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PCR
Reaccin en Cadena de la Polimerasa
Kary Mullis, 1983 Amplificacin selectiva de secuencias de DNA realizada en un sistema in vitro libre de clulas Permite la obtencin de un elevado nmero de copias de una secuencia de DNA a partir de pequeas muestras y un posible mal estado de conservacin. Es una tcnica de anlisis rpida, sencilla y eficaz.
1994: PRIMER TERMOCICLADOR PARA PCR in situ 1995: PCR A TIEMPO REAL
1.-Desnaturalitzacin
3.- Elongacin
2.- Hibridacin
CICLES (20-40) desnaturalitzaci: 94-96C 1 minut hibridaci: 50-65C 1 minut extensi: 72C 1 minut
EXTENSI 72C 5-10 minuts
Q = m (1 + E)n
N de cpies
DNA motlle
N de cicles
10 ng 1 g 10 ng 1 ng 20 pg 1 2 pg
Activitat exonucl. Si No Si No No
Activitat correctora No No No Si Si
Cuando la Taq incorpora un nucletido errneo se disocia del molde de DNA y no puede continuar la extensin
n
5 3
Diseo de Cebadores
Longitud
Entre 15-25 nt
Composicin de bases
Una proporcin similar de cada uno de los nucletidos Un contenido de G y C similar en la pareja de cebadores Evitar repeticiones. Evitar posibles formaciones de estructures secundarias
Extremo 3
Evitar complementariedad que afecten a el extremo 3 del mismo cebador o entre cebadores. Extremos 3 ricos con G y C pueden dar lugar a inespecificidades.
Temperatura de fusin
Ha de ser similar la Tm en la pareja de cebadores
Produccin de Sondas
-Sondas Experiencias de Hibridacin El sustrato puede ser una mezcla de DNAs o un fragmento de DNA clonado.
PCR Asimtrica Inicialmente se producen sdDNA, pero luego cebador limitante se agota pero el segundo continua sintetizando, dandolugar a ssDNA
- PCR Asimtrica
Ciclos Iniciales Cebadores / = 1 / 100
Ciclos Finales
Cebador
Reconstruccin de DNA
-DNA Procedente de muestras arqueolgicas, especies antiguas, incluso especies extinguidas (ancient DNA). DNA degradado, fragmentado. PCR : Capaz de regenerar DNA original de tamao mucho mas grande.
Sntesis de Genes
-Anlogo al anterior Genes Sintticos A partir de oligonucletidos sintticos y solapantes que se van aadiendo ordenadamente. Longitud de Cebadores: X = 50 nt Hasta 1000 pb (1 da de trabajo)
Nested PCR