TÉCNICAS EN EL ANÁLISIS

DE MICROSATÉLITES
UTILIZADOS EN
IDENTIFICACIÓN HUMANA
PASOS EN EL PROCESAMIENTO DE UNA MUESTRA DE ADN
Muestra obtenida de la
escena del crimen o de una BIOLOGÍA
prueba de paternidad

Extraccion Cuantificacion Amplificación PCR de

de ADN de ADN marcadores STRs

TECNOLOGÍA

Separación y Detección de Determinación genotipo

productos PCR ( Alelos de STRs) muestra

GENÉTICA
Comparación del Entrega de resultados
genotipo de la muestra (cálculos estadísiticos)
con otros resultados

Análisis de los resultados

(comparación con datos
poblacionales)
•Describir tipo de
muestra, su color, su
forma, su marca,
etiqueta y talla si
procede, tipo de
envoltorio que lo
contenía y estado de
conservación.

•Muestras dubitadas

•Muestras indubitadas

Muestras utilizadas para extracción

de ADN
 EXTRACCION DE ADN
 Extracción orgánica (fenol-
cloroformo)

 Extracción no orgánica (agentes

quelantes): agentes quelantes:
resina Chelex, formada por
copolímeros de
estirenodivinilbenceno que
contienen iones iminodiacetato
que actúan como grupos
quelantes.
 CUANTIFICACION DEL ADN
 Fluorometría

 Fundamento: capacidad de
unión del ADN a ciertos tintes
fluorescentes como H33258

 Comparación de las muestras

problema con muestras de
cantidad de ADN conocida

 Se utiliza un Fluorímetro:
lámpara de mercurio y un
detector para medir
fluorescencia relativa a 460nm

 ADN de doble cadena

 CUANTIFICACION DEL ADN
 Espectrofotometría
 Medida de la cantidad de luz
ultravioleta que absorben las
bases nitrogenadas

 Utiliza un espectrofotómetro,
medidas de absorbancia a
260 y 280nm

 OD260/OD280: pureza del

ácido nucleico

 Poco sensible: no dectecta

concentraciones de ADN
inferiores a 250ng/ml
ESPECTRO DE ABSORBANCIA ADN

http://www.cardiff.ac.uk/biosi/staffinfo/kille/Methods/Gene/Spec_Anal
ysis.html
 CUANTIFICACION DEL ADN
 Minigel de agarosa
 Midiendo la fluorescencia
inducida por ultravioleta que
se produce cuando se
intercalan moléculas de
bromuro de etidio entre el
ADN

 Comparar con patrones

estandar de cantidad de ADN
conocida

 Poco sensible

 Ventajas: se puede visualizar

el grado de degradación del
ADN
 CUANTIFICACION DEL ADN
 Hibridación con sondas (Dot Blot y
Slot Blot)

 Hibridación de las muestras a

cuantificar con una sonda del
locus humano alfa satélite
D17Z11.

 ADN problema se inmoviliza en

una membrana de nylon (punto:
dot-blot; guión:slot-blot), se pone
en contacto con la sonda

 Sondas marcadas

 Comparación intensidad de señal

de la muestra con estándares
CUANTIFICACION DEL ADN

•Solo cuantifica ADN

humano

•Altamente sensible,
detecta cantidades
del orden de 20pg

•Cuantifica ADN de
cadena sencilla y
muestras de ADN no
purificadas

 Hibridación con sondas (Dot Blot y Slot Blot)

 CUANTIFICACION DEL ADN

QuantiBlot
 CUANTIFICACION DEL ADN

Cuantificación enzimática
 Uso de una serie de enzimas para producir una cantidad de ATP que
depende de la cantidad de AD N presente en la muestra seguida de
la generación de una señal luminosa, dependiente de la
concentración de ATP
AMPLIFICACION DEL ADN
 TÉCNICA DE PCR

5’ 3’
5’ 3’
ADN MOLDE

3’ 5’
3’ 5’

Cadenas
separadas
(denaturación)

Forward primer

5’ 3’ 5’ 3’

Copias (extensión
Adición
de de )
primers
primers 3’ 5’
3’ 5’
(alineamiento) Reverse primer
MULTIPLES COPIAS DE ADN POR PCR

Original DNA target region

Thermal cycle

En 32 ciclos con un 100% de eficiencia se pueden producir hasta

1.07 billones de copias de ADN molde
MULTIPLEX PCR

 Se pueden analizar hasta

10 loci simultáneamente

 Alta sensibilidad menos de

1 ng de ADN

 Util en análisis de
muestras degradadas y de
mezclas

 Ventajas: disminuye
costos, tiempo,
contaminación del ADN
SEPARACION de PRODUCTOS PCR

 PCR Multiple: diferentes marcadores fluorocromos

pueden ser usados para el análisis de loci donde se
sobrelapan el tamaño de los alelos

 Separación de productos PCR:

 TIPIFICACION MANUAL: Tinción de nitrato de plata

 DETECCION FLUORESCENTE SEMIAUTOMATICA

Electroforesis capilar
Electroforesis en geles de poliacrilamida
 EJEMPLO DE UN KIT DE MULTIPLEX
AmpFlSTR® Profiler Plus™

100 pb 200 pb 300 pb 400 pb

Separación por tamaño

Separación por color

D3 vWA FGA 5-FAM (blue)

A D8 D21 D18 JOE (green)

D5 D13 D7 NED (yellow)

ROX
(red)
Estandar interno GS500
9 STRs amplificados junto con Amelogenina en una sola reacción de PCR
ELECTROFORESIS

Electroforesis convencional
 Geles de agarosa
 Geles de poliacrilamida

Fundamento
 El ADN está cargado
negativamente y al someterlo a
una diferencia de potencial se
moverá hacia el ánodo a través
del gel una distancia
proporcional a su tamaño,
alcanzando mayor distancia las
moléculas de menor peso.
ELECTROFORESIS CONVENCIONAL
ESCALERAS ALELICAS
ELECTROFORESIS CAPILAR
Cuando los fragmentos de ADN alcanzan la ventana capilar, el
láser excita los colorantes fluorescentes. La fluorescencia
emitida por los colorantes es colectada por el detector a
longitudes de onda particulares y registrados como señales
digitales en el computador.
TIPIFICACION DE STRs
TECNICAS DE HIBRIDACION
 SECUENCIACION

http://www.ucm.es/info/genetica/AVG/practicas/secuencia/Automat1.jpg