UNIVERSIDADE FEDERAL DO PAR CURSO DE MEDICINA MGAII- REUMATOLOGIA

LUPUS ERITEMATOSO SISTMICO

Profa. Ftima Lobato Sauma Julho/2013

DEFINIO Doena autoimune, mltissistmica, inflamatria, crnica, etiologia desconhecida, exacerbaes e remisses, diferentes manifestaes clnica
DCruz et al., 2007 .

EPIDEMIOLOGIA

Distribuio universal

Incidncia: 1 a 10/100.000/ano
Pons-Estel et al., 2010

Prevalncia: 15 a 50/100.000 hab. EEUU

Hahn, 2010

8,7/100.000 hab. - Brasil/Natal

Vilar e Sato, 2003

EPIDEMIOLOGIA

Sexo: /= 9:1
Klippel e Dieppe, 1998

Idade de incio: 16-55 anos 65% 16a < 20% 55a > 15%
Russ et al., 2001

Raa: Negra
Cooper et al., 1998; Hochberg,1990

Pior prognstico: Raa Negra Sexo masculino Acometimento na infncia Baixo nvel scio-econmico Plaquetopenia e nefrite

ETIOPATOGENIA

HORMNIOS Mulheres

Predisposio gentica HLA-DR3 HLA-DR2

VRUS EBV, CMV, Parvovrus19

RAIOS UV Luz solar

DROGAS Hidralazina, procainamida, isoniazida, popiltiuracil, anti-TNF

LES

MANIFESTAES CLNICAS

ALTERAES LABORATORIAIS

Hemograma:
- Anemia - Leucopenia - Plaquetopenia Provas de fase aguda VHS, PCR, EFP Provas Imunolgicas - FAN - Anti-DNA - Anti-Sm - Anti-histona - Anti-SSA/Ro - Anti-SSB/La - Anti-cardiolipina - Anti-cardiolipina -VDRL - anti-coagulante lpico -Complemento srico baixo: CH50, C3 e C4

CRITRIOS DE DIAGNSTICO (ACR)

1. Eritema malar 2. Leso discide 3. Fotossensibilidade 4. lceras orais ou nasofaringeanas 5. Artrite no erosiva 6. Serosite (pleurite e/ou pericardite) 7. Renal (proteinrias > 0,5 g/d e/ou cilindrria) 8. Neurolgicas (convulses e/ou psicoses) 9. Hematolgicas: anemia hemoltica, leucopenia < 4.000 e plaquetopenia 10. FAN > 1:80 11. Imunolgicos: DNA, anti-Sm, VDRL, complemento baixo
Diagnstico: 4 critrios
(Tan, et al. 1982)

TRATAMENTO Medidas Gerais -Esclarecimento -Evitar: Raios UV Drogas Stress Infeces Drogas: -AINH -Corticides : vo, pulsoterapia -Antimalricos: HDCL -Imunossupressores: Ciclofosfamida (Pulso) Azatioprina VO (50-150mg/d) -Talidomida -Micofonalato mofetil -Rituximabe

OBRIGADA!

INTRODUO

PREDISPOSIO GENTICA: LES E AR

Evidncias de participao gentica:

tx concordncia gmios: LES- monozigticos= 24 a 58 % dizigticos = 0 a 6%; AR; monozigticos=15% (5 x dizigticos)
Pratt et al., 2009

familiares de pacientes com LES: 10 a 15% com AR: 4x maior em parentes de 1.grau
Tsao, 2003

INTRODUO

PREDISPOSIO GENTICA: LES E AR

Tipos de estudo:
1-Triagem genmica 2-Genes candidatos

INTRODUO

PREDISPOSIO GENTICA: LES E AR

1-Triagem genmica
Regies candidatas: MHC, no cromossomo, 6 codifica HLA classe I e II;
Lindqvist e Alarcn-Riquelme, 1999; Huang et al., 2003

1p36; 19q13 (AR);

Prokunina e Alarcn-Riquelme, 2004

1q43-1q44, 2q31.1-2q34, 4p16.3-4p15.33, 4q32.1-4q34.3, 6p25.3-6p22.3, 6p22.3-6p21.1, 6p21.1-6p15, 7p22.3-7p21.1, 7q34-7q36.3, 13q13.213q22.2,16p12.3-16q12.2, 17p12-17q21.31, 20p11.22-20q13.13 (LES)
Lee e Nath, 2005

2-Genes candidatos Resposta imune inata e adaptativa: HLA-A,-B,-C,-G e DRB1; KIR; NRAMP. Apoptose caspase 8 Metabolismo do folato - MTHFR

INTRODUO

PREDISPOSIO GENTICA: LES E AR

1-Triagem genmica
Regies candidatas: MHC, no cromossomo 6 codifica HLA classe I e II;
Lindqvist e Alarcn-Riquelme, 1999; Huang et al., 2003

1p36; 19q13 (AR);

Prokunina e Alarcn-Riquelme, 2004

1q43-1q44, 2q31.1-2q34, 4p16.3-4p15.33, 4q32.14q34.3, 6p25.3-6p22.3, 6p22.3-6p21.1, 6p21.1-6p15, 7p22.3-7p21.1, 7q347q36.3, 13q13.2-13q22.2,16p12.3-16q12.2, 17p12-17q21.31, 20p11.2220q13.13 (LES)
Lee e Nath, 2005

INTRODUO

PREDISPOSIO GENTICA: LES E AR

2-Genes candidatos: Resposta imune inata e adaptativa: HLA-A,-B,-C,-G e DRB1; KIR; NRAMP. Apoptose caspase 8 Metabolismo do folato - MTHFR

INTRODUO

PREDISPOSIO GENTICA: LES E AR

2-Genes candidatos
Resposta imune adaptativa no processo de apresentao de antgeno:
HLA-A, -B, -C (classe I) DRB1 (classe II) Deleo de 14pb em 3, responsvel pela estabilidade do RNAm: HLA-G
Resposta imune inata: Genes KIR Gene da MTHFR: Associada a processos inflamatrios crnicos

