganadera,

pueden crear diferencias an ms grandes entre pases ricos y pobres. El sondeo gnico en personas puede llevar a consecuencias nefastas en la contratacin laboral, por ejemplo, y atenta contra la intimidad a que tiene derecho toda persona (empleo, agencias de seguros, discriminacin..).

Problemas ticos y morales

Poder conocer y modificar el patrimonio gentico humano puede ser una puerta abierta al eugenismo "Eugenesia: la ciencia del incremento de la felicidad humana a travs del perfeccionamiento de las caractersticas hereditarias".