Expo Lactobacilos

UNIVERSIDAD NACIONAL AUTNOMA DE MXICO FACULTAD DE ESTUDIOS SUPERIORES ZARAGOZA
Evaluacin biolgica y tecnolgica de tabletas conteniendo diferentes cepas de lactobacilos para administracin vaginal
Grupo: 2901 Microbiologa farmacutica
Introduccin
Recientemente se tiene un nuevo enfoque en la terapia y prevencin de infecciones del tracto urogenital en la poblacin femenina, mediante la restauracin de la flora normal vaginal.
Maggi, L., Mastromarinob P. Macchiab S., Brigidic P., Pirovanod F., Matteuzzic D, Conte U. Technological and biological evaluation of tablets containing different strains of lactobacilli for vaginal administration. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics 50 (2000).
Hay muchos patgenos importantes en la vagina, tales como: Neiserria gonorrhea Ureaplasma species Mycoplasma genitalium Streptococcus sp. Escherichia coli Chlamydia trachomatis Trichomonas vaginalis.
SrinivasanS., Fredricks N. The Human Vaginal Bacterial Biota and Bacterial Vaginosis. Interdisciplinary Perspectives on Infectious Diseases. 2008. Volume 2008 (2008)
La biota vaginal de una mujer sana est formada por diferentes especies de lactobacilos, tales como:
- Lactobacillus crispatus - Lactobacillus jensenii - Lactobacillus iners. Los lactobacilos promueven un ecosistema sano para producir cido lctico, perxido de hidrgeno y bacteriocinas que tienen propiedades antimicrobianas, disminuyendo el pH vaginal hasta 3.54.5. El peroxido de hidrgeno es bactericida frente a Gardnerella vaginalis.
Los lactobacilos coexisten con una multitud de otras especies, incluyendo a patgenos potenciales. Un trastorno de este balance podra ser un factor que lleve a una infeccin.
Se ha observado que hay un incremento en el pH (5) en mujeres que sufren una infeccin vaginal, por ejemplo; en una vaginosis bacteriana.
En mujeres con vaginosis bacteriana se tiene una prdida de lactobacilos y la adquisicin de una variedad de bacterias anaerbicas y facultativas.
Los cultivos de fluido vaginal con vaginosis bacteriana tpicamente muestran Gardnerella vaginalis y una mezcla de otras bacterias que pueden incluir: Prevotella Porphyromonas Mobiluncus Mycoplasma sp.
SrinivasanS., Fredricks N. The Human Vaginal Bacterial Biota and Bacterial Vaginosis. Interdisciplinary Perspectives on Infectious Diseases. 2008. Volume 2008 (2008)
La posibilidad de utilizar los lactobacilos para el mantenimiento de la salud femenina en el tracto urogenital se basa en la capacidad de los lactobacilos de producir una barrera, ya que estos podran inhibir la adhesin de microorganismos patgenos al epitelio vaginal.
Se tiene que prestar atencin al diseo y produccin de las formas farmacuticas para la administracin de clulas vivas, debido a que las suspensiones de bacterias muestran pobre estabilidad.
De acuerdo con estudios previos se diseo una nueva formulacin farmacutica de m.o. viables para el tratamiento y prevencin de infecciones del trato urogenital en mujeres. Esta forma farmacutica fue diseada para incrementar la adhesin de los microorganismos a la mucosa y para que haya una adecuada colonizacin en el epitelio vaginal.
Consiste en una tableta vaginal de doble capa, la cual combina una capa efervescente para la liberacin inmediata de una fraccin de la dosis y una capa para la liberacin lenta para incrementar el tiempo de residencia del m.o en el ambiente vaginal.
Material y Mtodo
Cepas y condiciones de cultivo Lactobacillus brevis (CD2), Lactobacillus salivarius (FV2, FV3), Lactobacillus crispatus (FV4), Lactobacillus gasseri (FV5, FV6, FV7, FV8, FV9, FV10).
o Se inocularon de viales congelados de Man-Rogosa-Sharpea a (- 80C) o Despus de 48 h de cultivo a 37C en condiciones anaerbicas fueron revisadas por la pureza y se subcultivaron en caldo MRS.
Produccin celular y preparados liofilizados

