Expresso, purificao e estudos do enovelamento de uma protena cicatrizante.

Grupo: Anna Beatriz Gonalves, Danilo Fagundes, Diego Vital, Gabriel Barreto, Gabriel Caetano, Patrcia Pinheiro, Pedro Corra e Thas Rodrigues.

Orientadora: Nathlia Varejo Sub-orientador: Pedro Tojal

So protenas que se ligam carboidratos, podendo ser encontradas em vegetais ou animais.

Legume lectins are central to the study of the molecular basis and specifity of protein-carbohydrate.
-Varejo ; Heterologous expression and purification of a biologically active legume lectin from Cratylia mollis seeds (CRAMOLL1)

Entre tantas outras funes, as lectinas apresentam ATIVIDADES CICATRIZANTES.

Por existir a interao carboidrato-protena, elas tambm mostram ter uma importante implicaes mdica para entendimento de (recombinao celular, adeso, propagao tumoral, infeco viral, infeco bacteriana e inflamao)

CRAMOLL 1 uma isolectina manose/glicose isolada da semente de Cratylia mollis.

Essa lectina tem 82% de sequncia idntica com a Concanavalin A (Con A) e 236 resduos.
Cramoll1 Concavalina A

Estrutura primria: Estrutura linear de aminocidos

Estrutura secundria:
Arranjo espacial. Estrutura estvel, cujas voltas so mantidas por ligaes de Hidrognio. Alfa-hlice e Folhas

Tabela I. Porcentagem de aminocidos na sequncia primria da pCRAMOLL

Estrutura terciria Conformao 3D No caso do monmero da Cramoll, so 2 Folhas antiparalelas (sentidos opostos).

Estrutura quaternria

So oligmeros formados a partir da associao das subunidades (monmeros).

Monmero da pCramoll 1

O pH influencia na representao de suas estruturas como: Em pH cido (5,0), apresentam-se como dmeros; Em pH neutro (7,0), apresentam-se como tetrmeros.

Dmero pCRAMOLL 1 Tetrmero pCRAMOLL1

A rCramoll1 a proteina expressada atravs da bactria. A lectina recombinante mantem as propriedades biofisicas da pCramoll1.

1) Expresso da protena 2) Purificao da protena a) Cromatografia por afinidade b) Dilise c) Eletroforese 3) Cromatografia por gel filtrao HPLC 4) Determinao da estrutura da protena a) Dicrosmo Circular b) Fluormetro c) Cross-link

Utilizao de rosetta DE-3 com bactria Escherichia Coli (E. Coli), com plasmdeo (PET 28-A) contendo a protena rCramoll 1 e gene resistente ao antibitico Kanamicina

Choque trmico
Pesar antibiticos e colocar diluente
Cloranfenicol (34g/ml) - Utilizado: 340 mg Kanamicina (50g/ml) - Utilizado: 500 mg

Colocar meio de cultura (1 ml) num eppendorf Colocar eppendorfs (Meio de cultura+rosettas) na estufa a 37C Preparar meio de cultura nas Placas. Colocar eppendorfs na Centrfuga por 6 min, a 6000 rpm, a 4C Semear bactrias no meio de cultura.

Disposio final das placas:

Transferir colnias da placa C para um meio de cultura lquido. Adicionar ao meio de cultura os antibiticos: Kanamicina e Cloranfenicol. Soluo deve ser colocada no Shaker a 37C para multiplicao overnight.

A frao do pr-inculo deve ser diluda -em proporo de 1:100- adicionando-se mais meio de cultura e ambos os antibiticos.
Preparar em dois erllen, para obter mais bactrias e assim mais da protena de interesse expressa. Colocar os inculos no novamente para multiplicao. Obs.: Uso do Bico de Bunsen Shaker a 37C

Como monitorar o crescimento das bactrias?

Densidade ptica (D.O.)
A Densidade ptica (D.O.) corresponde Absorbncia de uma amostra. A absorbncia a capacidade de um material absorver radiao em uma frequencia especfica e calculada pela expresso: A=.L.C Para medir a D.O. utilizamos o espectrofotmetro, que incidi um feixe de luz na amostra selecionada.

A D.O. necessria para super expressarmos a rCramoll de 0.8. So retiradas uma amostra de cada inculo para medir a absorbncia. Fazer isso at atingir 0.8. A D.O. com o tempo mais que suficiente para as bactrias se reproduzirem at o ponto que precisvamos ainda no tinha atingido o valor de 0.8, se mantendo em 0.05 de leitura. - Deixar os inculos over night no shaker a 15C.

