MTODOS Y TCNICAS PARA CULTIVOS MICROBIOLGICOS

UNIDAD 2

INTRODUCCIN
Todas los microorganismos en microbiologa presentan una morfologa y tamao muy

variables, as como distintos sistemas de

agrupacin. caractersticas El conocer propias de este tipo de grupo cada

microbiano se consigue por medio de diferentes mtodos de examen.

LA MEDIDA DE LOS MICROORGANISMOS

MICROSCOPIA
AUMENTO DE LA IMAGEN
Lente convexa Punto focal
Diferencia en la intensidad de la luz Uso de Colorantes
Poder de resolucin Tamao de la primera lente de aumento Longitud de onda de luz usada y espcimen ndice de refraccin

CONTRASTE

RESOLUCIN

AUMENTO

AUMENTO TOTAL
MICROSCOPIO LENTE OBJETIVO 10X 40X 100X LENTE OCULAR 10X 10X 10X AMPLIACIN TOTAL 100X 400X 1000X Microscopio ptico Dbil Fuere seco Acetite de inmersin Transmisin (MET)

Microscopio electrnico 200 000X

Barrido (MEB)

10 000X

RESOLUCIN
ACEITE DE INMERSIN APERTURA NUMRICA (AN)

IR 1.5 Aumenta la resolucin

Grabado en la lente del objetivo del microscopio Tamao de la lente Uso de aceite de inmersin

d = longitud de onda 2AN

DISTANCIA ENTRE DOS PUNTOS DE OBSERVACIN

USO DEL ACEITE DE INMERSIN

MICROSCOPIO PTICO COMPUESTO

MICROSCOPIO ELECTRONICO DE TRANSMISIN

MICROSCOPIO DIGITAL CON PANTALLA (LCD)

USOS DEL MICROSCOPIO

TIPOS DE MICROSCOPIA Microscopia ptica Campo claro Contraste de fases El contraste se logra por absorcin El contraste se consigue por interferencia; las diferencias en el ndice de refraccin cambian la fase de la luz Solamente la luz dispersada por la muestra entra en el objetivo, producindose un contraste elevado Imagen clara Imgenes claras y detalladas rodeadas de un halo Las muestras requieren tincin. No requiere tincin; se pueden observar preparacin en fresco de clulas vivas CARACTERISTICA CLAVE ASPECTO DE LA IMAGEN PRINCIPAL APLICACIN

Campo oscuro

Imagen brillante contra un fondo oscuro

Para observar clulas vivas o flagelos demasiado finos para la microscopia de contraste de fases; pocos detalles internos

TIPOS DE MICROSCOPIA Fluorescencia

CARACTERISTICA ASPECTO DE LA CLAVE IMAGEN Se basa en la capacidad de emitir luz visible que tienen los especmenes fluorescentes cuando se les ilumina con luz ultravioleta Hace pasar un haz de electrones a travs de la preparacin, produciendo un gran aumento til Espcimen coloreada (luminosa) contra un fondo oscuro

PRINCIPAL APLICACIN Utilizando anticuerpos fluorescentes se pueden identificar tipos especficos de microorganismos presentes en una mezcla compleja Para poder observar virus , no se puede observar organismos vivos, las preparaciones son desecadas

Microscopia electrnica
Transmisin (MET) Imgenes muy ampliadas con gran detalle

TIPOS DE MICROSCOPIA Barrido (MEB)

CARACTERISTICA CLAVE Barre los especmenes con un chorro de electrones, produciendo la salida de electrones secundarios que crean una seal, que, a su vez, genera una imagen por ordenarlos

ASPECTO DE LA IMAGEN Imagen tridimensional

PRINCIPAL APLICACIN Para ver estructuras de organismos intactos, y estructuras con detalles reales se ocupan muestras desecadas

1. PREPARACIN EN FRESCO SIMPLE

PREPARACIONES EN FRESCO

2. PREPARACIN EN GOTA PENDIENTE

M.O. VIVOS

CONDICIONES DE UNA PREPARACIN EN FRESCO

1. La muestra debe ser representativa 2. Muestras recogidas en condicin de esterilidad 3. Distribucin adecuada en el portaobjeto, homognea

