Trabajo Prctico N4

Aislamiento de Microorganismos
Diversidad Metablica

Objetivo del Trabajo Prctico

Aislamiento de microorganismos partir de distintos inculos (agua, ricota, arroz, tierra y yogurt)
1)Enriquecimiento-Seleccin 2)Seleccin-Diferenciacin 3)Obtencin de un cultivo puro (Tincin de Gram y Pruebas Bioqumicas)

Microorganismos a aislar:
Enterobacterias (agua) Pseudomonas spp. (agua) Staphylococcus spp. (ricota) Bacillus spp. (arroz) Lactobacillus spp. (yogurt) Azotobacter spp. (tierra)

Medios de Cultivo: caractersticas generales

Disponibilidad de nutrientes (C, N, sales inorgnicas, vitaminas)

Disponibilidad de oxgeno
pH Humedad Temperatura Esterilidad

 Medios Definidos o Complejos

Medios Mnimos (definidos) o Ricos (complejos).

Medio Definido: los componentes del medio (y sus concentraciones) son conocidos. Ejemplo de Medio Definido para Escherichia coli:
Componente Glucosa Na2HPO4 KH2PO4 NH4Cl NaCl MgSO47H2O CaCl22H2O Gramos/litro 5 6 3 1 0.5 0.12 0.01 Fuente de C y energa Buffer, fuente de P Buffer, fuente de P Fuente de N Fuente de Na Fuente de Mg Fuente de Ca

Medio Complejo: se agregan ingredientes cuya composicin exacta de desconoce (extractos, peptonas, etc).
Ejemplo de Medio Complejo para Salmonella:
Componente
Extracto de carne Peptona Glucosa Na2HPO412H2O FeSO47H2O Indicador Sulfito de Bismuto Verde Brillante gar

Gramos/litro
5 6 5 4 0.3 8 Fuente de aminocidos, nucletidos, vitaminas y micronutrientes. Tambin fuente de C. Fuente de aminocidos, nucletidos, vitaminas y micronutrientes. Tambin fuente de C. Fuente de C y energa. Buffer y fuente de P. Indicador de produccin de H2S. Fuente de Fe y S. Inhibe el crecimiento de Gram positivos

0.025 20

Inhibe el crecimiento de Gram positivos

Peptonas: pptidos (aminocidos libres), carbono y nucletidos. Peptona de casena (triptona): degradacin pancretica de la casena. Peptona de carne: degradacin pancretica de la carne. Peptona de gelatina: degradacin pancretica de la gelatina.

Proteosa peptona: peptona de mayor calidad, con alta proporcin de pptidos de menor PM, aminocidos libres y factores de crecimiento. Extracto de levadura: es la parte hidrosoluble de la levadura autolizada. Alto contenido de vitaminas.

Medio Mnimo: posee la mnima cantidad de nutrientes requeridos para el crecimiento. Es un medio definido. Por ej.: M9.
Medio Rico: posee gran variedad de nutrientes y en abundancia (provenientes de extractos y peptonas). Por lo general son medios complejos. Por ej: Luria-Bertani (LB):
Componente Triptona Extracto de Levadura NaCl Gramos/litro 10 5 10 Aminocidos, carbono, energa, macro y micronutrientes. Vitaminas, macro y micronutrientes. Balance osmtico.

Medio de Enriquecimiento: se utiliza como primer paso en el aislamiento de bacterias. Contiene sustancias que permiten enriquecer el cultivo en el organismo de inters. Medio Selectivo: posee sustancias que permiten el crecimiento de un grupo de bacterias y que inhiben el desarrollo de otros grupos. Por ej: sales biliares y cristal violeta: inhiben el crecimiento de Gram positivos. Medio Diferencial: contiene compuestos que permiten detectar algn cambio de color en el medio cuando ocurre una determinada reaccin qumica. Por ej: azul de bromocresol: indicador que vira al amarillo cuando el pH del medio es cido (permite distinguir a las bacterias que fermentan lactosa). Medio Selectivo y Diferencial.

Pasos a seguir para aislar un microorganismo (y caracterizarlo):

1.

Inocular la muestra (agua, tierra, yogurt, ricota o arroz) en un caldo de enriquecimiento.