Gene da caspase 8: Associado a processos apoptticos:

INTRODUO

PREDISPOSIO GENTICA AO LES E A AR

Resposta imune adaptativa no processo de apresentao de antgeno:

HLA-A, -B, -C (classe I) DRB1 (classe II)

Deleo de 14pb em 3, responsvel pela estabilidade do RNAm:

HLA-G
Resposta imune inata:

Genes KIR
Associada a processos inflamatrios crnicos:

Gene da MTHFR
Associado a processos apoptticos:

Gene da caspase 8

INTRODUO
Resposta imune adaptativa no processo de apresentao de antgenos: HLA-A, -B, -C (classe I) e DRB1 (classe II)

O MHC pode ser dividido em trs regies: Classe II (centromrica), Classes

III e I (telomricas), sedo que os produtos gnicos de cada regio correspondem a : -Classe II, expressas nas clulas apresentadoras de antgenos (linfcito B, macrfagos e clulas dendrticas), e clulas endoteliais e epiteliais ativadas por interferons; - Classe III, componentes C4, C2 e Bf do complemento ; - Classe I expressas em todas as clulas nucleadas do organismo O MHC constitudo por mais de 200 genes, frequentemente relacionados resposta imune. Dentre estes genes temos os genes HLA (Antgeno Leucocitrio Humano), fundamentais para o reconhecimento de antgenos pelo sistema imune. Os linfcitos T s so capazes de reconhecer antgenos (incluindo os autoantgenos), quando estes esto ligados ao HLA e expostos pelas clulas apresentadoras. Os linfcitos TCD4+ reconhecem antgenos ligados ao HLA classe I, e os linfcitos TCD8+ reconhecem antgenos ligados ao HLA classe II.

Associao de genes HLA com doenas autoimunesINTRODUO como: LES e AR.

Doenas
Espondilite anquilosante Diabetes Melitus insulina- dependente Sndrome de goodpasture Pnfigo vulgar Uvete anterior aguda Lpus eritematoso sistmico

HLA associado
B27 DR3-DR4 DR2 DR4 B27 DR3

Risco relativo
87 25 16 14 10 6

Esclerose mltipla
Doena de Graves Artrte reumatide Miastenia gravis

DR2
DR3 DR4 DR3

5
4 4 3

Concluses a partir de estudos de rastreamento INTRODUO completo do genoma de pacientes com AR, em quatro populaes diferentes: 1- o locus do cromossomo 6 contendo o HLA detectado na maioria dos rastreamentos; 2- nenhum outro locus se repete com freqncia nos diversos estudos
Jawaheer et al., 2001; Eyre et al., 2004

-O HLA = 50% do componente gentico da AR -Outros genes= 50%.

genes do HLA, destacam-se os alelos que codificam a cadeia da molcula da classe II, expressas por clulas apresentadoras de antgenos tais como: HLA-DRB1*0401, HLA-DRB1*0404 e HLA-DRB1*0101, presentes em mais de 90% de pacientes caucasides com forma grave de AR e em apenas 28% de indivduos sadios.
Stastny, 1978; Wordsworth et al., 1989

INTRODUO

Teoria do eptopo compartilhado (Shared Epitope SE) ou reumatide

O que isso?
uma sequncia de 8 aminocidos glutamina-leucina ou argininaarginina-alanina-alanina (QR/RRAA) nas posies 70 a 74 da terceira regio hipervarivel da cadeia do MHC da classe II Gregersen et al., 1987.

Muitos alelos DRB1 SE+ esto associados AR, porm no h concenso se estes alelos so fatores de risco para o desenvolvimento da doena
Fugger e Svejgaard, 2000

INTRODUO

Outros genes associados ao LES e a AR: genes de classe II principalmente alelos HLA-DRB1, como 0401, em homozigoze= manifestaes extra-articulares;
Weyand et al.,1992

alelos do receptor II do TNF-= resposta s drogas usadas no tratamento da AR;

Okamoto et al., 2003

hapltipo de STAT4= predisposio ao LES e a AR

Remmers et al., 2007

No LES, h um consenso que a susceplidade gentica determinada por uma combinao de variantes allicas que so comumente encontradas na populao geral, e isoladamente pouco contribuem no desenvolvimento da doena
Borchers et al., 2010

INTRODUO

PREDISPOSIO GENTICA: LES E AR

ESTUDO DE GENES CANDIDATOS ( no MHC): Genes na resposta imune inata; Genes na resposta adaptativa; Genes envolvidos na apoptose.
Prokunina e Alarcon-Riquelme, 2004; Krishnan et al., 2006

INTRODUO

PREDISPOSIO GENTICA: LES E AR

Genes no MHC associados AR e LES

Genes KIR Gene da MTHFR: Associada a processos inflamatrios crnicos

Gene da caspase 8: Associado a processos apoptticos:

INTRODUO

PREDISPOSIO GENTICA: LES E AR

Genes no MHC associados AR e LES

1- Associados a processos inflamatrios crnicos:

Gene SLC11A1: Gene de resistncia natural associada protena 1 de macrfago (NRAMP1) Gene da MTHFR: Associada a processos inflamatrios crnicos

2- Associados a processos inflamatrios crnicos:

Gene da caspase 8: Associado a processos apoptticos:

INTRODUO

PREDISPOSIO GENTICA: LES E AR

Genes no MHC associados AR e LES:

Gene SLC11A1

(solute Carrier family 11 member 1)

Gene de resistncia natural associada protena 1 de macrfago (NRAMP1)

