SENSIBILIDAD A LOS ANTIMICROBIANOS EN LAS BACTERIAS ANAEROBIAS

Liliana Fernndez Canigia San Luis- Agosto 2013

lfcanigia@labdl.com.ar 9/08/2013 L. Fernndez Canigia

Infecciones por bacterias anaerobias: Resistencia a los antimicrobianos

La penetracin del antibitico en el lugar de infeccin, la eficacia de los antibiticos frente a los mo aerobios. Dificultades en determinar la correlacin entre resistencia y evolucin clnica, por falta de identificacin y pruebas de sensibilidad

9/08/2013 L. Fernndez Canigia

Por qu hacer pruebas de sensibilidad para anaerobios?

Redondo et al: Bacteriemia por B. fragilis fue un predictor independiente de mortalidad en pacientes sometidos a ciruga intra-abdominal (RR: 4.9; 95% CI: 3.7-6.0; P = .009). Estudio controlado (Clin. Infect Dis , 1995) Nguyen et al. han demostrado. en un estudio prospectivo de bacteriemias por Bgf, relacin entre resistencia al tratamiento recibido y mayor mortalidad y persistencia microbiolgica (45% vs 16% p=0,03)(Clin. Infect Dis 2000)
9/08/2013 L. Fernndez Canigia

Por qu hacer pruebas de sensibilidad para anaerobios?

Se ha reportado resistencia a antibiticos considerados activos frente a bacterias anaerobias:

Metronidazol (Lancet 1978, Anaerobe 1995) Imipenem (Bandoh, 1993, Sub anaerobios 2011) beta-lactamicos+inhibidores (Sub. anaerobios, 2002, 2010) multirresistencia (Wareham, D. CID, 2005) 9/08/2013 L. Fernndez Canigia

CID, 2005

JAC, 2003

9/08/2013

L. Fernndez Canigia

Cundo hacer pruebas de sensibilidad para anaerobios?

Fines Clnicos

En situaciones de infecciones severas: bacteriemias refractarias a tratamiento, osteomielitis, SNC, focos endovasculares, etc. Frente a los microorganismos con resistencia conocida y/o reconocida patogenicidad (Bacteroides grupo fragilis, Prevotella spp., Clostridium spp., Fusobacterium spp). Aislamientos de microorganismos infrecuentes con perfiles de sensibilidad desconocidos.

Fines epidemiolgicos (vigilancia local y nuevos antimicrobianos)

9/08/2013 L. Fernndez Canigia

Primer consenso argentino para pruebas de sensibilidad en bacterias anaerobiasRAM, 2011- 43:51-66

Antimicrobianos tradicionalmente activos frente a bacterias anaerobias

- lactamicos: Penicilinas -lactmicos+ inhibidores de lac. Cefoxitina Carbapenemes Cloranfenicol Metronidazol Clindamicina Tetraciclinas
9/08/2013 L. Fernndez Canigia

Nuevos antimicrobianos con actividad frente a bacterias anaerobias

Nuevas quinolonas fluoradas: gatifloxacina, moxifloxacina (97,1%

actividad, Edmiston C, et al, AAC 2004, 65,5% Snydman et al AAC 2007) Ertapenem (99,1% actividad, Aldridge K, et al, D. Microb. Infect Dis. 2002) Tigeciclina (90% actividad, Bgf; Betriu C, JAC, 2005, 96%,Snydman et al AAC 2007, Subc. 100% actividad, 2012)

9/08/2013

L. Fernndez Canigia

Caracterizacin de -lactamasas en el grupo Bacteroides fragilis

Clase A de Ambler- grupo 2e: cefalosporinasa cromosmica, inhibible por c. clavulnico

cepA: 1993- Rogers, MB. - B. fragilis no activas frente a cefamicinas y carbapenemes. Prevalencia :70 a 90% de los aislamientos cfxA: 1993- Parker, AC y Smith, J.- B. vulgatus- Hidroliza lentamente cefoxitina Asociada al Tn4555 movilizable cblA: 1994- Parker, AC and Smith, J.- B. uniformis- similar a cepA- 3,7% de los aislamientos
9/08/2013 L. Fernndez Canigia

