UNIVERSIDAD NACIONAL AUTNOMA DE MXICO FACULTAD DE QUMICA

Sntesis de carboxamidas bencimidazlicas y su evaluacin sobre la enzima triosafosfato isomerasa de Trypanosoma brucei y Trypanosoma cruzi

Junio

2013

Contenido
Antecedentes Planteamiento del problema e hiptesis Objetivos Metodologa, resultados y discusin Conclusiones

Antecedentes
Tripanosomiasis americana Trypanosoma cruzi

Tripanosomiasis africana humana Trypanosoma brucei

CDC/Dr. Mae Melvin

CDC

Distribucin: Continente Americano1 Ciclo biolgico : Hospederos vertebrado e invertebrado2 Vector: Triatoma infestans

Distribucin: frica subshariana3 Ciclo biolgico: Hospederos vertebrado e invertebrado4 Vector: Mosca del gnero Glossina

1.Schmunis, G., Yadon, ZE. (2010). Acta Tropica; 115: 14-21. 2. Tyler, K.M., Engman, D.M. (2001). International Journal for Parasitology; 31: 472-481. 3. Cattand, P., Jannin, J., Lucas, P. (2001). Tropical Medicine & International Health; 6: 348-361 4. Bhringer, S., Hecker, H. (1975). Journal of Eukaryotic Microbiology; 22: 463-467.

Antecedentes
Manifestaciones clnicas de las tripanosomiasis
Tripanosomiasis americana5 Fase Aguda Fase Indeterminada Fase Crnica

Megacoln Megacardias Megaesfago

Signo de Romaa-Mazza
Amastigotes multiplicndose dentro de la clula

Tripanosomiasis africana humana6 Fase Aguda Fase Crnica

Chancro tripanosomal

5. Brener, Z. (1973).Annual Review of Microbiology; 27: 347-382. 6. Enanga, B.et al.(2002). Cellular and Molecular Life Sciences; 59: 845-858.

 Control y tratamiento de las tripanosomiasis

Eliminacin de los insectos que fungen como vectores
Quimioterapia Tripanosomiasis africana humana Suramina9
O NH Na OS 3 HN
+

Antecedentes

Na OS 3

O NH CH3 O O NH NH H3C O

S 3O

Na

Tripanosomiasis americana Nifurtimox7

S3O Na NH

Melarsoprol11
H2N N
NH NH2

N N NH2

NH As S S

Pentamidina10
NH

OH

Benznidazol8

H2N O O

Eflortidina12
H2N HOOC CHF 2 NH2

7. Maya, J. et al. (2006). Comparative Biochemistry and Physiology 146(4): 601-620. 12. Fairlamb, A.H. (2003). Trends in Parasitology; 19(11): 488-494. 8. Apt, W., Zulantaya, I. (2011). Revista Mdica de Chile; 139: 247-257. 9. Vansterkenburg, et al.(1993). Acta Tropica; 54: 237-250. 10. Bray, P.G. et al. (2003). Trends in Parasitology; 19(5): 232-239. 11. Keiser, J..et al. (2000). ClinycalPharmacol ogy Theraphy; 67(5): 478-88.

Antecedentes Diseo de frmacos

Mtodos basados en el ligando

Diseo de frmacos asistido por computadora (DiFAC)13 Mtodos basados en el receptor

Acoplamiento molecular (docking)14

13. Bajorath, J. (2004). Nature Reviews Drug Discovery; 3: 935-949. 14. Halperin, I., Ma, B. (2002). Proteins; 47: 409-443.

Antecedentes

Desarrollo de frmacos tripanocidas

Bsqueda de blancos teraputicos
T. cruzi y T. brucei son organismos filogenticamente cercanos

Comparten numerosas dianas farmacolgicas

Va glucoltica

Antecedentes
Triosafosfato isomerasa como blanco teraputico
Triosafosfato isomerasa (TIM) enzima involucrada en la va glucoltica15

Homodmero de 54.2KDa 251 aminocidos.16 Barril /

15. Helfert, S. et.al. (2001).Biochemical Journal; 357:117-125 16. Lolis, E. et al. (1990). Biochemistry; 29(28): 301-310.

Antecedentes
TIM altamente conservada en humanos y tripanosomas
Diferencias en la interfaz del homodmero entre humano y tripanosomas18

Problemas de selectividad17

Desarrollo de frmacos selectivos

Se han probado compuestos como tiadiazinas, tiazoles, fenazinas19

Derivados del bencimidazol

17. Romo-Mancillas, A. et al. (2011). Journal of Molecular Graphics and Modelling; 30: 90-99. 18. Prez-Montfort, R. et al.(1999). Biochemistry; 38(13): 4114-4120. 19. Olivares-Illana, V. et al. (2006).. Biochemistry; 45(8): 25562560.