Efeito pleiotrpico na ativao do macrfago :

auto-regulao de genes de citocinas, TNF- e Interleucina 1 (IL-1); ativao da xido ntrico sintetase (iNOS); expresso do MHC de classe II; atividade tumoricida e antimicrobiana Obs: Estes efeitos esto diretamente envolvidos na resitncia infeco e podem estar envolvidos na induo e manuteno de doenas auto-imunes, como a AR, uma vez que TNF- e IL-1 tm importante papel na atividade inflamatria e destruio tecidual da AR
Yen et al., 2006

INTRODUO

PREDISPOSIO GENTICA: LES E AR

Gene SLC11A1 (NRAMP1)

IL8-R/ ARPC2 MR-1 NRAMP1

AAMP

NLI-1F

VIL 1

12 kb 15 exons

1729+55 del 4

Figura 1: Representao esquemtica do cromossomo 2 demonstrando a localizao do gene NRAMP1. (Modificado de Marquet et al., 2000)

INTRODUO

PREDISPOSIO GENTICA: LES E AR

Gene SLC11A1
uma protena transportadora de prtons/ctions dependentes de PH; Localizado na membrana de endossomos/lisossomos de macrfagos; Envolvida na sua homeostase. SLC11A1 regula e regulado pela concentrao de ctions divalentes no meio, especialmente o ferro.
Blackwell et al., 2001

INTRODUO

PREDISPOSIO GENTICA: LES E AR

Gene SLC11A1 x Doenas

artrite reumatoide, ARJ, tuberculose, hansenase, leishimaniose visceral, meningite meningoccica, HIV, diabetes tipo 1, esclerose mltipla , doena de Crohn, sarcoidose
Bellamy, 1999; El-Safi et al., 2006; Blackwell, 2003; Sanjeevi et al., 2000; Hofmeister et al., 1997

INTRODUO

PREDISPOSIO GENTICA: LES E AR

Gene SLC11A1 x LES

Pode participar atravez da liberao de partculas provenientes de morte ou dano celular, estas partculas podem ser reconhecidas por linfcitos B ativados por TLR (tool like receptors), seguidos de produo e liberao de autoanticorpos
Awommoyi, 2007

Gene SLC11A1 x AR
Predisposio e com a evoluo da AR, em espanhois, independente da
associao com alelos DRB1.
Rodriguez, 2002

Associao com a susseptilidade, em Taiwanesa, com o alelo 244 do polimorfismo 1729 + 55 del 4.
Yen et al., 2006

INTRODUO

PREDISPOSIO GENTICA: LES E AR

Genes no MHC associados AR e LES:

Gene MTHFR
Metilenotetrahidrofolato redutase (MTHFR) uma enzima que tem ao no metabolismo do folato, por ser responsvel pela transformao do tetrahidrofolato (THF) em 5-metiltetrahidrofolato, que doador de carbono para diversas reaes celulares importantes
Ranganathan et al., 2004; Ranganathan, 2005

Localizado na regio q36 do cromossomo 1, regio anteriormente associada ao LES.

INTRODUO

Localizao do gene da MTHFR

INTRODUO

PREDISPOSIO GENTICA: LES E AR

Gene MTHFR
Freqncia :
Alelo MTHFR*677T : 34% caucasianos;

42% asiticos; 8% africanos.

Alelo C1298: 34% caucasianos; 21 % japoneses; 9% africanos
Asanuma et al., 2003 ; Krajinovic e Moghrabi, 2003; Kumagai et al., 2003

Associaes descritas entre doenas e o gentipo MTHFR 677 TT.

Autor Kluijtmans et al., 1996 Morita et al.,1997 Kelly et al., 2002 Doena Doena CV prematura Doena coronariana AVC isqumico Efeito Risco aumentado( 3 X) Suscetibilidade Suscetibilidade

INTRODUO

Klerk et al., 2002 Van der Put et al., 1995 Ou et al., 1996 Qian et al., 2007 Queffeulou et al., 2002
Keijzer et al., 2002 Casas et al., 2004 Hubner et al., 2007 Bjelland et al., 2003 Lewis et al., 2006 Lewis et al., 2005 Muntjewerff et al., 2006

Doena coronariana Defeito no tubo neural Defeito no tubo neural Hipertenso Trombose arterial renal
Trombose venosa AVC isqumico Cncer coloretal Depresso Depresso Esquizofrenia Esquizofrenia

Risco aumentado Suscetibilidade Risco aumentado (7,2X) Fator de risco Suscetibilidade

Suscetibilidade Suscetibilidade Suscetibilidade Suscetibilidade Risco aumentado Risco aumentado Risco aumentado

INTRODUO

PREDISPOSIO GENTICA: LES E AR

Genes no MHC associados AR e LES:

Gene da caspase 8
Caspases: so famlias de proteases cistenas que ativam a apoptose.
Em humanos, a famlia de caspases: so compostas por 11 isoenzimas

Funo: iniciao e a execuo da apoptose

Kim et al., 2009

Localizao 2q33 652 6N del na regio promotora Destruio do stio de ligao da protena 1 Transcrio

INTRODUO

PREDISPOSIO GENTICA: LES E AR

Genes no MHC associados AR e LES:

Gene da caspase 8
Classificao: -iniciadoras (caspase 8) -efetoras da apoptose
O gene da caspase 8 est envolvido com processos apoptticos
Sun et al., 2007

INTRODUO

PREDISPOSIO GENTICA: LES E AR

Genes no MHC associados AR e LES:

Gene da caspase 8
Localizao 2q33 652 6N del na regio promotora Destruio do stio de ligao da protena 1 Transcrio

INTRODUO

Associado a processos apoptticos: Gene da caspase 8

Proteases cistena especficas para aspartato Morte celular por apoptose

Balano homeosttico Controla a quantidade de linfcitos

RESPOSTA POTENTE CONTRA PATGENOS + PREVENO P DOENAS AUTO IMUNES

DOENAS

INTRODUO

Gene da caspase 8
Mutaes no gene CASP8 podem interferir na sua expresso e ou funo. O polimorfismo de seis nucleotdeos (6N del) na regio promotora o mais estudado e reduz expresso ou a funo da caspase-8 e a morte celular induzida por ativao de linfcitos T
Sun et al., 2007

A deleo da caspase-8 foi identificada associada com suscetilidade reduzida a cncer pulmonar, gstrico, coloretal, esofagiano e mama.
Sun et al., 2007

INTRODUO

Gene da caspase 8
Porque estudar CASP8 x susceptibilidade ao LES e a AR?
Na patognese do LES ocorre alteraes da apoptose: Taxas de apoptose tecidual Linfcitos perifricos Formao de anticorpos e imunecomplexos

INTRODUO

Influncia da ancestralidade na predisposio ao LES e a AR

distribuio universal; acometem todos os grupos tnicos; freqncias, gravidade e manifestaes clnicas.