La produccin de lotes de CD2, FV2 y FV9, las cepas se cultivaron en un fermentador de 12 L equipado con identificador de pH. El conjunto del fermentador se trat previamente en autoclave a 121por 15minutos La temperatura del medio se ajust a 37C. El pH se ajust a 6,5 con NaOH al 30%. El controlador automtico de pH se ajust para mantener el medio de crecimiento a un pH de 6,5 con un neutralizador de NaOH 30%.
El medio se inocul con 500 ml de cultivo MRS, Se incubaron previamente durante 16 horas a 30C para CD2 y 16 horas a 37C para FV2 y FV9. Despus de 8 h de fermentacin, el fermentador se refriger y las clulas fueron cosechadas por centrifugacin durante 20 min a 6700 X g a 48C.
El sedimento se resuspendi en 50% en medio crioprotector El pH se ajust a 6,4 con NaOH al 30%. Los cultivos concentrados se liofilizaron a 25C
Formulacin farmacutica y produccin de tabletas

El polvo liofilizado se calibra a travs de una malla de 300 mm Se caracterizo el comportamiento delos polvos liofilizados de las 10 cepas evalundose: Densidad aparente Densidad de golpeado ligeramente ngulo de reposo.
Formulacin de tabletas
La formulacin diseada para una liberacin inmediata de los m.o. contiene una base granulada para mejorar el flujo de polvo, su capacidad y mezcla efervescente:
- El cido adpico y 85% de la cantidad total de almidn de maz se humedeci con 10%w / v de pasta de almidn. - Los grnulos se secaron en un horno de circulacin de aire 30C a peso constante. - Se aadi a los granulos bicarbonato de sodio, estearato de magnesio, cido ascrbico, cido esterico y dixido de silicio coloidal y se mezclaron durante 15 minutos
El polvo liofilizado se aado al final del proceso para evitar la exposicin de los m.o. a la etapa de humectacin y manipulaciones tcnicas excesivas
La formulacin de liberacin lenta se prepar mediante la mezcla en un aparato de Turbula durante 20 min Manitol Polmero retardante (HPMC, HPMC-HV o HPMC-LV) Talco Estearato de magnesio Microorganismos liofilizados
Se evaluaron tres tipos de polmeros: Dos hidroxipropilmetilcelulosa, una de baja viscosidad HPMCLV y una de alto grado de viscosidad, HPMC-HV. Un polmero de carboxivinilo (CP: Carbopol). Estos polmeros adems de mostrar propiedades bioadhesivas, tambin son capaces de hidratar y gel muy lentamente, debido a sus altos pesos moleculares y viscosidades, por esta razn, la tableta se disuelve durante un tiempo ms largo y proporciona una liberacin prolongada del ingrediente activo incrustado en la matriz polimrica.
Las eficiencias de los polmeros se ensayaron en trminos: De tiempo de desintegracin Su capacidad para mejorar la adhesin bacteriana in vitro de los lactobacilos. La prueba de tiempo de desintegracin se midi mediante la prueba de disolucin en el aparato USP 2 de paleta a 30 rpm en 400 ml de agua desionizada a 37 C.
Adems para cada cepa y la formulacin considerada, tabletas de una sola capa fueron producidos para verificar la viabilidad de la bacteria en cada capa por separado.
Para la fabricacin de los comprimidos vaginales se utiliz una tableta monopunznica que est equipada con punzones en forma de almendra. Para la forma de dosificacin final, que consiste en tabletas de doble capa, fue producido por capas en secuenciales de las dos formulaciones diferentes (de liberacin rpida y de liberacin lenta) .
Prueba de viabilidad y estabilidad de los lactobacilos