4. Cantidad de agua y colorante adecuada

5. Si necesita calor no debe calentarse demasiado 6. Evitar la contaminacin

MTODO DE EXAMEN EN FRESCO ENTRE PORTAOBJETOS Y CUBREOBJETOS

1. Se prepara un portaobjeto y cubreobjetos limpio y desengrasado 2. En el portaobjeto se deposita una gota de agua estril 3. Con el asa de siembra previamente estril o flameado, se toma un poco de muestra del microrganismo y se realiza una suspensin de estas en la gota 4. Se extiende y homogeniza la gota de muestra, se coloca sobre esta un cubreobjetos formando un ngulo de 45, evitando burbujas de aire y corrientes 5. Se sellan con parafina los bordes del cubreobjetos para disminuir la evaporacin y evitar corrientes en a preparacin 6. Observar al microscopio inicialmente con objetivo de 40 aumentos

MTODO DE EXAMEN EN FRESCO SOBRE GOTA PENDIENTE EN PORTA EXCAVADO

1. Se utiliza en este caso un cubreobjetos adecuadamente limpio y desengrasado, se coloca una gota de la suspensin microbiana con una asa de siembra inicialmente estril 2. Se colocara vaselina en los bordes del pocillo del portaobjetos excavado 3. El cubreobjetos se invertir sobre el portaobjetos excavado perfectamente limpio, colocndolo encima del rea cncava del portaobjetos 4. Se invertir la preparacin 5. Se observa al microscopio con objetivo inicialmente de 40 aumentos

TINCIONES
Colorantes vitales
Fijacin

Fijacin por calor

Fijacin qumica

Extensin

FACTORES QUE AFECTAN LA TCNICA DE TINCIN

1. Fuerza del colorante

2.
3. 4.

pH del colorante
Conservacin del colorante Elaboracin

5.
6. 7.

Tcnicas empleadas
Temperatura Cantidad de muestra

8.
9.

Realizar correctamente el frotis

Soluciones mordientes

10. Tiempos de tincin

TIPOS DE COLORANTES
BASICO
Ion cargado positivamente

ACIDOS

Ion cargado negativamente

Dan MORDIENTES afinidad a la clula

BASICO

Safranina, fucsina bsica, cristal violeta y azul de metileno

ACIDO

Tejidos animales afectados por m.o. Eosina, fucsina acida y rojo Congo

MORDIENTES

Engrosan las estructuras externas de las clulas, iodo , lugol

TCNICAS USUALES DE TINCIN PARA BACTERIAS

TINCION
Tincin simple

USO
Un colorante proporciona contraste para observar mejor un organismo completo

TECNICA
Se tie con un colorante bsico durante 5 minutos. Se aclara con agua, todas las bacterias se tien, la mayora de los tejidos no Se cubre la preparacin de bacterias fijas con cristal violeta, iodo, se decolora con acetona al 95%, las Gram positivas permanecen teidas de cristal violeta, las Gram negativas de rosa

Tincin diferencial (Tincin de Gram)

Dos o mas colorantes, distingue entre bacterias Gram (+,-)

TINCION Tincin de alcohol-acido (Ziehl-Neelsen)

USO Dos colorantes; distingue entre las mico bacterias (acido-alcohol resistencia) y el resto de las bacterias

TECNICA Se tien las clulas con fucsina bsica y se calienta a emisin de vapores durante 5 minutos. Todas la bacterias se tien de rojo. Se decolora brevemente con una mezcla de alcohol- HCl. Las bacterias resistentes se tien de rojo, todas las dems se decoloran. Se trata con el colorante de contraste azul de metileno. Las bacterias alcohol-acido resistentes continan teidas de rojo, las otras se tien de azul

TINCION

USO

TECNICA

Tincion especificas (Tincion de esporas de Wirtz-Conklin)

Tie selectivamente las endosporas

Se cubre la preparacin con verde de malaquita y se calienta a emisin de vapores durante 60 segundos. Se lava con agua durante 30 segundos y se tie con safranina. Las endosporas retienen el color verde, el resto de la clula toma el color rosa
A las clulas previamente fijadas, se le aade una mezcla de acido nico (mordiente) y del colorante rosanilina. El mordiente engruesa los flagelos y el colorante los tie

