Universidad Autnoma de Nuevo Len Facultad de Ciencias Qumicas Qumico Farmacutico Bilogo Aplicaciones de Qumica Orgnica

Mtodos de tincin

Alejandra Jimnez Martnez 1553120 Laura Elena Tamez Salazar 1528409 Karina Jazmn Alcntara Solano1509537

Teidos

Mtodos de tincin

Visualizacin de microorganismos
Sin teir

Mtodos de tincin
Ventajas:
Observar adecuadamente morfologa de microorganismos.
Proporcionan contraste preciso. Establecer informacin complementaria que no podra ser observada por examen fresco. Conocer caractersticas.

Factores que afectan a toda tcnica de tincin

Pureza del colorante Concentracin del colorante pH del colorante Conservacin del colorante Elaboracin Tcnica empleada Cantidad de muestra

Realizar correctamente el frotis

Tiempos de tincin

Clasificacin de Colorantes
Colorantes

Origen

Comportamiento qumico

Naturales

Artificiales

cidos

Aninicos

Naturales
Extrados de animales y plantas. Ejemplo: hematoxilina(extraido del tronco de una planta que por oxidacin se origina hemateina), azul de ndigo(extracto de leguminosa o el carmn de la cochinilla)

Artificiales
Obtenidos del alquitrn de hulla, son colorantes de anilina y se distinguen colorantes cidos y bsicos, que pueden presentarse formando sales, as como colorantes neutros Ejemplos: el cristal de violeta, violeta de genciana, fucsina bsica, acido pcrico azul de metileno etc..

cidos o aninicos
Aquellos donde la carga del radical colorante es negativa, corresponden a colorantes citoplasmticos, por que los citoplasmas de las clulas se consideran bsicos y captan bien los colorantes cidos Ejemplo: eosinas, auraminas etc..

Mtodos de tincin
Tinciones bacterianas
Tincin simple Tincin negativa Tinciones diferenciales
Tincin de Gram Tincin de Zhiel-Neelsen Tincin es espiroquetas

Tinciones estructurales
Tinciones especficas Tincin de flagelos Tincin de cpsulas Tincin de esporas

Tipos de tinciones:
Sin Tincin: no se utiliza ningn colorante.

Simple: Se utiliza para distinguir el tamao arreglo y forma, se utiliza un solo colorante, por lo que todas las estructuras celulares se tien con la misma tonalidad.

Afinidad por carga con componentes de la superficie de la clula

(Tinta china, Azul Metileno de Loeffler, Azul de lactofenol) Directa: tie la bacteria Negativa: tie el fondo pero no a la bacteria

Tincin negativa
Es el reverso del procedimiento de tincin usual: las clulas se dejan sin teir pero se colorea un cambio el medio que las rodea. Lo que se ve, por tanto, es el perfil de las clulas.

Es un modo de aumentar el contraste de las clulas en microscopia ptica, pero su mxima utilidad est en revelar la presencia de cpsulas alrededor de las clulas bacterianas.

Ejemplo: la tinta china (una suspensin de partculas de carbono coloidal) o la nigrosina (colorante negro insoluble en agua).

 Diferencial: Separar y clasificar los microorganismos observados de acuerdo a sus caractersticas, se utiliza ms de un tinte
Ejemplos: Tincin Gram y cido resistente

Especfica: Para identificar estructuras

Ejemplos: Tincin de flagelos, cpsulas y esporas.

Tinciones diferenciales
Caractersticas: Permite detectar distintos tipos de clulas. Se necesita fijacin previa (generalmente calor). Se utilizan dos colorantes, siendo el ltimo de contraste. Nos permite visualizar morfologa y otras caractersticas.

Tinciones diferenciales Tincin de Gram Tincin de Ziehl-Neelsen Tincin de espiroquetas

Tincin de Gram
Se puede clasificar en dos grupos: Gram + y Gram . Este distinto comportamiento es debido a la distinta composicin de la pared bacteriana. Primer colorante bsico (Cristal violeta o violeta de genciana) Mordiente (lugol) Agente decolorante Colorante de contraste o segundo colorante

Tincin de Gram

Tincin Ziehl-Neelsen
Tincin cido-alcohol resistente

Colorantes altamente concentrados Presencia de calor Las microbacterias son coloreadas de rojo por la Fucsina. Las bacterias que resisten la decoloracin son de color rojo y las que no, se ven de color azul ya que se utiliza azul de metileno como tincin de contraste. Se utiliza para diagnstico y estudio de enfermedades producidas por bacterias cido-resistentes, por ejemplo: tuberculosis y lepra.

 Visualizacin de Mycobacterium tuberculosis usando la tincin de Ziehl-Neelsen.

Tincin de espiroquetas
Esta basada en la propiedad del nitrato de plata amoniacal que, al ser altamente bsico, se une muy especficamente a la espiroqueta. Las espiroquetas son bacterias finas, helicoidales, gramnegativas y de paredes flexibles.