PROBLEMA

SOLUO

Aps as 17h no shaker, a D.O. Passou de 0.8 e assim pode-se induzir a super expresso da rCramoll.

O IPTG um agente indutor que faz com que a reproduo e o metabolismo bacteriana se reduzam. A energia produzida pela bactria se concentra na sntese proteica. O IPTG adicionado aos inculos, e assim a rCramoll poder ser super expressa. Os meios com as bactrias devem voltar ao shaker a temperatura de 15C.
Obs.: a temperatura deve ser mantida a 15C pois reduz o metabolismo das bactrias e, devido ao choque trmico, favorecer a produo de Chaperonas HSP (Heat Shock Protein) que iro auxiliar no enovelamento da rCramoll.

Utilizamos a Lisozima nas bactrias.

Sonicao para destruir as bactrias e liberar as protenas.

Centrifugao das bactrias destrudas.

Microfiltrao com membrana de ster de celulose para ter certeza que no h bactria no sobrenadante.

Cromatografia por afinidade

Coluna de cromatografia Sephadex 75 com tampo PBS.

Utilizamos o espectrofotmetro para analisar se o no adsorvido saiu por completo.

Passar o tampo PBS com soluo de glicose 0,4 M para retirar a rCramoll1 da coluna.

Resultado da espectrofotometria.
2.5

Valor da densidade optica

1.5

Series1 1

0.5

0 0 5 10 15 20 25 30 35 40

Nmero da amostra

Dialise da rCramoll1 coletada

Dialise utilizada para retirar a glicose da rCramoll1. Utilizar membrana com poros que s passe a glicose (12 14 kDa) e tampo PBS.

Fazer eletroforese para confirmar que a protena que retiramos est pura. Deve ser colocado o gel running entre as placas de vidro para polimerizao, colocando aps isso corante (comassie blue coloidal) e deixar overnight.

Obs.: Como a RCramoll desenovelada tem mais ou menos 25 kDa, a faixa deve estar entre 17-28 kDa.

Peso Molecular:
1- 211,475 2- 118,579 3- 78,995 4- 53,045 5- 36,881 6- 28,643 7- 17,809 8- 6,435

1 2 3 4 5 6

7 8

25 kDa
PM A B C

A- no adsorvido da cromatografia B- pellet que foi para sonicao C- sobrenadante resultante da centrifugao D- amostra de rCramoll j purificada do laboratrio E- nossa amostra de rCramoll

O fluormetro utilizado para determinar a estrutura terciria da protena.

Emitindo fluorescncia em um comprimento de onda de 280nm que excita algumas molculas do contedo analisado.

O detector de fluorescncia fica em um ngulo de 90 em relao a luz para que a incidncia no seja to forte a ponto de dificultar a visualizao da fluorescncia emitida pela substancia.

A fluorescncia de volta em um comprimento de onda maior (entre 300 e 400 nm) pois liberam energia antes de refletir a luz incidida.

Grfico normalizado
1.2

1 Intensidade de fluorescncia (ua)

0.8

0.6

0M de ureia 3M de ureia

9M de ureia
0.4

0.2

0 0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 Comprimento de onda (nm)

Adiciona-se Gluteraldedo nos tubos 4, 5 e 6 que contm a rCramoll em quantidade crescente de ureia. Esse processo auxilia na determinao de estrutura quaternria ao favorecer as interaes entre monmeros (subunidades) da protena. A rCramoll um tetrmero em pH 7,0, logo, o seu peso molecular nesse estado dever ser por volta de 100 kDa. Adicionar TRIS depois de 30s da adio de gluteraldedo, pois a prxima etapa a fervura afim de desnaturar a rCramoll para correr no gel cross-link .

Obs.: Aminas livres nas protenas - N-terminal e de aminocidos polares carregados positivamente.

Ferver as amostras.

Preparar o gel de Cross-link para eletroforese

100 kDa

25 kDa
P M A B C

A- rCramoll + 0 M de ureia B- rCramoll + 3 M de ureia C- rCramoll + 9 M de ureia

Aps realizados todos os experimentos, conclui-se que a rCramoll1 considerada idntica protena retirada diretamente da planta Cratylia mollis, pois comprovou-se seu estado conformacional com folhas e a formao de dmeros e tetrmeros, caractersticos da Cramoll 1 .

 Nathalia Varejo por ter cedido o tempo e dedicao ao nosso grupo e trabalho. Ao Pedro Tojal pelo auxlio dentro e fora do laboratrio. Dbora Foguel por ter cedido o espao do laboratrio para o mini projeto Aos professores Franklin D. Rumjanek , rica Carvalho, Nathalia Alves, Jerson Silva e Andra de Oliveira.