Tincion de flagelos de Leifson

Permite observar los flagelos

TINCION

USO

TECNICA

Tincin negativa

Revela la presencia de capsulas

Se utiliza tinta china o nigrosina para teir una preparacin en fresco del espcimen. Las partculas de colorante no pueden penetrar en la capsula, que se observa como una regin clara alrededor de la clula

TINCIN SIMPLE
1. Si la muestra es solida tomarla con una asa bacteriolgica estril 2. Si la muestra es liquida tomarla con una pipeta Pasteur estril 3. Extender ambas de manera uniforme y homognea por un portaobjetos 4. Dejar que la muestra se seque al aire, una vez seca se fija con calor, haciendo pasar la muestra de 2 a 3 veces a la llama del mechero 5. Cubrir el portaobjeto con un correspondiente colorante, que para esta tincin suele ser azul de metileno, o azul de toluidina dejndose actuar por 5 minutos 6. Transcurrido el tiempo, se verter agua abundante en la preparacin, para eliminar restos de colorante 7. Dejar secar la preparacin al aire 8. Observar al microscopio con objeto de inmersin

TINCIN GRAM
1. Realizar la preparacin con la correspondiente fijacin por el mtodo ya explicado 2. Aplicar sobre el portaobjetos el primer colorante que corresponder a cristal violeta durante 1 minuto, o violeta de genciana durante 2 minutos 3. Lavar abundantemente con agua destilada para eliminar el exceso de colorante 4. Aadir mordiente, el lugol, que actuara fijando el colorante anterior a las bacterias, aplicndose durante 1 minuto 5. Se vuelve a eliminar el exceso mediante u lavado con abundante agua destilada 6. Decolorar con alcohol del 96 unos 20 segundos o hasta arrastrar todos los restos. 7. Lavar con agua abundante 8. Cubrir el portaobjetos con el segundo colorante o colorante de contraste (safranina) durante 1 minuto 9. Lavar con agua para arrastrar los restos de colorantes y dejar secar 10. Observar con objetivo de inmersin 11. Gram positivas cristal violeta 12. Gram negativas rojo-rosado

La tincin de cido-alcohol resistencia se utiliza para identificar a Mycobacterium, ya que esta bacteria posee ceras en su pared celular que resisten la decoloracin. La microfotografa muestra masas de clulas de M. leprae en el interior de sus clulas hospedadoras. Las mico-bacterias permanecen teidas de rojo, mientras que el resto de las bacterias toman el color azul del colorante de contraste.

Tinciones especficas. (a) La tincin de Wirtz-Conklin se utiliza para observar endosporas. Bacilius cereus es una bacteria esporulada. Las endosporas mantienen la tincin primaria verde, mientras que las otras clulas se observan teidas con la coloracin de contraste rosa. (b) La tincin de Leifson revela que este microorganismo posee flagelos, lo cual contribuye a su identificacin como Spirillum volutans..(c) La tincin negativa con tinta china permite observar que esta bacteria posee cpsula, lo que facilita su identiticacin como Klebsiella pneumoniae, agente causal de la neumona.

MTODOS DE CONTROL PARA EL DESARROLLO DE MICROORGANISMOS

Esterilizacin
Microbiostasis Microbiocida

Desinfeccin

Asepsia

Antisepsia

Tratamiento para el control de microorganismos Tratamiento Efecto Modo de accin METODOS FISICOS Calor seco Calor hmedo Pasteurizacin Frio Mata ciertos m.o. Hace lento o detiene el crecimiento de m.o. Disminuye velocidad de reaccin de qumicas Radiacin Luz UV Rayos X, gamma Filtracin Elimina m.o. celulares Mata muchos m.o. Detiene el crecimiento m.o. Esteriliza Daa el DNA Expulsa electrones de tomos Elimina clulas Desecacin Evaporacin o calor Sublimacin o liofilizacin Distorsiona la membrana Detiene reacciones qumicas Conservacin de alimentos Conservacin de cultivos Se esterilizan superficies Material plstico y frutas y verduras Medios de cultivo, antibiticos Esteriliza Desnaturaliza protenas Material seco Material liquido Elimina patgenos, productos alimenticios Conserva productos perecederos y m.o. Aplicacin

