Mara Isabel Monsalve Restrepo Microbiloga y Bioanalista Estudiante Maestra en Biotecnologa Universidad de Antioquia

Tejido o fragmento de rgano

Transferido a cultivo

CULTIVO PRIMARIO
Subcultivos

LNEA CELULAR
Aislamiento de una clula Inmortalizacin Subcultivos sucesivos

LNEA CLONAL

Senescencia/ muerte

Transformacin

LNEA CELULAR CONTINUA

LNEA CELULAR TRANSFORMADA

Conservan la morfologa de las clulas del rgano del que fueron aisladas Cromosomas diploides (2n) Crecimiento in vitro limitado y hay inhibicin por contacto. Una mejor actividad y funcionalidad similar a su ambiente natural Tienen una baja probabilidad de que se transformen en clulas malignas Desventaja: mayor probabilidad de presentar virus adventicios o latentes (=adecuada tecnologa para el control de calidad)

Aislamiento del tejido Diseccin/ disgregacin Incubacin y crecimiento

los tejidos embrionarios y tumorales dan los mejores resultados, debido a que su grado de diferenciacin es menor y su capacidad de divisin mayor.

Embriones de ratn: cultivos fibroblasticos indiferenciados, capas alimentadoras Embriones de pollo: clulas mesenquimales (anlisis de proliferacin y capas alimentadoras), sustrato para propagacin viral, diseccin individual de rganos= tipos celulares especificos. Biopsias humanas

Cumplir con las normas ticas y la legislacin vigente (Ley 84 de 1989, Resolucin N 008430 de 1993 del Ministerio de Salud) Tejidos humanos requiere un nivel de bioseguridad tipo II Remover el tejido aspticamente y transferir al laboratorio rpidamente en medio de transporte (DBSS). El tejido puede mantenerse a 4C durante 72 horas.

Explante primario Disociacin mecnica Disociacin enzimtica

Excepcin: Clulas hematopoyticas

Colocar un pedazo del tejido en el cultivo y permitir que las clulas migren fuera del fragmento

Ventajas:
Tejidos sensibles a proteasas (clulas del musculo liso y hueso) Pequeas cantidades de tejido

Desventajas:

No es efectivo para clulas con poca adherencia Seleccin: por velocidad de migracin, localizacin dentro del tejido

Evita la seleccin de las clulas por migracin, pero selecciona por resistencia al tratamiento enzimtico Rendimientos ms representativos Ms rpido que el explante primario

 Para romper las adhesiones dependientes de calcio (Cadherinas y Selectinas), se usan quelantes de Ca= EDTA o EGTA Las protenas de la matriz extracelular como fibronectina y laminina son sensibles a las proteasas Los proteoglucanos pueden ser parcialmente degradados por hialuronidasas o heparinasas

Enzimas

Tripsina Colagenasa II (Pseudomonas perfringens) Elastasa Hialuronidasa Dnasa Pronasa y dispasas (proteasas bacterianas)

Combinacin de enzimas Preparaciones crudas son ms eficientes pero ms toxicas Algunos tejidos son resistentes a la tripsina (tejido conectivo fibroso)

Iniciar con tripsina/EDTA y luego proceder con otras enzimas Tripsina fra o Caliente:
Tripsina Fra Mejores rendimientos y mayor tasa de supervivencia. Preserva ms los diferentes tipos celulares. Evita el dao por exposicin a la tripsina caliente (es seguido por una digestin rpida a 37C) Tripsina Caliente Grandes cantidades de tejido. La agitacin puede daar las clulas epiteliales. Colectar clulas cada media hora para evitar la muerte

Permite penetracin de la Es mejor con tejidos enzima con la mnima jvenes (embriones) que actividad enzimtica tejidos adultos (mayor tejido conectivo)

Produce suspensiones celulares ms rpido que los otros mtodos Pero causa mayor dao mecnico Varios mtodos:
Picar Colectar clulas cuando el tejido se corta Presionar el tejido a pasar a travs de una serie de tamices Pipeteo repetido

Soporte adecuado complementado (factores de crecimiento, citocinas) Algunas clulas requieren superficies especiales de adherencia (protenas de la matriz extracelular o molculas de unin sintticas) Transferir la clulas a las condiciones finales de crecimiento tan pronto como sea posible Retos
- La eliminacin de clulas muertas - Enriquecimiento de clulas viables - Separacin de tipos celulares

Cultivos primarios de clulas adherentes: clulas no viables son removidas durante el primer cambio de medio Para cultivos mantenidos en suspensin las clulas no viables son gradualmente diluidas cuando comienza la proliferacin celular

Medios Selectivos Diferencias en la velocidad de adhesin Uso de enzimas:

Colagenasa no disgrega eficientemente las clulas epiteliales pero si las del estroma

Sedimentacin Centrifugacin con gradientes Selector celular activado por Fluorescencia (FACS) Muerte selectiva

Remover el tejido muerto y graso Usar instrumentos afilados para la diseccin para evitar el dao celular No dejar las enzimas en la suspensin celular (inactivarlas) Usar altas concentraciones de celulas para el cultivo primario Usar medios ricos apropiados Algunos cultivos pueden requerir factores de crecimiento o adhesin especficos Los tejidos embrionarios dan mejores resultados

La disgregacin y el cultivo primario, son la primera etapa y la ms importante de un cultivo celular. Muchos tipos celulares pueden ser cultivados si se eligen los tratamientos adecuados. Mantener un registro del origen, derivacin y procedimientos usados para la disgregacin y el cultivo primario PROCEDENCIA DE LA LNEA CELULAR

Los hombres y las mujeres, que pierden la salud para juntar dinero y luego pierden el dinero para recuperar la salud; y que por pensar ansiosamente en el futuro olvidan el presente de tal forma, que acaban por no vivir ni el presente ni el futuro, viven como si nunca fuesen a morir, y mueren como si nunca hubiesen vivido