INTRODUO

Influncia da ancestralidade na predisposio a AR

-prevalncia mundial: 0,4 a 1,9%,

Laurindo e Guedes, 2007

-prevalncia Brasil: 0,2% a 1,1%

-Curitiba 0,1% (descendncia de europeus)

Porto Alegre contribuio eur (90%), afric. (10%), amer. (0%)

-Belm 1,1
Marques et al., 1993

contribuio eur (48 a 69%), afric (15 a 33%) e amer. (11 a 30%).

INTRODUO

Influncia da ancestralidade na predisposia ao LES -prevalncia mundial: 17 a 48/100.000 (0,017 a 0,048%)

Tebbe e Orfano, 1997

-Incidncia Brasil: 8,7 /100.000 /ano (Natal)

Vilar et al., 2003

-freqncia de mistura racial em Natal: europeus

(58%), africanos (25%), amerndios (17%)
Franco e col. ,1982

INTRODUO

Influncia da ancestralidade na predisposia a AR

>freqente Estados Unidos e Europa
<frica e na sia. >incidncia sul da Europa. <menos manifestaes extra-articulares e menos eroses nos pases do Mediterrneo que pases do norte europeu.
Alamanos e Drosos, 2005

prevalncia em americanos-nativos 4 X que europeus

A freqncia do EC 25% em europeus e 82% em nativos americanos. frica do Sul a prevalncia em africanos descendentes europeus.
Molokhia e Mckeigue, 2001

INTRODUO

Influncia da ancestralidade na predisposia ao LES

raro no oeste da frica por alt. sistema imune devido malria e infeces a tolerncia a ag prprios ou absoro de auto-anticorpos
Greenwood, 1968

predomina em afroamericanas e descendentes do Oeste Africano. prevalncia 6 a 8X migrantes do Caribe para a Europa que em descendentes europeus, que vivem nos mesmos pases.
Fessel, 1974; Hopkinson et al., 1994; Johnson et al., 1995; Nossent, 1992

maior risco em descendentes chineses e indianos.

Catalano e Hoffmeier, 1989; Frank, 1979; Serdula e Rhoads, 1979; Samanta et al., 1992

Greenwood, 1968

INTRODUO

Influncia da ancestralidade na predisposia ao LES

Estudo, em mulheres, centro de Londres objetivo: comparar prevalncia do LES entre migrantes recentes do oeste da frica para o Reino Unido com a prevalncia de pessoas do oeste da frica descesdentes de caribenhos. Resultado: prevalncia estimada foi de 200-250 em afro-caribenhos, 110 em africanas ocidentais e 35 em europias. Concluso: a susceptilidade gentica para a ocorrncia de LES em descendentes de africanos maior que nos europeus.
Molokhia et al., 2001

INTRODUO

Influncia da ancestralidade na predisposia ao LES

Estudos de associaes genticas ao risco de LES em diferentes etinias mostraram o risco relativo para vrios loci em europeus e africanos: A maioria dos loci associados ao LES esto no HLA. Em europeus est associado com HLA-B8, DQA1, DR2 e DR3. O alelo C4A interfere na identificao do alelo HLA. Este mais freqente em africanos que europeus.

H associao do Alelo da protena heat shock (HSP70-2) em afroamericanos. A freqncia allica em afro-americanos 60% e 40% em europeus.
Alelo 308A do TNF- mais associado ao risco de LES em europeus (12%) que em afro-americanos (4%).

I A etiologia do LES e AR ainda desconhecida. Estudos para verficar o quanto a ancestralidade influncia podem contribuir no devendar o mecanismo etiopatognico dessas doenas. Assim, estudos casocontrole focando genes candidatos, escolhidos de acordo com sua funo, so ferramentas poderosas para o entendimento da etiologia do LES e da AR e de sua evoluo clnica, permitindo o desenvolvimento de marcadores prognstico-preditivos, os quais podem ser teis no direcionamento de polticas e programas em sade pblica. Os genes escolhidos para o presente estudo desempenham papis importantes em funes reconhecidamente relacionadas ao LES e a AR, alm de serem relevantes em processos inflamatrios e apoptticos. Alm disso, a seleo dos marcadores para esse estudo, tambm considerou sua localizao em regies cromossmicas j descritas como associadas, por triagem genmica em genealogias, em vrios estudos independentes e em populaes distintas. Os resultados obtidos, no presente estudo, so originais e podero contribuir para o entendimento da base gentica do desenvolvimento e evoluo clnica do LES e da AR, fornecendo importante contribuio para o desenvolvimento de marcadores prognstico preditivos, permitindo ajustar ou modular o tratamento.

Objetivos

OBJETIVOS

Objetivo geral:

Investigar a influncia da etnia e de polimorfismos

dos genes da MTHFR, o gene SLC11A1 e da Caspase 8 no desenvolvimento do LES e da AR e suas manifestaes clnicas.

