CARACTERIZACION DE LA POLIFENOL OXIDASA DE FLORETES DE BROCOLI (Brassica oleracea var.

Botrytis italica)

Natalia Cerpa Baez Yulieth Ochoa Montes

De la polifenol oxidasa (PPO) de brcoli se extrajo y se purific a travs de (NH4) 2SO4 precipitacin, intercambio inico y cromatografa de gel de filtracin. Los efectos de la especificidad de sustrato, el pH, y la sensibilidad a diferentes inhibidores: cido ctrico, cido ascrbico, sulfato de sodio y EDTA (sal de sodio del cido etilendiaminotetraactico) de PPO fueron parcialmente purificado,

INTRODUCCION

La enzima cataliza dos reacciones distintas: la ohidroxilacin de monofenoles a o-difenoles (acta como cresolasa (EC 1.14.18.1.)) y la oxidacin de o-difenoles a o-quinonas (acta como catecolasa)

Quinonas son altamente reactivo electrfilo, molculas que pueden polimerizar, dando lugar a la formacin de los pigmentos de color marrn o negro, el fenmeno de pardeamiento enzimtico a menudo se produce en frutas y verduras y es la causa de una disminucin de sus propiedades sensoriales y valor nutricional.

El objetivo principal de esta investigacin fue la caracterizacin PPO de brcoli y aclarar el mecanismo de su inhibicin por productos qumicos de seleccionados compuestos.

Materiales y mtodos:
Floretes de brcoli congelado, catecol, 4metilcatecol, polivinilpirrolidona (PVP40), Reactivo de Bradford, vanilina, cido ferlico, floroglucinol, marcadores de protenas, cido ascrbico, cido ctrico, sulfato de sodio y EDTA. 2,2. Enzima de extraccin y purificacin: Despus de una hora, las protenas precipitadas Se separaron por centrifugacin a 32.000 g durante 30 min. en el mismo tampn durante 24 h (MW de corte de> 12.000) con cuatro cambios del tampn durante la dilisis. Con el fin de llevar a cabo una purificacin adicional.

Las fracciones que mostraron actividad de la PPO fueron recogidas se concentraron y se disolvi en 3 ml de tampn de fosfato, pH 6,8.

2,3. ensayo de enzima

La actividad de la PPO se determin midiendo la tasa inicial de formacin de quinonas, como se indica por un aumento en la absorbancia a 420 nm. 2,4. Estimacin de protenas : mtodo de Bradford

2,5. Determinacin del peso molecular: El peso molecular de la enzima purificada se estim por SDS-PAGE y filtracin en gel

2.6.1. Efecto del pH sobre la actividad enzimtica:

La actividad de la PPO, como una funcin del pH, se determin de acuerdo condiciones estndar usando diversos tampones en un intervalo de pH2.0-12.0. Los sistemas tampn se prepararon de acuerdo con Britton-Robinson

2.6.2. El anlisis cintico de datos y especificidad de sustrato:

La especificidad de brcoli PPO se investig con siete sustratos de calidad comercial: vanilina, cido ferlico, floroglucinol (1,3,5-trihidroxibenceno), cido clorognico, cido cafeico, catecol y (4-metilcatecol) a concentraciones de 10 mM.

RESULTADOS Y DISCUSION
La protena obtenida despus de la precipitacin con sulfato de amonio (2 ml; 0,586 mg de protena) Se separ por cromatografa de intercambio inico utilizando Sephadex DEAE A50 gel. Dos picos de protenas que contienen PPO actividad se recuperaron (pico I, fraccin 3-6; Pico II, fraccin 9-14). Se recogieron los picos y se concentr y purifica adicionalmente mediante filtracin en gel utilizando Sephadex G50. (fig !) Pico I se separ en dos, mientras que Pico II en cuatro o ms picos de protena (Fig. 2)

Sin embargo, la Actividad de la PPO se recuper en las primeras fracciones de la columna de gel de DEAE para ambos materiales pico. la enzima fracciones de la cromatografa en Sephadex G50 fueron combinaron y se purificaron dicionalmente mediante otra etapa de filtracin en gel utilizando Sephadex G100 cama (Fig. 3).

Se observo una banda proteica que corresponda a un peso molecular de 51,3; comparados con otras investigaciones presentan resultados similares : Manzana: 57. Patatas: 57-60. Aguacate: 58.5 66.5.

2. ANALISIS CINETICO Y ESPECIFIDAD DE SUSTRATOS:

Se utilizaron 7 sustratos diferentes: Vanilina. Acido ferulico. Floroglucinol. Acido clorogenico. Acido cafeico. Catecol. 4-metil catecol.

SUSTRATO CATECOL 4-METIL CATECOL ACIDO CAFEICO ACIDO FERULICO

ACTIVIDAD RELATIVA (%) 100.00 62.76 5.92 1.10

ACIDO CLOROGENICO
VANILINA

1.89
0.45

FLOROGLUCINOL

0.16

ANALISIS CINETICO Y ESPECIFICIDAD DE SUSTRATOS

Fig. 6 a) catecol.

b) 4- metil catecol

3. EFECTOS DE LOS INHIBIDORES DE PPO

Fig 7. actividad PPO en brocoli con catecol como sustrato en presencia de inhibidores.