Tratamiento para el control de microorganismos Tratamiento Efecto Modo de accin AGENTES QUIMICOS Fenoles Compuestos fenlicos Alcoholes Halgenos Oxida compuestos bioqumicos esenciales Matan la mayora de m.o. Desnaturalizacin de protenas Germicida Desinfectante, antisptico Aplicacin

Desinfecta superficies, piel, termmetros

Desinfecta superficies, piel, tratamiento de aguas

Perxido de hidrogeno AGENTES SURFACTANTES Jabn y detergente Sales de amonio cuaternario Formaldehido y glutaraldehido Oxido de etileno Mata m.o. Elimina fsicamente m.o Alteran membranas AGENTES ALQUILANTES Inactiva enzimas

Antisptico para la piel

Elimina m.o.

Desinfecta superficies, mesas antisptico de piel Agente esterilizante

Conservacin de tejidos, vacunas y equipo quirrgico Gas utilizado para material sensible, hospitales

ESTERILIZACIN
Eliminacin de todos los microorganismos, todos los aparatos y material deben ser esterilizado para obtener cultivos axnicos. Medio Sustancias liquidas, solidas Matraces Tubos de ensayo Placas Pipetas etc.

ESTERILIZACIN POR CALOR

Hmedo
121C 1 atm Volumen 20 minutos

Seco
170 C 90 Minutos Prendas textiles

Ebullicin Vapor fluente Vapor a presin Tyndalizacin Pasteurizacin

Mecheros Incineracin Aire caliente

AUTOCLAVE ESCOLAR

1. Tornillos mviles para el cierre hermtico 2. Material a esterilizar 3. Vaciado de la caldera 4. Fuente de calor 5. Gas 6. Agua 7. Apoyo para alejar el material del agua 8. Caldera 9. Manmetro 10. Cierre de la tapa 11. Vlvula de seguridad 12. Espita

USO DE INDICADORES BIOLGICOS

Control de autoclave con respecto a la capacidad Caldo nutritivo

Azcar
Indicador de pH Esporas de Geobacillus stearothermophilus ATCC 7953 60 2 C, 48 hrs Violeta rojizo transparente

(negativo)
Amarillo naranja (positivo)

CONTROL DE EQUIPOS Y MATERIALES DE TRABAJO

ACTIVIDAD Registrar la temperatura, presin de esterilizacin Utilice cinta testigo para control de la esterilizacin Utilizar indicadores biolgicos de esterilizacin para verificar la eficacia Registro de uso Chequeo de nivel de agua Chequeo del funcionamiento de vlvulas de seguridad Limpieza interior y exterior Verificacin del manmetro Limpieza del drenaje y sellos X X X X X X POR CORRIDA X X X DIARIO SEMANAL MENSUAL

TRATAMIENTO PARA CONTROL DE M.O

FACTORES PARA LIMPIEZA EFECTIVA

1. 2. 3. 4. 5. 6. Eleccin adecuada del producto de limpieza Temperatura del agua Dureza del agua pH del agua utilizada Perodo de contacto Mtodo de aplicacin del detergente (por espuma, aspersin, etc.)

COMO TRABAJA UN SANITIZANTE

1. Destructor de membrana celular: hipoclorito de sodio, acido peractico 2. Eliminacin de la alimentacin bacteriana y eliminacin de desechos: amonio cuaternario 3. Inactivacin de enzimas criticas: compuestos fenlicos

PRUEBA DE RETO BACTERIANO NMX-BB-SCFI-1999

Cepas: 1. Staphylococus aureus 2. Escherichia coli 3. BHI Soya Tripticaseina Remover crecimiento con 3 ml de solucin salina al 0.85%

PREPARACIN DE M.O. DE PRUEBA

Incubacin de 20 a 24 h Temperatura de 35 a 37 C

Obtener suspensin que leda a 580 nm, de una lectura de 3 a 5% de %T

Resembrar tubo inclinado con 12 ml de agar nutritivo

Determinar el numero de UFC/ml y precisar el %T de una suspension de 75 a 125 X 108 UFC/ml