OBJETIVOS

Objetivos especficos:
Determinar a freqncia allica dos polimorfismos dos
genes MTHFR, SLC11A1 e Caspase 8 em pacientes com LES e AR e indivduos controle representativos da populao de Belm;

Descrever a variabilidade dos genes supracitados em

pacientes com diagnstico de AR e LES e em controles representativos da populao de Belm;

Descrever a estrutura tnica de pacientes com diagnstico

de AR, LES e em controles representativos da populao de Belm;

OBJETIVOS

Objetivos especficos:
Associar polimorfismos dos genes supracitados com o
desenvolvimento da AR e do LES;

Associar os polimorfismos dos genes supracitados com as

manifestaes clnicas do LES e da AR;

Associar a ancestralidade com o desenvolvimento das

manifestaes clnicas da AR e do LES.

MATERIAL e MTODOS

MTODO
Declarao de Helsinque e Cdigo de Nuremberg

Resoluo CNS 196/96

Aprovado pelo CEP do HEMOPA

TCLE

MATERIAL E MTODOS

Tipo de estudo e Amostragem

Estudo tipo caso-controle e epidemiolgico.
Casustica: 880 amostras:
Pacientes: LES*=111 AR*= 424
*Diagnstico de AR ou LES de acordo com o ACR FSCMPA, URES-DOCA, consultrio e consultrio de reumatologia

Controles: 345 no portadores de LES e/ou AR, no aparentados; acima de 50 anos;

MATERIAL E MTODOS

Delineamento amostral

Pacientes: LES*=111
AR*= 424
*Diagnstico de AR ou LES de acordo com o ACR

Controles: 345

no portadores de LES e/ou AR, no aparentados; acima de 50 anos;

Total : 880 amostras de DNA

MATERIAL E MTODOS

Coleta e processamento das amostras:

5 ml de sangue perifrico, por puno venosa;

colocados em tubos com EDTA, como anticoagulante; estocadas em temperatura adequada at a extrao do DNA;
O DNA foi extrado atravs do mtodo fenol-clorofrmio, por meio
do protocolo descrito na literatura (Sambrook et al.,1989).

Para a verificao da integridade do DNA extrado, as amostras

foram submetidas eletroforese em gel de agarose 0,8%, com tampo TAE 1X, a 100 Volts, durante 30 minutos.

MATERIAL E MTODOS

Genotipagem de Polimorfismos Genticos:

Mutao C677T do gene da MTHFR (Frosst et al., 1995) Deleo de 6pb da regio promotora do gene da
Caspase8 (Sun et al., 2007) Gene SLC11A1 (NRAMP) (Yen et al, 2006)
A genotipagem dos pacientes e controles foi realizada por

PCR (reao em cadeia da polimerase)+ digesto c/ enzima de restrio Hinf I , Os oligonucleotdeos e condies de PCR j foram descritos
previamente na literatura

Visualizao da amplificao: gel de agarose a 1,5% Deteco dos fragmentos : gel de poliacrilamida a 6%, Todos os genes foram corados com nitrato de prata

MATERIAL E MTODOS

Genotipagem de Polimorfismos Genticos:

Mutao C677T do gene da MTHFR

A genotipagem dos pacientes e controles foi realizada por

PCR + digesto c/ enzima de restrio Hinf I , Os oligonucleotdeos e condies de PCR j foram descritos previamente na literatura (Frosst et al., 1995) Visualizao da amplificao: gel de agarose a 1,5% Deteco dos fragmentos : gel de poliacrilamida a 6%, corado c/ nitrato de prata.

MATERIAL E MTODOS

Genotipagem de Polimorfismos Genticos:

Gene SLC11A1 (NRAMP)

PCR (Yen et al, 2006) eletroforese: em gel de acrilamida a 10% em cub eletrofortica vertical tempo de migrao: 18h a 80V.

Este polimorfismo consiste na deleo de quatro nucleotdeos (TGTG) na

regio 3 UTR, 55 nucleotdeos 3 do ltimo cdon no xon 15 (Yen et al., 2006). A genotipagem para polimorfismo 1729 + 55 del 4 NRAMP dos pacientes e controles foi feita por PCR de acordo com Yen e colaboradores (2006) e a eletroforese foi realizada em gel de acrilamida a 10% em cuba eletrofortica vertical, sendo aplicados 10,0 L de cada amostra constituda de 3,0 L de azul de bromofenol e 7,0 L de produto da PCR, homogeneizados. O tempo de migrao foi de 18h a 80 V.

MATERIAL E MTODOS

Genotipagem de Polimorfismos Genticos:

Deleo de 6pb da regio promotora do gene da

Caspase8
PCR-SSP (Sun et al., 2007) Visualizao em gel de poliacrilamida 10%

Todos os genes foram corados com nitrato de prata

A genotipagem da deleo de 6 pb da regio promotora do gene CASP8 foi feita por PCR e eletroforese em gel de acrilamida a 10%, corado com nitrato de prata. Condies de PCR e seqncia de oligonucleotdeos foi realizada de acordo com o descrito por Sun e colaboradores (2007).

MATERIAL E MTODOS

Ancestralidade e Gnero

As amostras de DNA foram genotipadas para 48 marcadores

biallicos. Concentraes de primer e seqncias ,bem como condies multiplex , PCR e eletroforese capilar ABI PRISM no Genetic Analyzer 3130 (Applied Biosystems) so descritos por outros autores Santos et al., 2010.

Os marcadores de ancestralidade atenderam a dois critrios

principais: (i) grandes diferenas nas freqncias allicas (40%) entre etnias africana, europia e / ou amerndia, e (ii) a localizao em diferentes cromossomos ou em diferentes regies fsicas do mesmo cromossomo Santos et al., 2010.