Caracterizacin de -lactamasas en Prevotella intermedia

1990- Appelbaum P. et al. 1998- Valle G. et al.-

Caracterizaron parcialmente las -lactamasas en esta especie utilizando extractos crudos: -lactamasas con mayor actividad sobre cefalosporinas que sobre penicilinas, inhibible por c. clavulnico

2001- Madinier I et al. Clonaron la enzima: Anlisis gentico y bioqumico

Describe el gen cfxA2 : 99% de identidad con cfxA de B. vulgatus La regin flanqueante downstream del gen cfxA2 presentaba homologa con el Tn4555 de B. fragilis. El perfil de hidrlisis indica una cefalosporinasa sin actividad sobre cefoxitina.

9/08/2013

L. Fernndez Canigia

-lactmicos: Mecanismos de resistencia

-lactamasas
Otros gneros Fusobacterium (<10%), Porphyromonas (8 a 17%) y algunos Clostridium spp no perfringens (no caracterizadas ): mucha menor proporcin de cepas productoras de lactamasas

9/08/2013

L. Fernndez Canigia

-lactmicos: Mecanismos de resistencia: Carbapenemasas

Clase B de Ambler - grupo funcional 3 de Karen Busch: metalocarbapenemasa, inhibible por EDTA No inhibible por c. clavulnico. Descripta en Bacteroides fragilis
Hidrolizan carbapenemes y todos los otros -lactamicos incluyendo cefamicianas Descriptas en Bf (Cuchural et al, 1986) cfiA: 1990- Rasmussen, BA. et al: B. fragilis -Esta enzima puede estar silente. La expresin depende de secuencias de insercin. 3% de los aislamientos Expresin: debido a SI que actan como promotores de la Ez: Transferible Infrecuente (Snydman et al, 2011, 1,1%-2,5%-n 1957; Betriu et al 2005, 0,7% -n 400, 4% Argentiina, 2010 (n=363)(AAC, 2012).
9/08/2013 L. Fernndez Canigia

-lactmicos: Mecanismos de resistencia Infrecuentes

Bombas de eflujo: sobre expresin:bmeB- (multidroga): resistencia a cefoxitina (JAC 2006) PLP de baja afinidad
Resistencia a cefoxitina y otras cefalosporinas en Bgf R en cocos gram-positivos anaerobios

Impermeabilidad
Recientemente estudiado en Bgf, Pophyromonas y fusobacterias. Deficiencias de OMP: R a cefoxitina
9/08/2013 L. Fernndez Canigia

Metronidazol: Propiedades y Mecanismo de accin

Difunde a lo tejidos incluyendo SNC El ATB con mejor actividad bactericida frente a anaerobios. No activo frente a bacilos gram-positivos NO esporulados: Actinomyces spp. , Propionibacterium spp. (< 25% de actividad) Pobre actividad frente a cocos anaerobios (70% de actividad)

9/08/2013 L. Fernndez Canigia

Metronidazol: Mecanismo de accin

Metronidazol

Piruvato ferrodoxin oxido-reductasa (POR) Metronidazol activo reduccin grupo NO-2 Compuestos intermediarios y radicales libres
9/08/2013 L. Fernndez Canigia

DNA

Metronidazol: Mecanismos de resistencia

Siete genes cromosomales o plasmdicos: nim A-G

5-nitroimidazol reductasa: Reduce nitroimidazol a aminoimidazol Asociados a elementos mviles CIM 2 - >32 g/ml (pueden deberse a IS)

Infrecuente (<0,1% a 4%) Snydman et al,

2007, 1/5225 aislamientos, Snydman et al 2011: 1/1957 aislamientos, Betriu et al, 2005, 0%, Katsandri A et al, 2006, 4%, Katsandri, 2007- 6,6% en Bgf, Fusobacterium, Prevotella spp.)
Lfmark S, 2005; Hecht, Anaerobe, 2006, Katsandri, 2007, Snydman 2011
9/08/2013 L. Fernndez Canigia

Mecanismos de resistencia a ATB no -lactmicos

Clindamicina (50S) (erm f) y tetraciclinas (30S): alteracin de los sitios de ataque ribosomales Quinolonas:

Alteracin del sitio blanco: Mutaciones en gyrA (DNA girasa)- R alto nivelTransferible Bombas de eflujo: > 1 bomba de eflujo. Quinolonas fluoradas y no fluoradas. (bmeB), (JAC 2006).
9/08/2013 L. Fernndez Canigia

Mecanismos de resistencia a ATB no -lactmicos

Cloranfenicol: Inactivacin de la droga (nitrorreduccin o acetilacin)

Aminoglucosidos: No puede ingresar a la clula- Carece del sistema de transporte.

