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PCR
Reao em Cadeia da Polimerase
PROFESSOR(A) PATRCIA HAVER
BIOLOGIA MOLECULAR
BIOLOGIA MOLECULAR
Extenso de oligonucleotdeos (primers ou seqncias iniciadoras) que hibridizam com as fitas complementares de uma determinada seqncia-alvo.
BIOLOGIA MOLECULAR
BIOLOGIA MOLECULAR
COMPONENTES DA PCR
DNA alvo Seqncias Iniciadoras DNA Polimerase Substrato Tampo
DESNATURAO DO DNA
BIOLOGIA MOLECULAR
90-100C
68-72C
POLIMERIZAO DA CADEIA
>40C
HIBRIDIZAO DOS PRIMERS
PROFESSOR(A) PATRCIA HAVER
BIOLOGIA MOLECULAR
DNA alvo dATP, dTTP, dCTP, dGTP Tampo Primers (2) Taq polimerase
A TCNICA DA PCR
BIOLOGIA MOLECULAR
A finalidade da PCR produzir rapidamente uma grande quantidade de cpias de uma regio determinada do DNA, tornando-as disponveis para estudo.
A TCNICA DA PCR
BIOLOGIA MOLECULAR
Uma nica molcula de DNA, aps 30 ciclos de desnaturao, hibridizao e extenso, produzir 1,4 bilho de cpias da regio limitada pelos primers. Os produtos obtidos so submetidos eletroforese em gel de agarose e corados com brometo de etdio.
PROFESSOR(A) PATRCIA HAVER
BIOLOGIA MOLECULAR
Desoxinucleotdios Trifosfatos (dNTP) So as bases nitrogenadas que constituiro as novas cadeias de DNA. As 4 bases devero ter concentraes equivalentes. Quando em baixas concentraes:
Diminuem os erros cometidos pela ao da polimerase.
BIOLOGIA MOLECULAR
O on Magnsio
Mg+2 um co-fator enzimtico que desempenha um importante papel na atividade da polimerase. Aumento da concentrao:
Hibridizao eficiente dos primers com o DNA.
Diminuio da concentrao:
Elimina a possibilidade de produto inespecficos.
BIOLOGIA MOLECULAR
Altas concentraes:
Sntese de produtos inespecficos. Polimerizao de primers Ligao entre primers, resultando em baixa produo do produto desejado.
PROFESSOR(A) PATRCIA HAVER
BIOLOGIA MOLECULAR
BIOLOGIA MOLECULAR
BIOLOGIA MOLECULAR
BIOLOGIA MOLECULAR
Sensibilidade da Amplificao
Uma nica clula ou uma pequena quantidade de clulas (amostras de vilosidades corinicas, esfregaos da boca, extrao de DNA).
BIOLOGIA MOLECULAR
BIOLOGIA MOLECULAR
RT - PCR
Mtodo de amplificao que utiliza molculas de RNA para converte-las em DNA complementar (cDNA). Enzima utilizada a Transcriptase reversa (RT). O cDNA obtido ento utilizado no PCR. Fornece dados quantitativos e qualitativos.
BIOLOGIA MOLECULAR
Nested-PCR
Realizao de um PCR utilizando como molde, o produto amplificado de um primeiro PCR. Quantidade reduzida de material gentico; Confirmao de que o produto amplificado realmente o que se deseja utilizar.
BIOLOGIA MOLECULAR
RFLP - PCR
Utiliza a atividade das enzimas de restrio para digerir os produtos amplificados numa PCR. A digesto revela stios de restrio que podem estar alterados e possveis variaes genticas no produto amplificado.
BIOLOGIA MOLECULAR
PCR multiplex So utilizados 2 ou mais fragmentos de DNA, obtidos de diferentes organismos mas numa mesma amostra. Exemplo o homem e um vrus. Investigar a presena de um determinado microorganismo na circulao de um indivduo. Coleta-se uma amostra de sangue; Extrai DNA; Amplificao com 2 pares de primers.
PROFESSOR(A) PATRCIA HAVER
BIOLOGIA MOLECULAR
BIOLOGIA MOLECULAR
BIOLOGIA MOLECULAR
BIOLOGIA MOLECULAR
APLICAES
Deteco de delees/inseres determinadas pela gerao de produtos amplificados que apresentam alteraes em seu tamanho. Deteco de mutaes pontuais (substituies de bases) conhecidas ou no, que geram polimorfismos genticos.
PROFESSOR(A) PATRCIA HAVER
BIOLOGIA MOLECULAR
Diagnstico pr-natal ou pr-implantacional (particularmente para doenas herdadas). Na tipagem para transplantes de rgos e susceptibilidade para doenas auto-imunes especficas (deteco de polimorfismo para HLA).
BIOLOGIA MOLECULAR
No diagnstico e prognstico de doenas de ordem gentica, como cncer, atravs do estudo dos genes relacionados a essas doenas. Na medicina forense (DNA fingerprint).
BIOLOGIA MOLECULAR