Treponema Pallidum

 Espiroquetas en digestivo de conejo

Tincin cido-Resistente
Se coloca una pequea porcin de una muestra sobre un portaobjetos de vidrio, se tie y se calienta. Las clulas retienen el tinte, se lava el portaobjetos con una solucin cida y aplica un colorante diferente. Las bacterias que retienen el primer tinte se consideran "acidorresistentes porque resisten el lavado cido. Este tipo de bacterias est asociado con tuberculosis y otras infecciones.

 Las familias Mycobacteriae y Nocardiaceae son cido resistente.

Los microorganismos cido-resistentes se caracterizan por tener una pared celular gruesa de cera (lipoidal) que contiene cido miclico .

 Pared celular micobacterial: 1-lpidos externos, 2-cido miclico, 3polisacridos (arabinogalactano), 4-peptidoglicano, 5-membrana plasmtica, 6-lipoarabinomanano (LAM), 7-fosfatidilinositol manosido, 8-esquema de la pared celular.

Tinciones estructurales
Son aquellas que utilizan ms de un colorante sirven diferenciar distintas estructuras bacterianas. As tenemos:
Flagelos Esporas

Capsulas
Corpsculos metacrmicos

Tincin de flagelos
Tipo de tincin en la que se pueden visualizar el(los) flagelo(s). Utiliza 2 tintes: cido tnico (agente mordante: engruesa los flagelos) Rosalina (colorante que los define)

Tincin de Cpsulas
Cpsula: estructura gelatinosa secretada por algunas bacterias capas de polisacridos o protenas que revisten el exterior de un bacteria Funcin: adherencia y formacin de biopelculas (capas de crecimiento bacteriano) y proteccin contra fagocitosis (macrfagos, sistema inmunolgico) La cpsula se compone de polisacridos, glicoprotenas y polipptidos. Son solubles en agua.

Mtodos de tincin de cpsulas

Metodo de Burri Tincin simple Nigrosina al 1% como colorante Metodo de Antony

Realizar frotis sin fijar

Cubrir con violeta de genciana 2 min Lavar con CuSO4

En este se observan los microorganismos claros con un halo ligeramente oscuro pero sin teir con un fondo negro

Secar, rotular y observar a inmersin

Las cpsulas presentarn un color azul cielo sobre los microorganismos que presentaran un azul violceo mas oscuro

Formacin de esporas como mtodo de sobrevivencia

Esporas- forma metablicamente inactiva y altamente resistente

En condiciones ambientales hostiles ocurre esporognesis la cual forma la endospora. En condiciones ambientales favorables, ocurre germinacin, lo cual forma la clula vegetativa (bacteria).

Tincin de esporas
Tinte primario- Verde Malaquita, requiere calor para la penetracin de este tinte.

Agente decolorante: Agua, remueve el exceso de tinte, decolora la clula vegetativa.

Contratinte: Safranina, tie las clulas vegetativas.

Pasos para la tincin de esporas

Cubrir frotis con tinte verde malaquita y permita que el colorante humee, pero no hierva. Espere 5 minutos. Si durante los 5 minutos el tinte se seca aada ms tinte. Enjuague la laminilla con agua destilada.

Coloque tinte safranina (30 seg).

Seque la laminilla en papel bibulous. Observe y dibuje la coloracin, morfologa y arreglo de las bacterias bajo el microscopio.

Colorantes microbiolgicos comunes

Colorante Principio Naranja acridina Fluorocromo que se intercala con el acido nucleico, cambiando las caractersticas pticas del colorante; fluorescencia naranja la luz UV. Rodamina auramina Blanco calcoflor Fluorocromo inespecfico que se une a los cidos miclicos de las paredes celulares de los organismos cido-resisitentes; fluorescencia naranja-amarilla bajo la luz UV Fluorocromo que se une a la celulosa de las paredes celulares fngicas; fluorescencia azul-blanca bajo luz UV

Flagelos
Gram

Se emplean una variedad de colorantes para teir los flagelos.

Tincin bacteriana diferencial; las bacterias grampositivas retienen el complejo violeta cristal-yodo, que es eliminado de las clulas gramnegativas durante la decoloracin; estas ultimas se tien con el contracolorante rojo, la safranina. Colorante de contraste que tie los microorganismos y el material de fondo, pero no la capsula. Colorante de contraste que tie los cidos miclicos en la pared celular de los microorganismos acidorresistentes, que aparecen de color rosa-rojo. Colorante de contraste inespecfico. Tie en lavanda los hongos y Pneumocystitis, y en azul el material de fondo.

Tinta china Kinyoun Yodo lugol Azul toluidina O

Referencias
Murray P.R., Kobayashi G.S., Pfaller M.A., Rosenthal K.S., Microbiologa Mdica, Editorial Harcourt Brace, 2 edicin, Espaa, 1997. ISBN: 84-8174162-0 Brooks G.F., Ornston E.N., Butel J.S., Microbiologa Mdica, Editorial El Manual Moderno S.A. de C.V., Mxico, 1996. ISBN: 968-426-717-7 Granados R. Villaverde M.C. Microbiologa, Editorial Thomson, Espaa, 2003. ISBN: 84-9732-123-5 http://www.microinmuno.qb.fcen.uba.ar/SeminarioTinciones.htm