Antecedentes
Porcentaje de inhibicin y energa de unin de algunos compuestos evaluados sobre TcTIM17 Clave Estructura Porcentaje de inhibicin de TcTIM a 100M
N S N O CH3 CH3

Gunin TcTIM -6.78

O 2N S HN N

10

2
N

Cl O NH S
Cl O N S NH

N S N CH3 CH3

-6.14

3
O 2N

N S N CH3 CH3

29

-6.83

S HN O Cl N N S N
NO 2 S N N S N CH3 CH3

CMC-17

40
CH3

-5.85

CH3

CMC-19

HN O Cl

50

-6.74

S HN

N S N CH3 CH3

-7.13

Antecedentes

Los compuestos CMC-17 y CMC-19 presentaron un mayor porcentaje de inhibicin

S
NO 2

HN O Cl

N N S N CH3 CH3
HN O Cl

S N N S N CH3 CH3

Serie PYP
CH3 H3C
O N NH Cl N S N CH3
Cl N CH3 O
O

CH3 O O

O
N S N CH3 CH3

CH3

H3C

NH

N S

CH3

Cl

NH Cl

HN NH Cl

N S N CH3

CH3

O 2N

O N NH Cl N S N CH3 CH3

O O 2N O N NH Cl N S N CH3 CH3

Antecedentes

Adicionalmente los compuestos de la serie CMC tambin poseen actividad contra otros protozoarios como Entamoeba histolytica, Giardia intestinalis y Trichomonas vaginalis18 Por lo que es de inters evaluar la actividad de la serie PYP contra estos protozoarios

18. Mndez-Cuesta, C. (2005). Tesis de licenciatura. Facultad de Qumica. UNAM. Mxico D.F.

Planteamiento del problema

Falta de tratamientos eficaces

Compuestos con potencial efecto inhibidor

Tripanosomiasis

Informacin intralaboratori o

docking

DiFAC

Hiptesis
La serie PYP al ser anloga de la serie CMC, mostraran actividad inhibitoria en TcTIM
Los compuestos de la serie PYP tendrn actividad frente a TcTIM y

TbTIM debido a la semejanza estructural entre ellas En los estudios de docking se espera selectividad por la TIM de los protozoarios en comparacin con la TIM de humano Los compuestos con las mejores energias de afinidad sern los ms activos en el ensayo enzimtico Los compuestos de la serie PYP mostrar actividad contra los protozoarios Entamoeba histolytica, Giardia intestinalis y Trichomonas vaginalis

Objetivo General

Sintetizar y evaluar seis carboxamidas bencimidazlicas, designadas como PYP1, PYP2, PYP3, PYP4, PYP5 y PYP7, diseadas por estudios de acoplamiento molecular como inhibidores de la triosafosfato isomerasa de Trypanosoma cruzi y Trypanosoma brucei.

Objetivos Particulares
Determinar las constantes fsicas y caracterizar estructuralmente los compuestos finales. Realizar un estudio de acoplamiento molecular para determinar la afinidad de los compuestos de la serie PYP con las TbTIM, TcTIM y HsTIM Evaluar la actividad inhibitoria de las carboxamidas sobre las enzimas TcTIM y TbTIM. Estudiar, mediante docking, el modo de interaccin de los compuestos sobre las enzimas TcTIM y TbTIM. Determinar si los datos obtenidos con el estudio de docking correlacionan adecuadamente con los resultados de inhibicin enzimtica sobre la TbTIM y TcTIM. Evaluar la actividad antiprotozoaria de las carboxamidas sintetizadas contra Entamoeba histolytica, Giardia intestinalis y Trichomonas vaginalis mediante ensayos in vitro. Enriquecer la base de datos de compuestos antiparasitarios derivados del bencimidazol.

Metodologa
Parte qumica

Sntesis del intermediario 11 Sntesis de las carboxamidas PYP1, PYP2, PYP3 y PYP5 Sntesis de las carboxamidas PYP4 y PYP7

Prueba de determinacin de la actividad enzimtica de las enzimas TIM de Trypanosoma cruzi y Trypanosoma brucei

Parte biolgica

Prueba de determinacin de la actividad enzimtica de las enzimas TIM de Trypanosoma cruzi y Trypanosoma brucei

Parte computacional

Parte computacional
Obtencin de estructuras cristalogrficas

PDB Bsqueda de las enzimas

Maestro 9.3 Retirada de molculas de la solucin criognica

WHAT-IF correccin de estructuras

GROMACS optimizacin de la geometra

Preparacin de los ligandos

Spartan 10 Construccin de ligandos y optimizacin de geometra

Autodock 4.2 Deteccin de enlaces rotables y centros de torcin. Fusin de hidrgenos no polares

Parte computacional
Preparacin de las protenas Autodock Tools 1.5.4. Adicin de hidrgenos polares y correccin de cargas

Determinacin de la caja de bsqueda o grid Calculo de acoplamiento molecular de todos los ligandos 5x107 evaluaciones y 20 corridas Seleccin de las conformaciones energticamente ms favorables

Acoplamiento molecular

Resultados Parte qumica

Obtencin del cido 6-cloro-1-metil-2-metiltio-1H-bencimidazol5-carboxlico (11)

Obtencin de las carboxamidas finales PYP1, PYP2, PYP3, y PYP5.