9/08/2013

L. Fernndez Canigia

AAC, 2012, 56(3): 1309-14 Epub 2012, Jan 9

First National Survey of Antibiotic Susceptibility of the Bacteroides fragilis Group: Emerging Resistance to Carbapenems in Argentina
Fernndez Canigia, L. Litterio M, Legaria M.C., Castello L, Predari SC, Di Martino A, Rossetti A, Rollet R, Carloni C., Bianchini H., Cejas D., Radice M, Gutkind G, and th Anaerobe Surveillance Team Subcomisin de Bacterias Anaerobias- SADEBAC, AAM

Anaerobe Survillance Team: Bottiglieri, M (Crdoba, Crdoba), Rocchi M(Crdoba, Crdoba), Marquez, MI (Resistencia, Chaco), Machain M (Junn, Bs As), Mauro MC (San Genaro, Santa Fe), Nuez MR (Neuqun, Neuqun), Ballester D (CABA).

Objetivo

Materiales y mtodos

Determinar el patrn de sensibilidad a 10 antibiticos (ATB) de las especies de Bacteroides grupo fragilis (Bgf) aisladas de muestras clnicas de centros hospitalarios de Argentina.

Cepas: se incluyeron 363 aislamientos nicos y

consecutivos de Bgf procedentes de 17 centros de la Repblica Argentina, correspondientes al perodo 2006-2009: Bacteroides fragilis (198), Bacteroides thetaiotaomicron/ovatus (69), Bacteroides caccae (30), Bacteroides vulgatus (27) y otros Bgf (39).
9/08/2013 L. Fernndez Canigia

Materiales y mtodos: Puntos de corte (CLSI, 2007)

9/08/2013

L. Fernndez Canigia

RESULTADOS

9/08/2013

L. Fernndez Canigia

Porcentaje de sensibilidad de aislamientos de Bacteroides grupo fragilis frente a 10 antibiticos

% de sensibilidad
Microorganismo s (n) B. fragilis (198) B. thetaiotaomicron /ovatus (69) B. caccae (30) B. vulgatus (27) Otros B. grupo fragilis(39)
AMS TAZ CXT ERT IMI DOR CLI MET MOX TIG

97 87 90 74 87

99 99 100 96 97

83 49 63 81 62

96 90 95 97

99 99 100

97 97 96

75 42 63 67 51

100 100 100 100 100

90 90 87 81 79

99 100 97 100 95

100 100 100 100 100

AMS: ampicilina/sulbactama, TAZ: piperacilina/tazobactam, CXT: cefoxitina, ERT: ertapenem; IMI: imipenem; DOR: doripenem; CLI: clindamicina; MET: metronidazol; MOX: moxifloxacina; TIG: tigeciclina

9/08/2013

L. Fernndez Canigia

Microorganismos (n)

%S AMS TAZ

-lactmicos+ inhibidores
Ampicilina/sulbactama

B. fragilis (198) B. thetaiotaomicron /ovatus (69) B. caccae (30) B. vulgatus (27) Otros B. grupo fragilis(39)

97 87 90

99 99 100

74
87

96
97

Piperacilina/tazobactama

Porcentaje

CIM (ug/ml)

%S total: 92%
La lnea sobre los grficos indica el punto de corte de sensibilidad
9/08/2013

Porcentaje

CIM (ug/ml)

%S total: 99%
L. Fernndez Canigia

Frecuencia de distribucin de la CIM de Ampicilina-sulbactama en Bacteroides grupo fragilis en diferentes aos