2. Incubar a la temperatura y tiempo adecuados. 3. Estriar en medio selectivo (adems puede ser diferencial). Obtencin de colonias aisladas. 4. Tincin de Gram 5. Pruebas Bioqumicas: TP Nro. 5.

Enterobacterias
g-Proteobacteria Bacilos Gram negativos Fermentadores de glucosa Anaerobios facultativos Flagelos peritricos Escherichia coli (algunas cepas patgenas) Salmonella, Shigella, Enterobacter, Yersinia, Klebsiella, Proteus, entre otros. Todos con especies patgenas. Oxidasa negativos

Aislamiento de Enterobacterias (agua)

1. Sembrar en Caldo Mac Conkey (2x): medio de enriquecimiento y selectivo para el aislamiento de enterobacterias de agua y leche. Peptona de Casena Lactosa Bilis de Buey Prpura de Bromocresol pH= 7,40,2 Incubar por 48 hs a 37C

Si hay fermentacin de lactosa:

Slo cido Gas + cido Coliformes, sin E. coli E.coli (junto a otras coliformes)

Aislamiento de Enterobacterias (agua)

Crecimiento en Caldo Mac Conkey Cambio de color a amarillo
S S

Formacin de Gas
S S

Escherichia coli
(lactosa +)

Bueno Bueno

Enterobacter cloacae
(lactosa +)

Klebsiella pneumoniae
(lactosa +)

Bueno

Proteus mirabilis
Pseudomonas aeruginosa Staphylococcus aureus

Bueno
Malo Malo

No

No

Si hay formacin de gas y el pH del medio se acidifica, entonces, el siguiente paso es estriar en gar Mac Conkey y gar EMB.

Aislamiento de Enterobacterias (agua)

2. gar Mac Conkey: medio selectivo y diferencial.
Peptona de Casena Peptona de Carne Cloruro de Sodio Lactosa Sales biliares Cristal violeta Rojo Neutro pH= 7,10,1 Incubar por 24 hs a 37C
Apariencia de las colonias Microorganismo

Grandes, rojas, con halo

Grandes, rosadas, mucoides Incoloras, transparentes Pequeas, opacas, aisladas

Escherichia coli (lactosa +)

Enterobacter spp., Klebsiella spp. (lactosa +) Salmonella spp., Shigella spp., Proteus spp.
Enterococci, Staphylococci

gar Mac Conkey

Lactosa + Lactosa -

Escherichia coli

Salmonella typhimurium

Aislamiento de Enterobacterias (agua)

2. gar EMB: medio selectivo y diferencial (enterobacterias patgenas). Peptona de Carne Hidrgenofosfato dipotsico Lactosa Apariencia de las Sacarosa colonias Eosina Amarillenta Transparentes, de color Azul de Metileno mbar pH=7,00,2 Incubar por 24 hs a 37C
Verdosas con brillo metlico a la luz reflejada, con el centro negroazulado a la luz transmitida

Microorganismo

Salmonella spp., Shigella spp. Escherichia coli (lactosa +,

sacarosa +)

Ms grandes que las de E. coli, mucosas, confluentes, con el centro pardo-grisceo a la luz transmitida

Enterobacter spp., Klebsiella spp. (lactosa+, sacarosa-)

gar EMB
Lactosa + Lactosa +

Escherichia coli

Enterobacter spp.

Pseudomonas spp.
g-Proteobacteria Bacilos Gram negativos Aerobios estrictos Con flagelos polares Producen pigmentos No fermentadores Oxidasa positivos Patgenos de plantas/infecciones oportunistas en humanos

Aislamiento de Pseudomonas aeruginosa (agua)

1. Sembar en Caldo M9 (2x) e incubar por 48 hs a 42C: enriquecimiento y seleccin.

2. Estriar en gar Cetrimida: medio selectivo para Pseudomonas

aeruginosa

Peptona de Gelatina MgCl2 Cetrimida Glicerina SO4K2

Incubar por 48 hs a 37C.