El polvo liofilizado y preparaciones farmacuticas se almacenaron en recipientes de plstico a 4-6 C y se examinaron por un perodo de 18 meses con el fin de establecer su estabilidad. El mtodo de dilucin en serie, en placas por duplicado en medio de agar Man-Rogosa-Sharp (MRS) , se utiliz para el recuento de lactobacilos totales.
Prueba de adhesin
Las clulas HeLa son un tipo particular de clulas de cultivo celular, usadas en investigacin cientfica. Es el linaje celular humano ms antiguo y utilizado con mayor frecuencia que derivan de una muestra de cncer crvicouterino obtenida en 1951.
a) Clulas Clulas HeLa fueron cultivadas en frascos (Falcon) en 5% de CO 2 a 37 C en medio mnimo esencial de Eagle, que contiene 6% de suero bovino fetal (FBS), 2 mM de glutamina, 100 UI / ml de penicilina G y 100 mg / ml de estreptomicina.
b) Preparacin de microorganismos para ensayo de adherencia Los lactobacilos se almacenaron a 4 C en forma de polvo liofilizado en condiciones anaerbicas hasta su uso. Antes de que el ensayo de adherencia, todas las cepas bacterianas se cultivaron en caldo MRS.
Se resembr en medio MRS y se incubaron a 37C en condiciones anaerbicas al 15% de CO2.
Los cultivos de lactobacilos se lavaron dos veces durante 10 min en solucin salina tamponada con fosfato pH 7.2.
Para los recuentos viables: Diluciones apropiadas de suspensin de lactobacilos se extendieron por triplicado en agar MRS. Las colonias se contaron despus de la incubacin de las placas a 37 C durante 48 h en condiciones anaerbicas. Para cada cepa, se estableci la correlacin entre la densidad ptica de diluciones de microorganismos y unidades formadoras de colonias (UFC).
c) Ensayo de adhesin La reaccin de adhesin se realiz en una placa de cultivo de tejido de 24 pocillos que contena un cubreobjetos estril en cada pocillo.
Un mililitro de la suspensin de clulas HeLa a una concentracin de 4,5 10 4 clulas/ml se sembraron en cada pocillo y se incubaron en un 5% de atmsfera de CO 2 a 37 C.
Despus de 48 h, las clulas, cultivadas se lavaron dos veces con solucin salina tamponada con fosfato pH 7.2. Se aadi una suspensin de 0,1 ml de lactobacilos (en MEM) a una concentracin de 5 109 lactobacilos/ml. Las placas se incubaron durante 1 h a 37 C bajo condiciones de microaerofilia para permitir la fijacin.
El medio que contiene las bacterias flotantes o planctnicas fue descartada y las monocapas se lavaron varias veces con solucin salina tamponada con fosfato pH 7.2. Se tieron con Giemsa durante 15 min, se lavaron de nuevo en agua y se secaron al aire.
Por microscopa se determin la presencia y el nmero de bacterias unidas a cada clula HeLa. Cada ensayo de adherencia se llev a cabo por duplicado y se evaluaron 500 clulas elegidas aleatoriamente para la adhesin de microorganismos.
ANLISIS DE RESULTADOS
1. Caracterizacin tecnolgica
Pobre flujo Angulo de reposo alto
Tiempo de desintegracin corto Disolucin adecuada
2. Viabilidad de cepas
Presentaron una alta viabilidad y estabilidad las cepas examinadas durante al menos 18 meses a 48 C
3. Adhesin de los lactobacilos a las clulas Hela
Cepas poco adhesivas Cepas adherencia intermedia
Todas las cepas de lactobacilos fueron capaces de adherirse a las clulas, exhibiendo diferentes grados en su unin a las membranas celulares

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Prueba de viabilidad y estabilidad de los lactobacilos

Se resembr en medio MRS y se incubaron a 37C en condiciones anaerbicas al 15% de CO2.

Pobre flujo Angulo de reposo alto

Tiempo de desintegracin corto Disolucin adecuada

3. Adhesin de los lactobacilos a las clulas Hela

Cepas poco adhesivas Cepas adherencia intermedia

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