DETERMINACIN DE CUENTA VIABLE INICIAL

A un matraz Erlenmeyer que contenga 99 mL de la solucin amortiguadora de fosfatos diluida estril, transferir 1 mL de la suspensin de los microorganismos de prueba y efectuar las diluciones decimales necesarias para obtener placas que contengan cada una entre 25 y 250 colonias Colocar en cajas de petri estriles, por duplicado1 mL de cada dilucin, agregar a cada placa de 15 mL a 18 mL de agar para mtodos estndar, homogeneizar y dejar solidificar invertir las cajas de petri e incubar durante 48 h a 303 K - 308 K (30C - 35C). Contar las colonias contenidas en cada una de las cajas, en un cuenta colonias

DETERMINACIN DE CLULAS SOBREVIVIENTES

Para cada uno de los microorganismos de prueba, medir exactamente y por duplicado 99 mL del producto o su dilucin, transferir a matraces Erlenmeyer de 250 mL con tapn de rosca estriles Agitar los matraces, suspender la agitacin, justamente antes de la inoculacin, para que en el momento de la misma, an exista movimiento residual del lquido y as facilitar la incorporacin del inculo. Inocular en forma individual cada matraz con cada uno de los microorganismos de prueba en el centro de la superficie del lquido, evitando tocar con la pipeta, el cuello o las paredes del matraz

Agitar el matraz con la muestra inoculada y exactamente 30 s despus de la inoculacin, transferir 1 mL de la misma, a un tubo de ensayo conteniendo 9 mL de la solucin neutralizante diluida o del caldo neutralizante, mezclar y transferir por duplicado alcuotas de 1,0 mL a cajas de petri estriles y continuar diluyendo hasta tener las diluciones necesarias para obtener placas que contengan de 25 a 250 colonias, agregar a cada placa de 15 mL a 18 mL del medio agar para mtodos estndar con neutralizante, homogeneizar, permitir que solidifique, invertir las placas e incubar durante 48 h entre 308 K a 310 K (35C a 37C). Despus del perodo de incubacin, contar el nmero de UFC en las placas
Obtener resultados: Donde: S= Celulas sobrevivientes C.V.= Cuetna viable inciial Interpretacin de resultados: Un producto etiquetado como germicida, debe tener un por ciento de reduccin de la cuenta viable de 99,999 % en 30 s de contacto a la concentracin de uso recomendada, cuando la cuenta viable inicial se encuentra entre 75 y 125 X 108 UFC / mL

LAVADO DE MATERIAL
pH Azul de Bromotimol al 4% 16 de NaOH 0.01 N 1 g de ABT

Color Incoloro

Cloro residual (mg/litro) 0.0

Celeste
Azul oscuro

0.1 a 0.3
> 0.3

Cloro residual Almidn-Yoduro 2 g almidn en 100 ml de agua 8 g de KI Formaldehido cloroformo 2 a 3 semanas de estabilidad

CEPARIO
1. 2. Cepas Estndar de Control de Calidad Colecciones de cepas ATCC: American Type Collection USA NCIC: National Collection of Industrial Bacteria INGLATERRA JFCC: Japanese Federation of Culture Collection of Microorganism JAPON CCTM: Coleccin Nacional FRANCIA RIA: Reseac Institute for Antibiotics USSR NCIB: Coleccin Nacional Industrial ESCOCIA DSM: Deutsche Sammlung Von Mikroorganismen ALEMANIA

3. Requisitos de las cepas

Caractersticas tpicas Caractersticas estables Reproducibilidad

CONSERVACION DE CEPAS EN MEDIO DE CULTIVO INCLINADO CON ACEITE MINERAL

Agar de Cebrero-Corazn Agar Mueller-Hinton Esterilizar aceite a 15 lb de presin por 45 minutos Incubacin por 24 h a 35 C 1 ml de aceite mineral

Cultivos viables por 2 aos

Control de calidad de trabajo diario Cultivos jovenes de 24 o 48 h antes Resiembra dos veces por semana Cepas semistock Etiquetado de cepas

MEDIOS DE CULTIVO
Tipos de medio de cultivo:

1. Medios definidos
2. Medios complejos 3. Medios selectivo 4. Medios diferenciales 5. Medios selectivosdiferenciales 6. Medias de enriquecimiento