100 90
Porcentaje de cepas

80 70 60 50 40 30 20
N:69 N:73 N:51 N:51 N:86

1986/87 1988/89 1990/92 1993/95 1997

10 0 0,1 0,25

0,5

CIM (ug/mL)

16

Bianchini, Anaerobe (1999) 5, 417-420

9/08/2013 L. Fernndez Canigia

% Sensibilidad Microorganismo s (n) B. fragilis (198) B. thetaiotaomicron /ovatus (69) B. caccae (30) B. vulgatus (27) Otros B. grupo fragilis(39)
ERT IMI DOR

Distribucin de las CIM de los tres carbapenemes de todas las especies

Imipenem

96 90 95 97
Ertapenem

99 99 100

97 97 96
CIM (ug/ml) Porcentaje

%S total: 99%

100 100 100 100 100

Doripenem

Porcentaje

CIM (ug/ml) CIM (ug/ml)

9/08/2013

Porcentaje

%S total: 96%

%S total: 98%

L. Fernndez Canigia

**Hospitales :1: Hospital de Pediatra Dr J. Garrahan, CABA , 2: Hospital Nacional de Clinicas, Crdoba, Cordoba 3: Hospital E. Torn, CABA, 4: Hospital Alemn, CABA; 5: HIGA Dr. A Piero, Junn, Buenos Aires. IMI: imipenem, ERT: ertapenem, DOR: doripenem

9/08/2013

L. Fernndez Canigia

Cefoxitina
70 60
% Resistencia

50 40 30 20 10 0 1ro. 2do. 3ro. 4to

Perodos
60
50
% Resistencia

Bf Bfnf

Cefoxitina y Clindamicina:
variacin de la resistencia a travs de los aos

Clindamicina
Bf

Perodos 1ro.: 1989-1991- Nro. cepas: 53*

40
30
Bfnf

20
10

2do.: 1996-1998- Nro. cepas: 82*

3ro.: 1999-2000 - Nro. cepas: 65* 4to: 2006-2009- Nro cepas 363
0
1ro. 2do. 3ro. 4to

Perodos

*Susceptibility trends of Bacteroides fragilis group isolates from Buenos Aires, Argentina Subcomisin de Anaerobios, RAM(2007), 39:156-160. ISSN 0325-7541- Bf: B. fragilis; Bfnf: Bacteroides grupo fragilis no fragilis 9/08/2013 L. Fernndez Canigia

Moxifloxacina: distribucin de la CIM y % sensibilidad por especie

Moxifloxacina

Microorganismos (n)

%S
90 90 87 81 79

B. fragilis (198)
Porcentaje

B. thetaiotaomicron /ovatus (69) B. caccae (30) B. vulgatus (27) Otros B. grupo fragilis(39)
CIM (ug/ml)

%S total: 91%
9/08/2013 L. Fernndez Canigia

Metronidazol y Tigeciclina: distribucin de las CIM y porcentaje de

sensibilidad global

Metronidazol

Tigeciclina

100% S
Porcentaje Porcentaje

100 % S

CIM (ug/ml)

CIM (ug/ml)

9/08/2013

L. Fernndez Canigia

Discusin y conclusiones

En este relevamiento se detectaron los primeros 4 aislamientos resistentes a los carbapenemes IMI, ERT y DOR (CIM: 16->64 g/ml) descriptos en nuestro pas, 3 de la CABA y 1 de Crdoba. En tres aislamientos se observ inhibicin por el EDTA 0,4 mM, fenotipo que sugiere la presencia de una metalo-lactamasa Clase B, grupo 3 de K. Bush, mecanismo descripto para estas especies (cfiA). Los tres aislamientos fueron resistentes a AMS y dos resistentes a TAZ. El cuarto aislamiento correspondi a B. thetaiotaomicron/ovatus que no present inhibicin, indicando probablemente otro tipo de mecanismo. IMI fue el carbapenem ms activo.
9/08/2013 L. Fernndez Canigia

DISCUSIN Y CONCLUSIONES

TAZ mantuvo buena actividad, aunque es la primera vez que se observa resistencia a esta combinacin lactmico-inhibidor de -lactamasa en nuestro medio. AMS mostr la mayor actividad frente a la especie B. fragilis; B. vulgatus es la especie que mostr la mayor resistencia. MET y TIG fueron los ATB no -lactmicos ms activos. Todos los aislamientos resultaron sensibles a ambos ATB La actividad de MOX vari segn la especie. FOX y CLI fueron los antibiticos menos activos como fue observado en estudios previos.
9/08/2013 L. Fernndez Canigia

CONCLUSIONES
El hallazgo de aislamientos de Bgf resistentes, particularmente a IMI, TAZ y AMS, determina la necesidad de relevamientos peridicos para guiar los tratamientos empricos.

