Cromatografa de Exclusin Molecular

4 Ao de Laboratorio Qumico Prof. Belkis Wandersleben W. C.E.A.L.A.

La cromatografa de exclusin molecular (a menudo tambin llamada filtracin en gel) es una de las tcnicas ms sencillas de las empleadas en la separacin de protenas y cidos nucleicos. Este tipo de cromatografa se realiza en columnas cilndricas rellenas con algunos de los geles que se fabrican con este fin (dextranos, agarosa o poliacrilamida).

Descripcin
En esta cromatografa, la fase estacionaria consiste en largos polmeros entrecruzados que forman una red tridimensional porosa. Las columnas se empaquetan con pequeas partculas esferoidales formadas por esos polmeros entrecruzados.

En consecuencia, estas partculas son porosas, y el tamao de los poros es tal que algunas molculas (las demasiado grandes) no podrn ingresar a esos poros, en tanto que otras (las suficientemente pequeas) podrn pasar a travs de ellos. Los poros quedan conectados formando una malla o red, lo cual determina una serie de caminos a ser recorridos por las molculas que acceden al interior de esta.

 Cuando

se hace pasar una mezcla de molculas de distinto tamao, a travs de una columna de filtracin en gel; aquellas molculas con un tamao mayor que el dimetro de los poros de las partculas, slo podrn moverse en su camino, a travs de la fase estacionaria, en el espacio que queda entre las partculas; y por lo tanto, no se vern retrasadas en su descenso.

En cambio aquellas molculas capaces de penetrar en las partculas se vern retrasadas por la fase estacionaria; en mayor medida, cuanto menor sea su tamao. Por lo tanto, las molculas eluyen en este tipo de cromatografa por orden decreciente de tamao molecular.

 Las

mallas del gel permiten la entrada selectiva de las partculas de menor masa molecular. De ah que las partculas de mayor peso molecular salgan primero.

Procedimiento
El

gel, una vez hidratado, se deposita adecuadamente en una columna hueca de vidrio quedando listo para su uso. Las molculas de muy pequeo tamao penetran en el interior de las esferas que componen el gel y, por consiguiente, no son extradas de la columna hasta que no ha pasado a travs de ella un volumen de lquido igual a su volumen total (vt)

Sin embargo, aquellas molculas cuyo tamao es mayor que el de los poros de las esferas del gel, no pueden penetrar en su interior y atraviesan la columna recorriendo nicamente el volumen vaco (Vo), siendo las primeras en salir de la columna.

El resto de las molculas, de tamao intermedio, presentan una mayor o menor facilidad para difundir al interior de las esferas en funcin de su tamao, siendo extradas fraccionadamente con volmenes que estn comprendidos entre el Vt y el Vo.

Cuanto mayor es una molcula, menos capacidad tiene para acceder al interior de las esferas del gel y, por tanto, menor es el volumen de lquido que se requiere para extraerla de la columna.

Teniendo en cuenta que para las protenas globulares el tamao est, en general, relacionado con el peso molecular, este tipo de cromatografa separa las sustancias en funcin de dichos pesos moleculares, obtenindose primero las ms pesadas.

Definicin de parmetros
Intervalo

de fraccionamiento de un determinado tipo de gel, como los valores extremos (Mximo y mnimo) de pesos moleculares entre los cuales el gel tiene capacidad de separar. Volumen de elucin, es el volumen necesario para eluir un compuesto de una columna.

 Volumen

de exclusin: volumen al que eluyen las molculas de tamao superior al intervalo de fraccionamiento del gel. Corresponde a la suma del volumen de los huecos entre las partculas de gel.

 Kd

= Ve-Vo/Vt-Vo El valor de Kd oscila entre 0 (cuando Ve=Vo) y 1 (cuando Ve=Vt), y representa la fraccin de volumen del interior de las esferas a la que accede cada sustancia en virtud de su tamao.

Factores que influyen en la separacin

Longitud de la columna. La capacidad de separacin de sustancias de diferente tamao aumenta con la longitud de la columna. Flujo. La resolucin de la separacin disminuye al aumentar el flujo del lquido con que son arrastradas las molculas a lo largo de la columna.

 El

volumen de la muestra a cromatografiar debe ser pequeo comparado con el volumen total de la columna. Las mejores separaciones se obtienen aplicando volmenes de muestra iguales o menores al 5% del volumen total. Empaquetado del gel en la columna. Las propiedades separadoras del gel se alteran profundamente, e incluso desaparecen, cuando un gel no est empaquetado homogneamente en la columna o se encuentra excesivamente comprimido.

Grados de los Geles

APLICACIONES

Desalado. Protenas, polisacridos, polipptidos etc. pueden ser desalados antes de ser concentrados o liofilizados. Eliminacin de fenol de las preparaciones de cidos nucleicos. Eliminacin de compuestos de bajo peso molecular marcados. Para reacciones entre macromolculas y reactivos de bajo peso molecular. Eliminacin de productos, cofactores, inhibidores, etc. de las enzimas. Purificacin de macromolculas. Determinacin del peso molecular de las protenas.