TIPO DE MEDIO
Medios definidos

CARACTERISTICA
Es aquel del cual se conoce su composicin exacta, ha sido preparado a partir de compuestos qumicos puros Se desconoce la composicin qumica exacta de un medio complejo, se preparan a partir de extractos de productos naturales tales como carne, sangre, casena, levadura o soja Favorece el crecimiento de ciertos microorganismos, mientras suprime el crecimiento de otros, se utilizan para aislar especies particulares a parir de mezclas complejas Se identifican colonias de un determinado microrganismo

Medios complejos

Medio selectivo

Medios diferenciales

Medios selectivos diferenciales Medios de enriquecimiento

Actan como un tamiz grosero que disminuye el campo de identificacin. Aslan u tipo particular de microrganismo a partir de una poblacin mixta de gran tamao

CONTROL DE CALIDAD EN MEDIOS DE CULTIVO

CARACTERISTICAS Higroscpicos Temperatura ambiente Protegidos de luz y humedad Vida til de 2 aos CARACTERISTICAS DE CALIDAD pH Prueba de promocin de crecimiento Prueba de funcionalidad Esterilidad Validacin de medios de cultivo

FALLAS Y CAUSAS EN LA PREPARACION DE MEDIOS DE CULTIVO

Valor de pH incorrecto Turbidez o precipitacin Oscurecimiento Gel reblandecido Crecimiento pobre Control de suplementos

pH Prueba de promocin de crecimiento

Antes y Despus de la esterilizacin

Tubos o Cajas recin esterilizadas Cepas de trabajo diario E. Coli, Enterobacter aerogenes mtodo por estra Inhibicin del crecimiento de diferentes m.o. y favorecen el crecimiento de otras, se inoculan microorganismos que deben ser inhibidos Un par de tubos o cajas se incuban sin ser inoculados de 48 a 72 h se hace por lote preparado 1. Tcnica ecomtrica de Mossel y Col 2. Tcnica de Nefelmetro de Mac Farland 3. ndice de Recuperacin

Prueba de funcionalidad

Esterilidad

Validacin de medios de cultivo

ESCALA MAC FARLAND

TUBO 1 Cl2Ba 1% 0,1 SO4H2 1% 9,9 U.F.C/ml 3,0x108

2
3 4

0,2
0,3 0,4

9,8
9,7 9,6

6,0x108
9,0x108 1,2x109

5
6 7

0,5
0,6 0,7

9,5
9,4 9,3

1,5x109
1,8x109 2,1x109

8
9 10

0,8
0,9 1,0

9,2
9,1 9,0

2,4x109
2.7x109 3,0x109

ESCALA MAC FARLAND

OBTENCION DE CULTIVOS AXENICOS Y MIXTOS

Axnico: consiste en una sola especie microbiana proveniente de una sola clula (laboratorio) Mixto: viven diferentes especies de forma continua (naturaleza)

MTODOS DE AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS

Tcnicas Indirectas
Turbidez Peso seco Cultivos Continuos

Tcnicas Directas

Recuento directo al microscopio (vivas y muertas) Siembra por estra Vaciado en placa Extensin en placa Recuento en tubo mltiple Filtracin

Espectrofotmetro mide la cantidad de luz transmitida de una solucin o cultivo liquido de clulas microbianas.

Cuanto mayor masa de clulas tenga un cultivo, mayor ser su turbidez, se

transmitir menos luz y la lectura en el

espectrofotmetro ser mayor.

El espectro se utiliza para estimar un

cultivo denso, y registrar el crecimiento de una poblacin microbiana, para ello

necesitamos una curva patrn.

PESO SECO
1. Las clulas de un cultivo se pueden medir dividiendo el peso seco del cultivo por el peso seco de una clula individual. El peso seco de las clulas se determina separndolas del medio, desecndolos y pesndolas.

