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BIOTECNOLOGIA EN INMUNOLOGIA CLNICA

Dr. Martin Villarroel Mareo


Doctorando Inmunologa Experto en Docencia Universitaria
UAH - Alcal de Henares, Espaa

Instituto Boliviano de oncohematologa Paolo Belli. Laboratorio de Biologa Celular


Facultad de Medicina. Universidad Mayor de San Andrs. La Paz - Bolivia

Plan de la clase
Tecnologa de anticuerpos
1. Uso de los anticuerpos en el laboratorio: inmunodiagnstico 2. Uso clnico de los anticuerpos: inmunoterapia 3. Produccin de anticuerpos para uso clnico y diagnstico

1. Usos diagnsticos y teraputicos de los anticuerpos


Tcnicas analticas/diagnsticas: miden generalmente fuera del organismo por tcnicas "in vitro" algn parmetro
ELISA enzima inmunoensayo mediadores, seropositividad WESTERN inmunoelectroforesis de protenas, inmunodeteccin IMMUNOHISTOQUIMICA, biopsias, anatoma patolgica NEFELOMETRIA turbidometra, Ig sricas CITOMETRIA DE FLUJO Diagnstico de leucemias

Tcnicas teraputicas: diseadas para curar.


Tratamiento antineoplsico destruccin clulas tumorales Tratamientos antiinflamatorios. Neutralizacin de mediadores proinflamatorios

1. Uso de anticuerpos en el laboratorio


Fundamento: Pueden ser utilizados como nanoherramientas capaces de reconocer especficamente y a las que nosotros podemos sujetar, localizar o medir. 1. Especificidad en el reconocimiento aportada por la regin 1. Ag. Fab del anticuerpo.
3.

2.

2. Posibilidad de marcaje: radioactivo, enzimatico, fluorescente, con puente biotina-avidina. Deteccin y medida. 3. Unin a soportes (magnticos o de plstico) por regin Fc. Separacin y purificacin molecular y celular.

Cuantificacin de antgeno
Miden analitos mediante anticuerpos especificos unidos a isotopos radioactivos (RIA) o a enzimas (ELISA),

comparan con una curva estndar con concentraciones


conocidas de la sustancia problema. ELISA o RIA competitivo. Antgeno pegado. El antgeno de la muestra inhibe la unin de un anticuerpo indicador al antgeno pegado al pocillo. ELISA o RIA sandwich. 1er anticuerpo pegado captura antgeno segundo anticuerpo indicador unido a enzima o radiomarcado reconoce otro determinante del antgeno.

Identificacin, purificacin y caracterizacin de antgenos proteicos


Inmunoprecipitacin 1. Se solubilizan proteinas celulares con detergentes 2. Se usa un anticuerpo especifico para precipitar una protena, 3. Se lava y as se la separa de las otras sustancias. 4. Se libera el antgeno por cambio de pH que reduce la afinidad de la unin Ab-Ag. Estudios de coinmunoprecipitacin +western. Estudio de complejos moleculares.

Identificacin, purificacin y caracterizacin de antgenos proteicos


Western e inmunoblot 1. Separacin analtica por electroforesis en gel de (SDS)-poliacrilamida separa protenas por su peso molecular 2. Son transferidas a un filtro poroso por capilaridad. 3. Las protenas son reconocidas por anticuerpos radiomarcados o unidos a enzimas.

Identificacin, purificacin y caracterizacin de clulas


Citometra de flujo. La expresin de antgenos es medida en cada clula hacindolas pasar de una en una por delante de un haz de luz, anticuerpos marcados fluorescentes son utilizados como molculas indicadoras. Marcaje de superficie celular Marcaje intracelular Marcaje de clulas secretoras

Localizacin del antgeno en tejidos o clulas


Inmunofluorescencia Anticuerpos fluoromarcados en
microscopia ptica. estructuras no marcadas no se ven, dificultando la localizacin precisa del marcaje fluorescente. Citometra Lser de barrido ilumina con lser, lee fluorescencia a varios colores

Inmunohistoqumica: Utilizacin en microscopia ptica de


anticuerpos unidos a enzimas que producen compuestos coloreados e insolubles que precipitan en la posicin del ag . Microscopia inmunoelectrnica: Utiliza anticuerpos unidos a compuestos electrodensos, como el oro coloidal.

Localizacin del antgeno en pacientes


Inmunoresonancia marcaje con anticuerpos unidos a

sustancias con propiedades de conservacin de spin


caracteristicas Inmuno scanner radiolgico marcaje de anticuerpo con compuestos radio-opacos InmunoPET. Marcaje con anticuerpos sustancias emisoras

de positrones.
Inmunoliposomas permiten marcar anticuerpos con casi cualquier cosa

Uso de anticuerpos para separacin celular.


Mtodos de fase slida Fijacin de anticuerpos por su regin Fc a una fase slida.
Panning Fijacin de anticuerpos a plstico. Clulas portadoras del antgeno se unen al soporte. lavado y separacin mecnica o qumica. MACS (Magnetic Activated Cell Sorting) Anticuerpos unidos a micropartculas magnticas son retenidos en una matriz ferromagntica (fase slida) cuando se aplica un campo magntico. Clulas portadoras del antgeno se unen al soporte. lavado y elucin por eliminacin del campo magntico.

Mtodos fluorescentes inteligentes


FACS (Fluorescence Activated Cell Sorting) anticuerpos unidos a compuestos fluorescentes son reconocidos en la superficie de cada clula. Clulas de los fenotipos seleccionados son reconocidas una a una y separadas en funcin de las combinaciones de parmetros seleccionados. Aplica un campo elctrico que desva trayectoria de cada de la clula hacia el contenedor de fraccin deseado. Se pueden clonar clulas de caractersticas especficas.