MATERIAL E MTODOS

Anlise estatstica
Frequncia allica por contagem direta Estimativa de variabilidade gentica ( Nei, 1987) Comparao entre as frequncias allicas (Pacientes x Controles): Qui-quadrado + Simulao de Monte Carlo para estimar valores de p (Sham & Curtis, 1995) Correo para mltiplos testes: p/testes independentes ou p/ mltiplos alelos OR foi estimado para alelos estatisticamente significantes associados ao LES e/ou a AR. Anlise conjunta dos marcadores : regresso logstica

MATERIAL E MTODOS

Anlise estatstica
Comparao das Amostras para o loci candidato As frequncias de genes MTHFR, CASP8 e Polimorfismos SLC11A1 em
controles e pacientes foram comparadas utilizando-se o teste exato de Fisher. Correo para mltiplos testes tambm foi realizada, quando necessria.

Mistura tnica As estimativas das propores ancestrais dos indivduos foram obtidas
utilizando software Estructure v.3.2 (http://pritch.bsd.uchicago.edu/software.html) (Pritchard et al., 2000; Faluch et al., 2007).

MATERIAL E MTODOS

Anlise estatstica
Comparao de mistura racial entre os grupos
Amostras de controle e paciente foram testadas para diferenas entre as propores ancestrais individuais por Mann-Whitney. O mesmo procedimento foi usado para testar as diferenas entre as propores de ascendncia africana, europia e amerndia entre os subgrupos de pacientes classificados de acordo com os critrios de manifestaes clnicos, bem como entre subgrupos de pacientes e controles, portadores e no portadores do suposto polimorfismo predisponente/protetor no loci candidato.

MATERIAL E MTODOS

Aspectos ticos
O presente projeto foi submetido para registro no comit de tica em pesquisa da Fundao Centro de Hemoterapia e Hemotologia do Par (HEMOPA), seguindo orientaes e a legislao vigente.

RESULTADOS e Discusso

A distribuio de idades de inicio entre homens e mulheres no diferiu entre os pacientes com AR (Z(U)=0,097; p=0,94) e nem com LES (Z(U)=0,1797; p=0,86).

Figura 2: Distribuio da freqncia por faixa etria em pacientes com Artrite Reumatide e Lpus Eritematoso Sistmico

 Idade de incio da: AR 25 55 anos

Laurindo e Guedes, 2007

71%

LES 16-55 anos 65%

Russ et al., 2001

69%

A distribuio de idades de inicio entre homens e mulheres no

diferiu entre os pacientes com AR (Z(U)=0,097; p=0,94) e nem com LES (Z(U)=0,1797; p=0,86).

Figura 4: Proporo de acometimento entre os sexos feminino e masculino nos pacientes com AR (9,2:1) e LES(9,4:1).

Tabela 9: Relao de sexo Feminino/Masculino na AR em diferentes populaes.

Populao Japoneses Koreanos Taiwaneses Chineses Indianos Espanhis Franceses Britnicos Judeus Mestios colombianos So Paulo-Brasil Belm Feminino:Masculino 2,1:1 5,2:1 4,3:1 4.5:1 4,0:1 4,0:1 2,6:1 1,9:1 4,8:1 8,3:1 6:1 9,2:1 Referncia Shinomiya et al., 2008 Yang et al., 2000 Yen et al., 2006 Fukino et al., 2007 Taneja et al., 1996 Carmona et al., 2002 Perdriger et al., 1996 Panayi et al., 1978 Berkun et al., 2004 Anaya et al., 2001 Louzada et al., 2007 Presente estudo

Tabela 9: Relao de sexo Feminino/Masculino na AR em diferentes populaes.

Tabela 10: Relao de sexo Feminino:Masculino no Lpus em diferentes populaes.

Populao
frica do Sul Tunsia Arbia Saudita Paquisto ndia Malsia Singapura

Feminino:Masculino
18:1 11,5:1 10:1 7,2:1 8:1 12,5:1 11,8:1

Referncia
Wadee et al., 2007 Houman et al., 2004 Heller et al., 2007 Rabbani et al., 2004 Malaviya et al., 1997 Wang et al., 1997 Thumboo et al., 2001

Filipinas
Amrica Latina Europa Belm

28:1
9:1 10,8:1 15,7:1

Villamin e Navarra, 2008

Pons-Estel et al., 2004 Cervera, 2006 Presente estudo

Tabela 3. Frequncias genotpicas e allicas dos loci estudados (SLC11A1, MTHFR e CASP8) em pacientes com LES e AR e controles. AR
Gentipo
CASP8 171/171 171/177 177/177 CASP8*171 CC CT TT MTHFR*677T

LES
%
14 49 37

Controle
%
13 50 37

Frequncia
59 202 151 0,3883 149 124 45 0,3365

Frequncia
14 56 40 0,3818

Frequncia
54 187 100 0,4071

%
16 55 29

47 39 14

35 37 09 0,34

43 46 11

145 170 36 0,3447

41 49 10

SLC11A1 244/244

266

84,5

78

70

268

82,5

244/240 240/240

47 2

14,9 0,6

30 03

27 3

56 1

17,2 0,3

SLC11A1*240

0,09

0,162

0,08

Tabela 4: Proporo de Mistura Racial em pacientes com LES e AR e controles.

