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Deteccin de resistencia a quinolonas

Luis Martnez Martnez Servicio de Microbiologa Hospital Univ. Marqus de Valdecilla Dpto. Biologa Molecular. Univ. Cantabria Santander

Ncleo de las Fluoroquinolonas

GRAMNEGATIVE BACTERIA GENERAL STRUCTURE


Antimicrobial agent

Outer M.

LPS
Phospholipids
Porina

Periplasm

Peptidoglycan

-lactamase
Inner M.
Phospholpids

PBP

Cytoplasm

Dianas

Replicacin del DNA

Superenrollamiento del DNA

PREFERENCIA EN LA DIANA DE ACCIN DE LAS QUINOLONAS

1.- M. tuberculosis, Corynebacterium, H. pylori y T. pallidum Girasa como nica diana. 2.- Bacterias que contienen DNA girasa y topoisomerasa IVA 2.1.- Gram-: girasa como diana principal 2.2.-Gram+: topoisomerasa IV como diana primaria (...pero depende de la quinolona y de la especie)

MECANISMOS DE RESISTENCIA A QUINOLONAS Mecanismos de resistencia bacteriana: quinolonas 1. Disminucin de la concentracion intracelular
-permeabilidad reducida y/o -bombas de expulsin activas

2. Modificacin de la diana:
Cambios en las topoisomerasas

3. Proteccin de la diana:
Protenas Qnr

4. Inactivacin enzimtica
Acetilasa AAC 6 Ib-cr

DETECCIN DE GENES DE RESISTENCIA A bacteriana: QUINOLONAS Mecanismos de resistencia quinolonas


1. Disminucin de la concentracin intracelular
Gran complejidad de mecanismos Escaso inters para investigacin habitual Relevancia en estudios pormenorizados de mecanismos de resistencia

Es preferible realizar estudios fenotpicos:


SDS-PAGE: Anlisis de OMPs (porinas) Demostracin de expulsin activa

K. pneumoniae SDS-PAGE OMP


MW

66
LamB

45

36
29 24 20 14

Porinas OmpA

10S

10R

8R

Ardanuy et al, AAC 1998

Deteccin de secuencias de insercin en el gen ompK36 de K. pneumoniae

Deteccin de secuencias de insercin en el gen ompK36 de K. pneumoniae

EXPULSIN ACTIVA PRINCIPALES FAMILIAS

1. MFS: Major Facilitator Superfamily 2. RND: Resistance Nodulation-Division 3. SMR: Small Multidrug Resistance 4. ABC: ATP-Binding Cassette 5. MATE: Multidrug And Toxic Extrusion

SISTEMAS DE EXPULSIN ACTIVA

EXTERIOR

INTERIOR

EFECTO DE P.A.N. EN LA CMI DE LEVOFLOXACINO FRENTE A P. aeruginosa

CEPA

PAN CMI Levofloxacino+[PAN]


0 mg/L 10 mg/L 0,015 0,125 20 mg/L 0,008 0,03

WT nalB

>512 >512

0,125 2

nfxB
nfxC Mex(*)

>512
>512 32

2
4 0,015

0,125
0,25 0,015

0,03
0,06 0,008

Lomovskaya O et al, AAC 2001

PROPORCIONES DE LOS VALORES DE CMI DE NORFLOXACINO MS OTROS COMPUESTOS FRENTE A S. aureus

S. aureus 1199B NorA (+++)

S. aureus K1748 Exp. Act(+) NorA (-) 1 2 2 2 1

S. aureus K2068 Exp. Act.(+) NorA (-) 8 8 8 8 8

Reserpina Clorpromazina Flufenazina Tioridazina Cis(Z)-flupentixol

4 4 4 4 4

Kaatz GW et al, AAC 2003

ACUMULACIN DE NORFLOXACINO

acumulacin

K23

Mutante

Domnech-Snchez et al. Datos no publicados

SOBREEXPRESIN DE BOMBAS DE EXPULSIN ACTIVA

MUTACIONES EN GENES REGULADORES: acrR mexR mexT (Etc, Etc!)

Mar LOCUS

marC

marO

marR marA

marB

Mar Regulon

Activacin de genes relacionados con la resistancia a los antimicrobianos: AcrAB, micF (ompF)
Nakae, Microbiologa SEM, 1997 (Mod.)