Obtencin de las carboxamidas finales PYP4 y PYP7.

Resultados
Parte biolgica Ensayos de inhibicin enzimtica in situ en la enzima Triosafosfato isomerasa
En la tabla se muestran los resultados de la evaluacin inhibitoria de las carboxamidas
Compuestos % actividad inhibitoria TcTIM % actividad inhibitoria TbTIM

(200M)
PYP1 PYP2 PYP3 PYP4 PYP5 PYP7 0 0 4 0 16 5

(200M)
0 0 0 0 0 0

Los compuestos de la serie PYP tuvieron escasa o nula actividad a diferencia de los analogos CMC 17 y CMC 19 que presentaron actividad inhibitoria de 40 y 50% respectivamente

Podemos suponer que la principal limitante de la actividad sobre la enzima es la baja solubilidad de los compuestos de la serie PYP en las condiciones de la evaluacin.

Ensayos de susceptibilidad in vitro en protozoarios

Comparacin de las potencias observadas de los compuestos de la serie PYP
140 120 100 80 60 40

E. histolytica G. intestinalis T. vaginalis

1/CI50

20
0

Ensayos de susceptibilidad in vitro en protozoarios

E. histolytica: Todos los compuestos fueron superiores en potencia a los frmacos de referencia, siendo PYP5 el ms activo y PYP4 el de menor potencia G. intestinalis: Todos los compuestos resultaron superiores en potencia respecto al MTZ. Slo PYP5 y PYP3 fueron superiores a la NTZ T. vaginalis: Todos los compuestos resultaron superiores en potencia respecto a los frmacos de referencia, a excepcin de PYP3 siendo 1.5 y 3.3 veces menos activo que MTZ y NTZ respectivamente

Ensayos de susceptibilidad in vitro en protozoarios

PYP5 potente amebicida y giardicida. Posee una relacin estructural ms cercana a CMC-19
O 2N O N NH Cl N S N CH3 CH3

N O 2N S NH

O N S Cl N CH3 CH3

PYP5 G. intestinalis, CI50 = 0.0078 M PYP5 mayor potencia contra E. histolytica y G. intestinalis
N O 2N S H3C H3C O 2N O CH3 CH3 CH3 N H3C CH3 CH3 O 2N CH3

CMC-19 G. intestinalis, CI50 = 0.010 M

O O 2N O N NH Cl N S N CH3 CH3

PYP7 Elevada potencia contra T. vaginalis

Grupo nitro importante para la actividad biolgica

Parte computacional

Estudios de acoplamiento molecular (docking)

Energa de unin de los compuestos de la serie PYP y anlogos de importancia con la TIM de T. brucei, T.cruzi y H.sapiens
Compuestos G unin (kcal/mol)

TbTIM
PYP1 PYP2 PYP3 -5.93 -6.47 -6.54

TcTIM
-7.03 -7.10 -7.14

HsTIM
-6.81 -7.13 -6.97

PYP4
PYP5 PYP7 CMC17

-6.49
-7.31 -7.35 -5.75

-6.57
-7.07 -8.95 -7.51

-6.62
-7.80 -7.75 -6.38

CMC19

-7.23

-7.72

-7.85

Conclusiones
Se sintetizaron e identificaron las seis carboxamidas propuestas, designadas como PYP1, PYP2, PYP3, PYP4, PYP5 y PYP7.La formacin de las amidas se logr con rendimientos moderados va la formacin del cloruro del cido. La solubilidad de los compuestos finales dificult su purificacin. Los resultados de inhibicin enzimtica frente a las TIM de T. cruzi y T. brucei mostraron que las carboxamidas presentaron nula actividad para T. brucei y solamente PYP3, PYP5 y PYP7 presentaron una ligera actividad para T. cruzi. El compuesto PYP5 fue el ms efectivo, inhibi 16 % la actividad de TcTIM. El clculo de las energas de unin mostr que los compuestos no son selectivos hacia ninguna de las TIMs estudiadas, aunque se puede decir que son ligeramente ms afines por la TcTIM.

 El estudio de acoplamiento molecular sobre las enzimas TIM de T. cruzi y T. brucei demostr que la carboxamida PYP5, con grupo nitro en el anillo de piridina, tiene mejor interaccin con los residuos de la enzima, comparado con su anlogo activo PYP3 el cual no posee este grupo. A pesar de los valores de energa favorables encontrados para la unin, la nula o escasa actividad que presentaron los compuestos de la serie PYP para inhibir la TIM de los protozoarios, no es posible correlacionar los resultados obtenidos del estudio de acoplamiento molecular con los de la inhibicin enzimtica. La solubilidad de los compuestos fue un factor determinante que afect el ensayo de inhibicin enzimtica, por lo que el estudio de las propiedades fisicoqumicas de las molculas que se disea por DiFAC debe tomarse en cuenta.