TCNICAS EMPLEADAS EN BIOTECNOLOGA

AISLAMIENTO DE GENES INDIVIDUALES A PARTIR DEL GENOMA

ADN recombinante En los ltimos aos, se han desarrollado tcnicas que han permitido abordar el anlisis y la manipulacin del ADN en una forma antes no imaginada. La tecnologa del ADN recombinante ha hecho posible investigar ms a fondo la estructura y funcin de los genes, especialmente de los genes eucariticos especficos que eran inaccesibles por otros mtodos partiendo directamente del genoma.

Las tcnicas ms importantes son

a) Mtodos de obtencin de fragmentos especficos de ADN: que permiten el anlisis, aislamiento y manipulacin de genes individuales. b) Mtodos de obtencin de mltiples copias de fragmentos idnticos de ADN: como la clonacin y la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR). La clonacin se realiza por medio de transportadores (vectores) por medio de los cuales el fragmento de ADN de inters puede ser incorporado al interior de las clulas bacterianas o partculas virales. c) Localizacin e identificacin de fragmentos especficos de ADN, o de ARN, por hibridacin de cidos nucleicos, mtodo que tambin permite estimar similitudes entre cidos nucleicos de orgenes diferentes. Esta tcnica aprovecha las propiedades de apareamiento de las bases de los cidos nucleicos. d) Secuenciacin del ADN, es decir, determinacin del orden exacto de los nucletidos en un segmento de ADN, lo que permite, en consecuencia, una lectura directa de la informacin gentica codificada. e) Ingeniera del ADN o ingeniera gentica, mediante la cual es posible modificar una secuencia de ADN para generar nuevas versiones de genes que pueden ser luego reintroducidas en una clula u organismo.

AISLAMIENTO DE GENES INDIVIDUALES A PARTIR DEL GENOMA La tcnica ms usual es el empleo de una sonda de DNA o RNA fuertemente marcada con radiactividad; la hibridacin de la sonda con el gen se detecta por autorradiografa. El punto crucial es la obtencin de ARNm de la protena correspondiente para poder emplearlo como sonda, donde la tecnologa de secuenciacin ha permitido la creacin directa de sondas que hibriden con el ARNm. Una tcnica muy poderosa requiere conocer nicamente una secuencia corta de protena, lo que permite sintetizar oligonucletidos pequeos que correspondan a dicha secuencia. stos oligonucletidos se pueden usar para aislar el ADNc o el ADN genmico que contenga la secuencia del gen.

AISLAMIENTO DE GENES INDIVIDUALES A PARTIR DEL GENOMA

Para identificar al gen que corresponde a determinada sonda, el primer paso consiste en romper el ADN del genoma en fragmento manejables. A diferencia de las protenas, los genes no existen en unidades independientes, sino que confieren regiones de una molcula de ADN de gran tamao. Aunque es posible fragmentar el ADN al azar, es muy difcil que estas porciones contengan un determinado gen. As, el purificar un determinado gen constituy un verdadero problema hasta la aparicin de las endonucleasas de restriccin.

DNA RECOMBINANTE
DNA RECONBINANTE
Depende de enzimas capaces de: Cortar Unir Replicar Transcribir inversamente el RNA Otra herramienta es el uso de Sondas especficas

ELEMENTOS BSICOS DE LA INVESTIGACIN EN GENES

Anlisis de enzimas de restriccin: Bistures moleculares Tcnicas de trasnferencia o Blotting: Southern y Northern se utilizan para separar y caracterizar DNA y RNA respectivamente. Secuenciacin del DNA. Sntesis en fase slida de cidos nucleicos. Reaccin en cadena de la polimerasa.

AISLAMIENTO DE GENES INDIVIDUALES A PARTIR DEL GENOMA Enzimas de restriccin

Endonucleasas que reconocen secuencias de bases especficas en el DNA doble hlice, y cortan ambas hebras en sitios concretos. Se han encontrado en gran variedad de procariotas.
Su funcin biolgica consiste en destruir DNA forneo, el DNA propio no se degrada porque los sitios de cortes se encuentran metilados.
Reconocen secuencias especficas de entre 4 y 8 pares de bases e

hidrolizan un enlace fosfodisteren cada hebra de esta regin.

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Se han purificado y caracterizado ms de 100 enzimas de restriccin Se nombran con una abreviatura de 3 letras que hacen referencia al organismo hospedador, seguido de una indicacin de la cepa de la cul se aisly de un nmero romano, en caso de haber ms de una enzima de la misma cepa. Ej: EcoRI(Escherichiacoli), HaeIII (Haemophilusaegyptius), El producto del corte con una enzima puede ser a su vez digeridoen fragmentos ms pequeos con otras enzimas y en su conjunto dichos fragmentos servir como huellas digitales de una molcula de DNA.