2. Terapia con anticuerpos monoclonales from magical bullets to smart bombs


La idea era de principios del siglo XX Tecnologa anticuerpos monoclonales 1975. Nobel a un Posdoc Kohler Limitaciones de anticuerpos murinos
Vida media corta en humanos No interaccionan ptimamente con sistemas efectores humanos Estimulan formacin de anti-anticuerpos (reacciones anafilcticas)

Anticuerpos humanizados 200 anticuerpos distintos en pruebas clnicas y a diferencia de antiangiognicos estn funcionando en terapia antitumoral. Estimulan activacin complemento, ADCC, fagocitosis.

2. Uso teraputico de los anticuerpos


Radioconjugados
Fsforo, Estroncio, Yodo, Ytrio I-antiCD45 leucemias mieloides agudas Zevalin antiCD20 de ratn vida corta Itrio 90 emisinb Bexxar antiCD20 de ratn Iodo131

Quimioconjugados
AntiCD33 Mylotarg conjugado con chaleomicina (CMA-676) produce especies altamente reactivas que daan el DNA e inducen apoptosis. Se emplea en leucemias mieloides agudas. El antgeno CD33 se endocita al ser reconocido por el anticuerpo anti CD33. AntiCD22 Conjugados con RNAsas se experimentan en linfomas.

Anticuerpos puros
AntiCD40 induce AICD en linfomas. AntiCD20 mata clulas de linfomas y leucemias (depende de polimorfismo Receptores Fc).

Anticuerpos sin conjugar


Terapia antitumoral selectiva
1999 AntiCD20 Rituximab para linfomas y Leucemias de clulas B 2001 Anti CD52 Campath 1H tumores de clulas B, enfermedad mnima residual, rechazo de rganos e injerto contra husped, enfermedades autoinmunes

Eliminacin de clulas indeseables de inculos para trasplante de mdula sea.


AntiCD3 OKT-3 Purgado de linfocitos T de inculos alognicos anti-CD3 Purgado de clulas tumorales de inculos autlogos.

Conjugados con partculas magnticas


AntiCD34 para purificacin de clulas madre hematopoiticas (CD34+) por seleccin inmunomagntica. Permite purificar clulas madre a partir de sangre perifrica.

Antagonistas de citocinas
Anticuerpos anticitocina Anti-TNFa Infliximab
Neutralizan mediadores proinflamatorios Tienen un efecto drstico efecto antiinflamatorio Se usan en Enfermedad de Chron, Artritis reumatoide.

Receptores solubles de TNF Etanercep


Tambin neutralizan TNF pero tienen vida ms corta.

Quimeras con regin Fc. IgG. alargan vida media del receptor soluble

3. Produccin de anticuerpos
1. Obtencin de antisueros (anticuerpos policlonales)

2. Sntesis de anticuerpos monoclonales


3. Reduccin de su inmunogenicidad. Sntesis de anticuerpos quimricos

Obtencin de antisueros (anticuerpos policlonales)


Uso diagnstico En terapia antisueros antitetnicos
VENTAJAS: de bajo coste rpido y

INCONVENIENTES: Reproducibilidad limitada, cantidad limitada de Ab.

Sntesis de anticuerpos monoclonales Kohler G. Y Milstein C. (Nature, 1975).


-VA: parenteral, intramuscular... -DOSIS: 3/4 inculos -ADYUVANTES Y CARRIERS. - PROTENA - PLSMIDO - CLULAS
PROTENAS VIRALES MTODOS ELECTRICOS

CEPA: BALB/c, Y3

CEPAS: P3/x63.Ag8.653, NSI/0, NSI/1

- DILUCIN - AGAR

ELISA, IFI, RIA, WESTERN, INMUNOCITOQUMICAS, FACS.......

Problemas para el uso teraputico inmunogenicidad de los anticuerpos xenognicos

Disminucin de la Inmunogenicidad de los anticuerpos


1. Anticuerpos xenognicos
Estimulan la formacin de antianticuerpos Regiones variables murinas Regiones constantes humanas funciones efectoras Reemplazo de regiones armazn originales del domino variable por otras humanas para disminuir todava ms la inmunogenicidad.

2. Anticuerpos quimricos

3. Anticuerpos humanizados

Sntesis de anticuerpos quimricos Morrison et al.(PNAS, 1986 ) y Boulianne (Nature, 1984).

Variantes biotecnolgicas
Quimeras con regin Fc. alargan vida media de la molcula asociada Anticuerpos biespecficos. Inmunopartculas biespecficas Inmunoliposomas liposomas recubiertos de anticuerpos monoclonales letales como transportadores de sustancias toxicas intracelulares ej. RNAasas

El toque humano ha permitido el uso clnico


Anticuerpos quimricos (1995-) V murina C humana
Simulect rechazo Remicade Infliximab Crohn, AR

Humanizados HVR murina FR humana C humana


Zenapax (1997) (CD25) Herceptin (1998) cncer de mama metasttico que expresa EGF receptor Campath (2001) antiCD52 Xolair Omalizumab(2003) anti IgE asma alrgica Efalizumab (2004) psoriasis 200 tipos ms estn actualmente utilizndose en ensayos clnicos en humanos.

Citometria de flujo

Ejemplo de aplicacin de la citometria de flujo. Inmunofenotipo en mieloma mltiple y evaluacin de la EMR

VALORACION DE RESPUESTA CELULAR

Hemos aprendido
1. Mtodos de uso de los anticuerpos en el laboratorio 2. Posibilidades de uso clnico de los anticuerpos en inmunoterapia 3. Tecnologas de produccin de anticuerpos para uso clnico y diagnstico