DETECCIN DE GENES DE RESISTENCIA A QUINOLONAS Mecanismos de resistencia bacteriana: quinolonas


2. Modificacin de la diana:
Deteccin de mutaciones en los genes que codifican las topoisomerasas, en particular en las llamadas regiones QRDR (posiciones 51-106 de GyrA). Amplificacin y secuenciacin de la regin QRDR de: gyrA, gyrB: Cambios en la ADN girasa parC, parE: Cambios en la Topoisomerasa IV
En E. coli (y la mayora de enterobacterias), los cambios ms habituales ocurren en las posiciones 83 y 87 de gyrA y en las posiciones equivalente de parC. Las mutaciones en gyrB y parE tienen menor relevancia clnica La combinacin de mutaciones conduce a mayores niveles de resistencia.

Alelos que confieren resistencia a quinolonas (E. coli)

E. coli RESISTENCIA A FLUOROQUINOLONAS


STRAIN
I113 I114 I87 I237

CIP
0.015 0.06 2 16

gyrA
wt wt Ser83 Ser83

parC
wt wt wt wt

I250 I253

8 32

S83L D87G S83L D87G

S80R S80R

Everett MJ et al., AAC 1996

ACTIVIDAD DE QUINOLONAS MUTACIONES EN QRDR


GyrA Ser83...Asp87 Phe83 Tyr83 Phe83Gly87 Phe83Asn87 Ile/Arg80 ParC Ser80...Glu84 CIPRO <0.12 0.5-4 4-16 16->256 Ac. NAL. 4 >128 >128 >1024

Gly/Lys84

Alelos que confieren resistencia a quinolonas (Gram+)

RESISTENCIA A QUINOLONAS ORIGEN MULTIFACTORIAL

CEPA LB3 LB4

NORFLO 2 4

GyrA Tyr83 Tyr83

OMPs SI NO

Exp. Activa NO SI

CSUB10S CSUB10R

4 16

Phe83 Phe83

SI NO

NO SI

Martnez Martnez, 1996, 1998, 2003

MECANISMOS DE RESISTENCIA Mecanismos A de QUINOLONAS resistencia bacteriana: quinolonas


3. Proteccin de la diana: Protenas Qnr
QnrA, QnrB, QnrS Protenas de pentapptidos repetidos Genes codificados por plsmidos Relacionados con genes cromosmicos de otras bacterias Enterobacterias/Vibrionceas/Shewanella ....? Confieren bajo nivel de resistencia Entornos genticos complejos

SENSIBILIDAD DE K. pneumoniae C1, C2 y C3, E. coli J53 y P. aeruginosa PU21 CON/SIN pMG252

IDENTIDAD DE AMINOCIDOS (%) ENTRE GENES qnr Y GENES CROMOSMICOS RELACIONADOS Mecanismos de resistencia bacteriana: quinolonas

ENTORNO GENTICO DE qnrA, qnrB, qnrS Mecanismos de resistencia bacteriana: quinolonas

Deteccin de qnrA y genes relacionados en enterobacterias


PCR target intI1 Primer name Intn1 Intn2 IntI2-F IntI2-R HS-208 HS-207 341-A 341-B QP1 QP2 TEM-F TEM-R SHV-F SHV-R CTX-MU1 CTX-MU2 CTX-M9-F CTX-M9-R REP-1 REP-2 Primer sequence 5-GCG AAG TCG AGG CAT TTC TGT C -3 5-ATG CGT GTA AAT CAT CGT CGT AGA GA -3 5-TTA TTG CTG GGA TTA GGC -3 5-ACG GCT ACC CTC TGT TAT C -3 5'-TCA GCC GGG CGA CAA GTG CA -3' 5'-TGC ATG AAC AGG TAT AAC GG -3' 5'-CGC CCA CTC AAA CAA ACG -3' 5'-GAG GCT TTG GTG TAA CCG-3' 5-GAT AAA GTT TTT CAG CAA GAG G -3 5-ATC CAG ATC GGC AAA GGT TA -3 5'-ATG AGT ATT CAA CAT TTC CG -3' 5'-CTG ACA GTT ACC AAT GCT TA -3' 5'-GGG TTA TTC TTA TTT GTC GC -3' 5'-TTA GCG TTG CCA GTG CTC-3' 5'-ATG TGC AGY ACC AGT AAR GT -3' 5'-TGG GTR AAR TAR GTS ACC AGA -3' 5-GTG ACA AAG AGA GTG CAA CGG -3 5-ATG ATT CTC GCC GCT GAA GCC -3 5'-III-GCG CCG ICA TCA GGC-3' 5'-ACG TCT TAT CAG GCC TAC -3' Product size 767 bp 233 bp 1044 bp Reference Designed in our laboratory Goldstein et al. AAC. 2001 45: 723-6 Collis et al. JB. 2002 184:3017-26