Etnia Africana Europia Amerndia AR 0,23e 0,44 0,33c LES 0,22e 0,45b 0,33d Controle 0,24e 0,48a;b 0,28c;d Intervalo* 0,12-0,33 0,48-0,61 0,16-0,3

LES=Lupus Eritematoso Sistmico; AR=Artrite Reumatide. aMann-Whitney Z(U)=2.6908; p=0.0071; bZ(U)=2.264; p=0.0236; cZ(U)=3.4455; p=0.0006; dZ(U)=3.1927; p=0.0014. eComparaes no estatisticamente significantes. *Intervalo de estimativas de proporo de mistura racial obtidas em estudos prvios (Franco, 1973; Ayres et al., 1976; Schneider and Salzano, 1979; Corvelo and Salzano, 1984; Guerreiro e Chautard-Freire-Maia, 1988; Santos et al., 2010)

Tabela 5: Proporo de mistura racial em portadores e no portadores de alelos menos freqentes nas amostras de pacientes com LES e AR e controles.
AR Alelo Portador SLC11A1*240 Africanos Europeus Amerindios MTHFR*677T Africanos Europeus Amerindios CASP8*171 Africanos Europeus Amerindios 0,234 0,449 0,317 0,233 0,431 0,336 0,213 0,471 0,316 0,229 0,407 0,364 0,217 0,510 0,273 0,216 0,469 0,314 0,225 0,453 0,322 0,227 0,446 0,327 0,215 0,445 0,340 0,218 0,441 0,341 0,247 0,476 0,276 0,225 0,486 0,289 0,221 0,402 0,377 0,227 0,459 0,314 0,236 0,455 0,308 0,210 0,444 0,344 0,226 0,503 0,271 0,215 0,502 0,283 No Portador Portador LES No Portador Controle Portador No Portador

LES: Lpus Eritematoso Sistmico; AR: Artrite Reumatide.

Tabela 6. Frequncia dos alelos e mistura racial de acordo com o sexo em pacientes com LES e AR e controle.

Alelo/Mistura racial

AR

LES

Controle

Homens

Mulheres

Homens

Mulheres

Homens

Mulheres

SLC11A1*240

0,063

0,076

0,063

0,170

0,067

0,108

MTHFR*677T

0,313

0,333

0,10

0,360

0,300

0,350

CASP8*171

0,383

0,393

0,357

0,380

0,420

0,420

Africana

0,204

0,236

0,254

0,217

0,220

0,210

Europia

0,505

0,437

0,419

0,447

0,490

0,510

Amerndia

0,291

0,327

0,327

0,336

0,290

0,280

Teste exato de Fisher p=0.1602.

Alopecia

Sim No

73 36 61 48 52 57 25 84 22 87 9

67

0.34 0.33

0.17 0.16 0.16 0.17 0.14 0.19 0.15 0.17 0.19 0.16 0.22

0.41 0.37 0.42 0.37 0.38 0.41 0.45 0.38 0.42 0.39 0.50

0.22 0.22 0.23 0.21 0.22 0.22 0.18 0.24 0.27 0.21 0.28

0.45 0.45 0.44 0.45 0.44 0.45 0.48 0.43 0.40 0.46 0.41

0.34 0.33 0.32 0.34 0.33 0.33 0.34 0.33 0.33 0.33 0.31

Fotossensibilidade

Sim No

56

0.31 0.37

Rash Malar

Sim No

48

0.31 0.37

Leso discide

Sim No

23

0.35 0.34

Acometimento Renal

Sim No

20

0.34 0.34

Sndrome Nefrtica

Sim

0.36

No
Cefalia Sim No Convulso Sim No Psicose Sim No Pleurite Sim

100
53 56 5 104 9 100 9 9 8 5 49

0.34
0.36 0.32 0.25 0.34 0.29 0.34 0.43

0.16
0.17 0.16 0.13 0.17 0.19 0.16 0.44

0.39
0.46 0.35 0.75 0.38 0.64 0.38 0.25

0.21
0.23 0.21 0.24 0.22 0.22 0.22 0.21

0.45
0.44 0.45 0.38 0.45 0.35 0.45 0.41

0.54
0.33 0.33 0.38 0.33 0.43 0.33 0.38

No
Pericardite Sim No Comprometimento Muscular Sim No Fenmeno de Raynald Sim No Vasculite Sim

93
3 105 31 78 29 80 7 9 27 28 3

0.56
0.33 0.34 0.40 0.32 0.40 0.22 0.17

0.06
0.17 0.17 0.20 0.16 0.21 0.15 0.14

0.42
0.50 0.40 0.46 0.37 0.38 0.40 0.66

0.22
0.19 0.22 0.23 0.22 0.26 0.19 0.28

0.45
0.40 0.45 0.43 0.46 0.42 0.43 0.43

0.33
0.41 0.33 0.35 0.33 0.32 0.38 0.29

No
lceras orais ou nasais Sim No Anemia hemoltica Sim No Prpura Sim No Fenmenos Trombticos
ap=

73
26 83 20 89 4 105 14 13 4 18 24

0.33
0.39 0.32 0.25 0.36 0.50 0.36 0.35

0.15
0.14 0.18 0.22 0.15 0.17 0.16 0.16

0.39
0.37 0.41 0.48 0.38 0.83 0.38 0.41

0.17
0.23 0.22 0.22 0.21 0.36 0.22 0.15

0.43
0.45 0.45 0.44 0.46 0.54 0.45 0.37

0.40
0.32 0.33 0.33 0.33 0.10 0.34 0.48

Sim

No 97 0.29 0.0054/ Z(U)=2.55; bp= 0.0020/ Z(U)=3.09.Sim AFR=Africanos, EUR=Europeus, AME=Amerndios. Imunolgicos 39 37 0.43
No 66 0.29

0.18
0.18 0.16

0.31
0.40 0.37

0.20
0.23 0.22

0.42
0.47 0.44

0.38
0.30 0.35

os e contribuio tnica em relao presena ou ausncia de manifestaes, no incio da doena, em pacientes com LES.
A Manifestaes iniciais N % MTHFR*677T SLC11A1*240 CASP8*171 AFR EUR M E Pacientes LES 0.34 0.14 0.37 0.22 0.44 0. 34 Artrite e/ou artralgia Sim 90 83 0.34 0.18 0.41 0.22 0.44 0. 34 0. 33 0. 32 0. 35 0. 36 0. 29 0. 34 0. 33 0. 32 0. 34 0. 33 0. 33 0. 34 0. 33 0. 33 0. 33 0. 31