9/08/2013

L. Fernndez Canigia

ACTIVIDAD IN VITRO DE 10 ANTIMICROBIANOS FRENTE A BACTERIAS ANAEROBIAS ESTUDIO MULTICENTRICO, 1999-2002

Litterio M, Bianchini H, Carloni G, Castello L, Di Martino A, Fernndez Canigia L, Greco G, Legaria C, Rollet R, Rossetti A y Predari S.
Subcomisin de Bacterias Anaerobias. SADEBAC-AAM. Buenos Aires. Argentina

Rev. Argentina de Microbiologa (2004) 36:130-135

9/08/2013 L. Fernndez Canigia

Resistencia de 166 cepas de bacterias frente a 10 ATB

Subcomisin de Bacterias Anaerobias, SADEBAC-AAM
Antibioticos

Especies
AMP AMS CXT

(% I + R)
CRO IMP PIP TAZ AZI CLI MTZ

Pre (21) Por (10) Fu (26)

52 0 12

0 0 0

0 0 4

0 0 0

0 0 0

0 0 0

0 0 0

18 0 52

5 10 4

0 0 0

C spp (12)
CGP (22)

25
14

0
4

0
0

8
0

0
0

0
0

0
0

73
59

25
4

0
0

Pre: Prevotella spp.; Por: Porphyromonas spp.; Fu: Fusobacterium spp.; Cd: Clostridium difficile; Cspp: Clostridium spp.; CGP: cocos gram-positivos. AMP: ampicilina, AMS: ampicilina sulbactama, CXT: cefoxitina; CRO: ceftriaxona; IMI: imipenem; PIP: piperacilina; TAZ: piperacilina-tazobactama; AZI: Azitromicina; CLI: clindamicina; MTZ: metronidazol.

Rev. Argentina de Microbiologa (2004) 36:130-135

Resistencia de 166 cepas de bacterias frente a 10 ATB

Subcomisin de Bacterias Anaerobias, SADEBAC-AAM
Antibioticos

Especies
AMP AMS CXT

(% I + R)
CRO IMP PIP TAZ AZI CLI MTZ

Pre (21) Por (10) Fu (26)

52 0 12

0 0 0

0 0 4

0 0 0

0 0 0

0 0 0

0 0 0

18 0 52

5 10 4

0 0 0

C spp (12)
CGP (22)

25
14

0
4

0
0

8
0

0
0

0
0

0
0

73
59

25
4

0
0

Pre: Prevotella spp.; Por: Porphyromonas spp.; Fu: Fusobacterium spp.; Cd: Clostridium difficile; Cspp: Clostridium spp.; CGP: cocos gram-positivos. AMP: ampicilina, AMS: ampicilina sulbactama, CXT: cefoxitina; CRO: ceftriaxona; IMI: imipenem; PIP: piperacilina; TAZ: piperacilina-tazobactama; AZI: Azitromicina; CLI: clindamicina; MTZ: metronidazol.

Rev. Argentina de Microbiologa (2004) 36:130-135

Resistencia de 166 cepas de bacterias frente a 10 ATB: Gram-positivos

Subcomisin de Bacterias Anaerobias, SADEBAC-AAM
Antibioticos Especies
AMP AMS CXT

(% I + R)
CRO IMP PIP TAZ AZI CLI MTZ

Cd (10) C spp (12) CGP (22)

100 25 14

0 0 4

90 0 0

90 8 0

50 0 0

0 0 0

0 0 0

90 73 59

70 25 4

0 0 0

Cd: Clostridium difficile; Cspp: Clostridium spp.; CGP: cocos gram-positivos. AMP: ampicilina, AMS: ampicilina sulbactama, CXT: cefoxitina; CRO: ceftriaxona; IMI: imipenem; PIP: piperacilina; TAZ: piperacilina-tazobactama; AZI: Azitromicina; CLI: clindamicina; MTZ: metronidazol.