AISLAMIENTO DE GENES INDIVIDUALES A PARTIR DEL GENOMA

AISLAMIENTO DE GENES INDIVIDUALES A PARTIR DEL GENOMA- SOUTHERN BLOTT

Los fragmentos de ADN no se pueden analizar directamente en el gel de agarosa. La clave del protocolo que permite

identificar fragmentos radica en la posibilidad de transferir el

ADN a un medio en el que pueda tener lugar la reaccin de hibridacin con la sonda. El ADN se desnaturaliza para dar fragmentos unicatenarios que se transfieren desde el gel de agarosa a un filtro de nitrocelulosa, sobre el que se inmovilizan. El procedimiento empleado para la transferencia recuerda el uso del papel secante y en ingles se conoce con el

nombre de blotting. Cuando se realiza empleando ADN, la

tcnica se conoce como Southern

Protocolo: El gel de agarosa se coloca sobre un papel de filtro previamente empapado en una solucin concentrada de sal y sobre el gel se pone el filtro de nitrocelulosa. Por encima de la nitrocelulosa se pone papel de filtro seco, cuya funcin ser absorber la solucin salina. Para llegar al papel seco, la solucin ha de atravesar el gel de agarosa. A su paso arrastra el ADN, que se queda atrapado en la nitrocelulosa en la misma posicin que ocupaba en el gel.

El ADN inmovilizado en nitrocelulosa puede hibridar in situ con la sonda radiactiva. Slo hibridan los

fragmentos que sean complementarios de una sonda y, la hibridacin se

puede visualizar por autorradiografa.

Cada secuencia complementaria da lugar a una banda marcada, cuya posicin depende del tamao del fragmento de ADN.

La tcnica ofrece un ahorro significativo en el tiempo, como la cromatografa o electroforesis en gel , y los complejos procedimientos Blot para el gel no son necesarios. Sin embargo, no proporciona informacin sobre el tamao de la diana biomolcula . Adems, si dos molculas de diferentes tamaos se detectan, todava aparecer como un solo punto. Dot blots por lo tanto slo puede confirmar la presencia o ausencia de una biomolcula o biomolculas que pueden ser detectados por el ADN sondas o el anticuerpo . Qu puede hacer esta prueba detecta? El sensible prueba dot blot se puede utilizar para detectar la infeccin por Chlamydia trachomatis y otras enfermedades de transmisin sexual

Cuando disponesmos de 2 tipos celulares e De cuales gen se expresa y el otro no se obtiene el ADNc correspondiente a todos los ARMm de la linea celular en el que gen se expresa para eliminar todos ARNm que no son especifico de dicha celula la preparacion de ADNc se hibrida exhaustivamente con los ARNm de un tipo celular parecido este paso separa la secuencia de ADNc que son comunes a los 2 celulas la especificidad de la separacion dependera del grado de similitud entres los 2 tipos celulares .

Tras eliminar5 todas secuencias de ADNc que hibridan con los otros ARNm los restantes se hibridan con los ARNm de la primera celula para confirmar q corresponde a secuencias codificadoras . Estos clones deben contener secuencias especificas de la poblacion de ARNm de la celulas de interes y de este modo Ser caracterizado

En la practica es difcil aislar directamente fragmentos partiendo de ADN genmico; una alternativa mas eficaz para aislar un gen consiste en invertir el orden y clonar primero el genoma. Los vectores que contienen ADN del genoma se denominan clones genmicos o clones de ADN cromosmico.

La clonacin de un genoma entero se conoce en ingles como shotgun(escopeta de perdigones). Primero se rompe el genoma en fragmentos de tamao manejable. Despus se insertan los fragmentos en un vector para dar lugar a una coleccin de plsmidos quimricos, que se denomina biblioteca o genoteca genmica.

Las colonias bacterianas que contienen vectores quimricos se lisan en filtros de nitrocelulosa; su ADN se desnaturaliza in situ, se fija el filtro y se hibrida con una sonda marcada radiactivamente que representa la secuencia que se desea clonar (normalmente ADNc).

Las colonias en que haya hibridacin se visualizaran como manchas en la autorradiografia. El vector quimrico correspondiente se puede recuperar a partir de copias de colonias hechas antes de la lisis en filtro.

Los genes eucarioticos de gran tamao son los que se suelen fragmentar para construir una genoteca, dando lugar a varios fragmentos repartidos en clones que son capaces de reaccionar con la sonda. Mediante la digestin parcial con cantidades limitantes de una enzima de restriccin la cual efecta cortes en determinados sitios con una frecuencia elevada en el genoma. Como consecuencia, se produce una digestin parcial del ADN, de modo que slo tiene lugar la fragmentacin de unos cuantos sitios de restriccin, quedando el resto intacto.

Se genera as una coleccin de fragmentos superpuestos con una longitud idnea para la clonacin en un vector de clonacin. Tras ligar el vector y el fragmento de ADN, se introduce en una clula husped. La cantidad de clones que se necesitan para generar una genoteca que cubra el genoma entero depender del tamao de dicho genoma y del tamao de los trozos de ADN obtenidos.

En la tcnica del paseo cromosmico se parte de un clon aislado (porque contiene el gen conocido). Como el fragmento del clon puede ser muy grande, el proceso se controla mejor utilizando una sonda para el aislamiento del siguiente clon, logrando obtener el subclonado.

Luego se identifican otros vectores quimricos, estos vectores identifican regiones cromosmicas situadas a los lados del fragmento portado por el primer clon. El proceso se puede repetir indefinidamente.

Para el aislamiento de estos clones se utilizan las tecnicas convencionales de clonacion.