No

19

0.35

0.11

0.33

0.20

0.47

Sintomas Gerais

Sim

58

53

0.31

0.16

0.44

0.22

0.46

No

51

0.37

0.17

0.35

0.22

0.44

Febre

Sim

70

64

0.35

0.17

0.38

0.21

0.43

No

39

0.32

0.16

0.43

0.23

0.48

Alopecia

Sim

73

67

0.34

0.17

0.41

0.22

0.45

No

36

0.33

0.16

0.37

0.22

0.45

Fotossensibilidade

Sim

61

56

0.31

0.16

0.42

0.23

0.44

No

48

0.37

0.17

0.37

0.21

0.45

Rash Malar

Sim

52

48

0.31

0.14

0.38

0.22

0.44

No

57

0.37

0.19

0.41

0.22

0.45

Leso discide

Sim

25

23

0.35

0.15

0.45

0.18

0.48

No

84

0.34

0.17

0.38

0.24

0.43

Acometimento Renal

Sim

22

20

0.34

0.19

0.42

0.27

0.40

No

87

0.34

0.16

0.39

0.21

0.46

Sndrome Nefrtica

Sim

0.36

0.22

0.50

0.28

0.41

No

1000000

0.34

0.16

0.39

0.21

0.45

0. 54

Cefalia

Sim

53

49

0.36

0.17

0.46

0.23

0.44

0. 33 0. 33 0. 38 0. 33 0. 43 0. 33 0. 38 0. 33 0. 41 0. 33 0. 35 0. 33 0. 32 0. 38 0. 29 0. 40 0. 32 0. 33 0. 33 0. 33 0. 10 0. 34 0. 48 0. 38 0. 30 0. 35

No

56

0.32

0.16

0.35

0.21

0.45

Convulso

Sim

0.25

0.13

0.75

0.24

0.38

No

104

0.34

0.17

0.38

0.22

0.45

Psicose

Sim

0.29

0.19

0.64

0.22

0.35

No

100

0.34

0.16

0.38

0.22

0.45

Pleurite

Sim

0.43

0.44

0.25

0.21

0.41

No

93

0.56

0.06

0.42

0.22

0.45

Pericardite

Sim

0.33

0.17

0.50

0.19

0.40

No

105

0.34

0.17

0.40

0.22

0.45

Comprometimento Muscular

Sim

31

28

0.40

0.20

0.46

0.23

0.43

No

78

0.32

0.16

0.37

0.22

0.46

Fenmeno de Raynald

Sim

29

27

0.40

0.21

0.38

0.26

0.42

No

80

0.22

0.15

0.40

0.19

0.43

Vasculite

Sim

0.17

0.14

0.66

0.28

0.43

No

73

0.33

0.15

0.39

0.17

0.43

lceras orais ou nasais

Sim

26

24

0.39

0.14

0.37

0.23

0.45

No

83

0.32

0.18

0.41

0.22

0.45

Anemia hemoltica

Sim

20

18

0.25

0.22

0.48

0.22

0.44

No

89

0.36

0.15

0.38

0.21

0.46

Prpura

Sim

0.50

0.17

0.83

0.36

0.54

No

105

0.36

0.16

0.38

0.22

0.45

Fenmenos Trombticos

Sim

14

13

0.35

0.16

0.41

0.15

0.37

No

97

0.29

0.18

0.31

0.20

0.42

Imunolgicos

Sim

39

37

0.43

0.18

0.40

0.23

0.47

ap=

0.0054/ Z(U)=2.55; bp= 0.0020/ Z(U)=3.09. AFR=Africanos, EUR=Europeus, AME=Amerndios.

No 66 0.29 0.16

0.37

0.22

0.44

Concluses

Concluses Foi encontrada diferena estatisticamente significante entre freqncia allica do SLC11A1*240 em pacientes com LES e controles, sugerindo sua participao no desenvolvimento do LES.

Ocorreu maior freqncia do alelo CASP8*171 nos indivduos do grupo controle, essa diferena foi estatisticamente significante, caracterizando-se como fator de proteo contra o desenvolvimento da AR e do LES.

Foi encontrada maior contribuio de ascendncia amerndia entre portadores de LES e de AR do que ente controles sadios. Esses achados mostram que a ancestralidade amerndia aumenta o risco para AR e LES.

Concluses

Ocorreu maior contribuio de ancestralidade europia em controles, sugerindo ser um fator gentico de proteo contra essas doenas.

No houve diferena em termos de contribuio tnica para os alelos associados ao LES e AR, sugerindo que a associao encontrada real e no foi influenciada pelas diferenas tnicas encontradas entre controles e pacientes.

O gnero no influenciou a freqncia dos alelos estudados na ancestralidade dos pacientes com LES e AR.

Concluses Relao mulher:homem afetados para AR foi maior que a descrita na literatura e parece haver um padro, onde populaes sulamericanas apresentam a maior relao.

Relao mulher:homem afetados tanto para LES quanto para AR foi heterognea entre diversas populaes mundiais, sugerindo heterogeneidade de fatores genticos e ambientais na etiologia de ambas as doenas.

Foi evidenciado associao de acometimento renal e alteraes imunolgicas com ancestralidade africana.

Nenhuma manifestao extra-articular, da AR, foi associada com os polimorfismos estudados ou com ancestralidade.

Agradecimentos
DEUS: por todos ns, por tudo que somos e tudo que fazemos: Dele todo bem e toda glria. famlia: me, filho (Marcel), Marido, Irmos Aos professores: pela oportunidade Eduardo , meu orientador ndria, Sidney e Paulo Assuno..... As colegas do laboratrio: todas em especial a Janana e Layana Aos professores da banca: Ronaldo Lus Cristovo Gleice Leonardo As colegas (Reumato): Joo, Roberta, Claudia, Ronaldo, Capela , Czar, Rosana Aos pacientes: por eles e para eles..... Aos amigos e amigas

Agradecimentos

Agncias Financiadoras: - CNPq - CAPES

- FAPESPA

OBRIGADA!