2. Se hace por centrifugacin, ultra centrifugacin, luego las clulas se re suspenden en agua destilada y se filtran o centrifugan de nuevo. 3. Despus las clulas del segundo lavado se secan en horno a 105 C por 24 h y luego se enfran en el desecador

CULTIVO CONTINUO (QUIMIOSTATO)

Mantiene una poblacin microbiana en un estado de crecimiento constante

CAMARA LIBRE DE OXIGENO

CAMARA LIBRE DE OXIGENO PARA ANAEROBIOS ESTRICTOS

CMARA DE RECUENTO PETROFF-HAUSER

METODO DE AISLAMIENTO DE SIEMBRA POR ESTRIA EN PLACA

METODO DE EXTENSION EN PLACA Y VACIADO EN PLACA

TCNICA DE NMP TUBO MLTIPLE

Nmero de tubos con turbidez inoculados a partir de tres diluciones sucesivas 0 1 0 1 0 0 1 1 0 2 0 0 2 0 1 2 1 0 2 2 0 3 0 0 3 0 1 3 1 0 3 2 0 4 0 0 4 0 1 4 1 0 4 1 1 4 2 0 4 2 1 4 3 0

NMP 0,18 0,20 0,40 0,45 0,68 0,68 0,93 0,78 1,1 1,1 1,4 1,3 1,7 1,7 2,1 2,2 2,6 2,7

Nmero de tubos con turbidez inoculados a partir de tres diluciones sucesivas 5 0 0 5 0 1 5 1 0 5 1 1 5 2 0 5 2 1 5 2 2 5 3 0 5 3 1 5 3 2 5 4 0 5 4 1 5 4 2 5 4 3 5 5 0 5 5 1 5 5 2 5 5 3 5 5 4

NMP 2,3 3,1 3,3 4,6 4,9 7,0 9,5 7,9 11,0 14,0 13,0 17,0 22,0 28,0 24,0 35,0 54,0 92,0 160,0

TCNICA DE FILTRACIN POR MEMBRANA

FROTIS EN SUPERFICIES VIVAS E INERTES

Mtodo Indirecto Turbidez

Microorganismos para los que se utiliza La mayoria de las bacterias y levaduras

Tipo de recuento Total

Usos / Limitaciones Determina la turbidez con un espectrofotmetro; rpido y reproducible; la suspensin debe contener ms de unos l0 millones de clulas por ml; se requiere una curva patrn Tedioso y requiere un cierto tiempo, pero preciso y reproducible Muy til para el recuento de un tipo de clulas de una mezcla; requiere un cierto tiempo; no es adecuado para cultivos diluidos Muy til para el recuento de clulas de un cultivo axnico; rpido y preciso

Peso seco

Cualquier microorganismo

Total

Directo Recuento Cualquier microorganismo microscpico unicelular

Total

Recuento electrnico

Cualquier microorganismo unicelular

Total

Mtodo Recuento en placa

Microorganismos para los que se utiliza Cualquier microorganismo unicelular viable

Tipo de recuento Viables

Usos / Limitaciones

Numero ms Cualquier problable microorganismo viable

Filtracin

Cualquier microorganismo viable

Muy sensible - puede detectar incluso una clula; lento y tedioso; para evitar el error debido al muestreo, se debe recontar un gran nmero de colonias Viables Utilizado para microorganismos que son dificiles de cultivar en medio slido y para determinar contaminacin por Escherichia coli en aguas; requiere un cierto tiempo Viables Se concentra una muestra, de manera que se puede recontar un pequeo nmero de clulas a partir de grandes volmenes de un lquido o de un gas

PRUEBAS BIOQUMICAS

PRUEBAS BIOQUMICAS COMUNES

1. IMVIC Indol Rojo de Metilo Voges Proskauer Citrato 2. Enzimticas Oxidasa Catalasa Coagulasa Ureasa 3. Reduccin Nitratos B-D Galactosidasa Descarboxilasa 4. Otras Agar TSI xido - Fermentativa o de Hugh-Leifson cidos y gases Hidrolisis Gelatina 5. ndice Analtico de Perfil 6. Enlaces externos

BIBLIOGRAFA
1. Granados P. Raquel, Microbiologa Tomo 1, 1 edicin 2002, Editorial Thomson Paraninfo, SA de CV, Mxico DF 2. Lansing M. Prescott, Microbiologa, 5 edicin, Editorial Mc Graw Hill, Mxico DF 3. Michael T. Madigan, Biologa de los Microorganismos, 10 edicin, Editorial Prentice Hall, Mxico DF 4. Patrick R. Murray, Microbiologa Medica, 5 edicin 2006, Editorial Elservier Espaa , SA de CV, Madrid Espaa