Pseudomonas aeruginosa

Staphylococcus spp.
Cocos Gram positivos Anaerobios facultativos Fermentan glucosa (ac. lctico) Asociados a piel y mucosas Patgenos (S. aureus) Resisten altas concentraciones salinas

Aislamiento de Staphylococcus aureus (ricota)

1.
2.

Ricota en Agua Peptonada: enriquecimiento (2 hs a temperatura ambiente)

Mezclar con Caldo Cerebro Corazn (con NaCl 13%): medio selectivo para Estafilococos patgenos.

Infusin de cerebro Infusin de corazn Proteosa peptona D(+) Glucosa NaCl (7.5% final) Hidrgenofosfato disdico pH=7,40,2 Incubar por 48 hs a 37C

Si hay crecimiento, estriar en gar manitol salado-rojo fenol y gar azida

Aislamiento de Staphylococcus aureus

3. gar manitol salado-rojo fenol: medio selectivo y diferencial (permite distinguir entre S. aureus y otras especies no patgenas).

Peptona de carne Extracto de carne NaCl 7.5% D(-)Manitol Rojo fenol pH=7,40,2
Incubar por 48 hs a 37C

Apariencia de las colonias

Con halo amarillo, luminoso; crecimiento intenso Sin cambio de color; poco crecimiento

Microorganismo
Manitol-positivos: S.

aureus

Manitol-negativos: S. epidermidis y otros.

1. 2. 3.

S. aureus S. epidermidis Micrococcus luteus

3. gar azida: medio selectivo para Staphylococcus spp. Incubar por 48 hs a 37C

Bacillus spp.
Bacilos Gram positivos Forman endosporas Generalmente mviles con flagelos peritricos Aerobios (facultativos) B. cereus (alimentos)

B. anthracis

Aislamiento de Bacillus cereus y Bacillus subtilis (arroz)

1. 2. 3. 4. Arroz en PBS (80C por 5 min.): seleccin. Pasar el sobrenadante a caldo nutritivo: enriquecimiento. Incubar por 48 hs a 37C. Estriar en gar Mossel con emulsin de yema de huevo: selectivo y diferencial (permite distinguir entre Bacillus cereus y B. subtilis) Peptona de carne Extracto de carne D(-)Manitol NaCl Rojo Fenol Emulsin de yema de huevo/Polimixina B

Incubar por 48 hs a37C.

Bacillus cereus: colonias rugosas, secas, de color rosado y rodeadas de precipitado

blanco (Manitol y lecitinasa +).

Bacillus subtilis: colonias amarillas y sin precipitado (Manitol + y lecitinasa -).

Lactobacillus spp.
Bacilos o cocobacilos Gram positivos Fermentadores lcticos Aerobios facultativos o microaerfilos

Aislamiento de Lactobacillus spp. (yogurt)

1. gar De Man, Rogosa y Sharpe (MRS): medio de enriquecimiento selectivo. Polisorbato, acetato, magnesio y manganeso. pH = 5.7. Incubacin en microaerobiosis. 2. gar Rogosa: medio ms selectivo que el anterior, con mayores concentraciones de acetato y pH = 5.5 que inhiben flora acompaante. Incubacin en microaerobiosis.
gar MRS-Lactobacillus casei

Azotobacter spp.
Bacilos o cocos Gram negativos Habitan en el suelo y en el agua Fijan nitrgeno atmosfrico (N2 a NH3) Vida libre Forman quistes (similar a endosporas)

Medio Fred & Waksman: medio selectivo sin fuente de nitrgeno. Contiene manitol (azcar fermentable). Crecimiento a 28C.

Microorganismo
Agua Agua Ricota

Enriquecimiento -Seleccin

SeleccinDiferenciacin
gar Mc Conkey y gar EMB gar Cetrimida gar manitol salado rojo fenol y gar azida gar Mossel con emulsin de yema de huevo y PmB.

Enterobacterias Caldo Mc Conkey Pseudomonas Staphylococcus Caldo M9-42C Caldo cerebrocorazn con 7.5% NaCl 80C y caldo nutritivo

Arroz

Bacillus

Yogurt
Tierra

Lactobacillus
Azotobacter

gar MRS Microaerobiosis

Caldo Fred& Waskman-28C

gar Rogosa Microaerobiosis

gar Fred & Waskman-28C