Rev. Argentina de Microbiologa (2004) 36:130-135

Conclusiones: Anaerobios
El conocimiento del genero y/o la especie permite predecir la sensibilidad de un aislamiento de una muestra clinica. Evaluar la necesidad de realizar pruebas de sensibilidad en aislamientos clnicos individuales

9/08/2013

L. Fernndez Canigia

Bacterias Anaerobias
Mtodos de sensibilidad
Dilucin en agar
Microdilucin en caldo

Elucin en caldo con disco

E-test
Deteccin de -lactamasa
9/08/2013 L. Fernndez Canigia

Dilucin en agar
Mtodo de referencia NCCLS 2001/CLSI 2007

Da valor de CIM Crecen TODOS los microorganismos Se prueban muchas cepas por vez Laborioso Difcil lectura
9/08/2013 L. Fernndez Canigia

Dilucin en agar
MEDIO
agar Brucella 5 g/ml hemina 1 g/ml vitamina K1 5% sangre ovina lacada 105 UFC/ml

INOCULO FINAL

INCUBACION anaerobiosis 37C x 48 horas

PUNTO FINAL
completa inhibicin o la ms significativa reduccin del crecimiento con respecto al control

9/08/2013

L. Fernndez Canigia

Dilucin en agar: Lectura

9/08/2013

L. Fernndez Canigia

Microdilucin en caldo
Mtodo alternativo NCCLS 2001/CLSI 2007
Caldo Brucella suplementado + sangre lisada de caballo + diluciones de ATB
Da valor de CIM Varios ATB por vez Sensibilidad aislamientos clinicos Difcil lectura SOLO para B. grupo

fragilis
9/08/2013

L. Fernndez Canigia

Microdilucin en caldo
MEDIO
caldo Brucella 5 g/ml hemina 1 g/ml vitamina K1 5% sangre lisada de caballo 106 UFC/ml 105 UFC/pocillo

INOCULO

INCUBACION anaerobiosis 37C x 48 horas

PUNTO FINAL

completa inhibicin o la ms significativa reduccin del crecimiento con respecto al control

9/08/2013

L. Fernndez Canigia

Microdilucin en caldo: Lectura

9/08/2013

L. Fernndez Canigia

E- test
Medio: Agar Brucella suplementado Inculo: Tubo 1 Mc Farland Fcil Crecen TODOS los microorganismos Sensibilidad aislamientos clnicos Elevado costo Difcil lectura
9/08/2013 L. Fernndez Canigia

Elucin en caldo con disco

Fcil, econmico y rpido No da valor de CIM No lo recomienda el CLSI Subcomision anaerobios: 100 cepas de anaerobios 98,5% de concordancia con el mtodo patrn. Discrepancias totales 1,5% Errores very mayor: 0,5% Mtodo screening
9/08/2013 L. Fernndez Canigia

Elucin en caldo con disco

caldo BHI 5 g/ml hemina MEDIO 1 g/ml vitamina K1 0,5% extr. levadura discos de antimicrobianos en 5 ml de medio concentracin = punto de corte

INOCULO

0,1 ml suspensin 0,5 McFarland anaerobiosis 37C x 48 horas

INCUBACION
LECTURA

S, tubo lmpido R, cualquier grado de turbidez

de crecimiento de esterilidad de contaminacin con aerobios
9/08/2013 L. Fernndez Canigia

CONTROLES

Metodologa recomendada por el CLSI (exNCCLS) 2001- M11A5/CLSI 2007Dilucin en agar: mtodo de referencia Microdilucin en caldo: para Bacteroides grupo fragilis Deteccin -lactamasa (nitrocefn): en microorganismos anaerobicos NO pertenecientes a B. grupo fragilis E-test: sugerido

9/08/2013 L. Fernndez Canigia