intI2
intI3 orf513 qnrA blaTEM blaSHV blaCTX-M blaCTX -M-9 group REP-PCR

469 bp
543 bp 868 bp 931 bp 593 bp 857 bp variable size

Sabat et al. AAC. 2002 46: 2656 -61


Jacoby et al. AAC. 2003 47: 559-62 Rasheed et al. AAC. 1997 41: 647-53 Rasheed et al. AAC. 1997 41: 647-53 Pagani et al. JCM. 2003 41: 4264-9 Sabat et al. AAC. 2000 44: 1970-3 Vila et al. JMM. 1996 44: 482-9

Deteccin de qnrA y genes relacionados en enterobacterias


Group Isolate O-63 O-197 O-213 2312 2519 1108 1933 2252 2539 2982 2983 700 3384 3703 365 603 1013 Species C. freundii M. morganii M. morganii E. coli E. coli E. coli E. coli E. coli E. coli E. cloacae C. freundii E. coli E. coli E. coli E. coli E. coli E. coli Date of isolation 2/2004 3/2004 4/2004 9/2004 10/2004 5/2004 8/2004 9/2004 10/2004 11/2004 11/2004 2/2005 11/2004 12/2004 2/2005 2/2005 3/2005 Specimen urine urine urine urine urine urine sputum urine urine wound wound urine urine sputum ascitic fluid urine urine REP-pattern B A A E E F G F H D C I J K L M N IntI1 + + + + + + + + + + + + Result by PCR for: IntI2 IntI3 qnrA blaCTX-M ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND + ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND + + + + + + + + + + + + + +

Deteccin de qnrS en E. cloacae


SANTANDER
E. cloacae (N=118) 22 (18.6%) 0 (0%) 29 (24.6%) 58 (49.1%) E. aerogenes (N=22) 140 0 (0%) 22 (15.7%) 0 (0%) 0 (0%) 0 (0%) 29 (20.7%) 3 (13.6%) 61 (43.6%) E. cloacae (N=37) 0 (0%) 0 (0%) 2 (5.4%) 8 (21.6%)

SEVILLE
E. aerogenes (N=25) 62 0 (0%) 0 (0%) 0 (0%) 0 (0%) 0 (0%) 2 (3.2%) 2 (8%) 10 (16.1%)

qnrS qnrA orf513 intI1

isolates intI1 orf513 qnrA qnrS 15 + + 2 + + + 5 +

qnrS-positive isolates

Deteccin de qnrS en E. cloacae


REP-PCR

REP-PCR pattern Isolates number MIC nalidixic acid (mg/L) MIC ciprofloxacin (mg/L) Mutations in gyrA Mutations in parC

A
14 >256 (R)

B
4 8 (S)

C
2 8-16 (S)

D
1 >256 (R)

E
1 32 (R)

>32 (R) Ser83Ile (14) Asp87Asn (1)


Ser80Ile (2) Not done (12)

0.38 (S) None


Not done

2-4 (I/R) None


None

3 (R) Ser83Phe
Not done

1.5 (I) None


None

MECANISMOS DE RESISTENCIA A QUINOLONAS Mecanismos de resistencia bacteriana: quinolonas 4. Inactivacin enzimtica: Acetilasa AAC 6 Ib-cr
Origen plasmdico
N-acetilacin del grupo amino del radical piperacinil No compromete la actividad frente a aminoglucsidos

Afecta a ciprofloxacino y norfloxacino (pero no a otras FQ) Moderado incremento en la CMI Favorece la aparicin de mutantes ms resistentes

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