AP4 is a mediator of epithelialmesenchymal transition and metastasis in colorectal cancer

by Rene Jackstadt, Simone Rh, Jens Neumann, Peter Jung, Reinhard Hoffmann, David Horst, Christian Berens, Georg W. Bornkamm, Thomas Kirchner, Antje Menssen, and Heiko Hermeking

Volume 210(7):1331-1350 July 1, 2013 David Muniz R4 Oncologia clnica 11/09/2013

A protena AP4 um fator de transcrio em hlice-loop-hlice leucina-zper que forma homodmeros, que se ligam ao E-box CAGCTG (Hu et al.,1990; Jung and Hermeking,2009)

Alvo direto de c-MYC Upregulation de c-MYC hallmark de cncer colorretal AP4 est upregulated em tumores colorretais que hiperexpressam c-MYC Down-regulation de p21 (cyclin-dependent kinase (CDK) inhibitor) (Jung et al., 2008, Muzny et al., 2012)

2013 Jackstadt et al.

(Hanahan e Weinberg, 2011)

Transio epitlio-mesenquimal
Programa de regulao celular implicada na capacitao de clulas epiteliais para invadir, disseminar e resistir apoptose Fatores de transcrio: Snail, Slug, Twist, and Zeb1/2 Clulas de metstases distncia apresentam alteraes em seu formato e na capacidade de se ligarem a outras clulas e matriz extracelular Perda de E-caderina est associada a maior potencial de invaso e metstase Hiperexpresso de N-caderina observada em carcinomas invasivos (Hanahan e Weinberg, 2011)

A programao transcricional de TEM induzida pelo c-MYC , em grande parte, desconhecida

Genome-wide analysis of transcriptional regulation by AP4.

Imunoblot Deteco de expresso proteica

Microarray Heat map de mRNA (1458) diferencialmente regulado aps infeco por Ad-AP4 vs Ad-GFP Pico 24horas

Anlise Gene Ontology

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Jackstadt R et al. JEM 2013;210:1331-1350

AP4 coordena a expresso de grande nmero de genes que podem afetar TME e proliferao

Validation of AP4-mediated differential gene expression. PCR quantitativo (mRNA) para confirmar induo ou represso de 30 genes selecionados Imunoblot Deteco de protenas

Quantificao de expresso de mRNA em clulas de linhagem do osteossarcoma

Quantificao da protena CDK2 em clulas de linhagem do osteossarcoma Quantificao da protena LGR5 em clulas de linhagem do osteossarcoma

Imunoblot (anticorpo anti-AP4) Deteco de AP4 ectpico vs endgeno

Alteraes de expresso gnica no so linhagem celular-especficas

pRTR was generated by replacing the KRAB repressor domain containing Tet trans-silencer of the pRTS (Bornkamm et al.,2005) vector with an alternative trans-silencer containing a CtBP-recruiting PLDLS repression motif (Molloy et al., 2001) and a relaxed effector specificity (Krueger et al., 2006), together with an IRES-coupled Puromycin-resistance gene. To generate the episomal pRTRAP4-VSV vector, the AP4-VSV ORF was isolated from pcDNA3-AP4-VSV (Jung et al., 2008) and ligated into the pUC19-SfiI shuttle vector via BamHI and NotI restriction sites, released with SfiI, and the resulting fragment of interest was ligated into pRTR. All plasmids were verified by sequencing

2013 Jackstadt et al.

Jackstadt R et al. JEM 2013;210:1331-1350

Expresso de AP4 confinada s pores basais das criptas, contendo clulas progenitoras e clulas tronco

p21, diretamente reprimido por AP4, exclusivamente expresso nas camadas superiores das criptas

Expresso de SNAIL, CKS2 e CD44 tambm est confinada s clulas da poro basal das criptas Possivelmente genes regulados por AP4 em clulas de linhagem de cncer colorretal so reguladas por AP4 no clon normal

Jung, 2008

Comparison of the distribution of AP4-binding motifs with ChIP signals, transcription units, and c-MYC motifs on chromosome 11. Para identificar genes diretamente regulados por AP4, foi realizada genome-wide chromatin immunoprecipitation (ChIP) seguida de next generation sequencing (ChIP-seq) em clulas DLD-1 aps ativao de AP4

Comparao da distribuio de motifs de ligao de AP4 com a distribuio de leituras de ChIP-seq Comparao da distribuio de motifs de ligao de AP4 com genes conhecidos

Motifs de AP4 esto condensados em regies densas de genes

Comparao da distribuio de motifs de ligao de AP4 com motivos de ligao de cMYC

Distribuio similar de stios de ligao de c-MYC e AP4

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Jackstadt R et al. JEM 2013;210:1331-1350

Genome-wide analyses of AP4 occupancy. Localizao dos ChIP signals 38% >5 kbps ou downstream 10% < 5 kbps 52% regies intragnicas Proporo de genes diferencialmente expressos com ligao de AP4 na regio promotora e resultados de expresso de mRNA

Padro de ligao de AP4 de acordo com proximidade do Transcription Start Site

Comparao de ChIP signals derivados de AP4 nos promotores de genes induzidos e reprimidos por AP4

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Jackstadt R et al. JEM 2013;210:1331-1350

Anlise de 485 ChIP signals em proximidade com TSS com pelo menos 25 leituras sobrepostas (MEME multiple em for motif elicitation)

61% CAGCTG vs menor frao CACCTG (semelhante a SNAIL)

AP1 motifs foram detectado em 41% dos ChIP signals derivados de AP4

SP1 motifs foram detectados em 36% dos ChIP signals derivados de AP4

AP4 coopera com SP1 e AP1 na regulao transcricional de alvos gnicos em comum

Analysis of AP4 occupancy at selected promoters. Resultados da anlise de Chip-seq em 7 promotores selecionados * CAGCTG motifs preditos com bioinformtica CAGCTG motifs

Anlise qChIP com anticorpo anti-AP4 nas regies promotoras

Anlise qChIP indica que h ligao de AP4 no promotor de CDH1/Ecaderina na ausncia do motif CAGCTG

Anlise qChIP com anticorpo anti-AP4 vs anti-IgG na linhagem celular SW620

Reporter transfectado tornou a linhagem celular resistente a represso de CDH1

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Ectopic AP4 induces EMT in CRC cells.

Imunoblot

Microscopia de contraste de fase

2013 Jackstadt et al.

Jackstadt R et al. JEM 2013;210:1331-1350

Ectopic AP4 induces EMT in CRC cells.

Microscopia confocal de clulas DLD-1 com expresso ectpica de AP4 Deteco de E-caderina e -catenina por imunofluorescncia indireta Deteco de F-actina por Alexa Fluor 647labeled Phalloidin

Boyden chamber transwell assay (DLD-1) Avalia migrao e invaso

Imunoblot (HT29)

qPCR de RNA Ensaio dual luciferase Atividade transcricional em clulas transfectadas com um gene luciferase sob controle de um promotor Atividade do reporter catenina/TCF4

Boyden chamber transwell assay (HT29)

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Jackstadt R et al. JEM 2013;210:1331-1350

Analyses of the requirement of AP4 and SNAIL for EMT-associated traits.

Imunoblot (SW480)

qPCR (SW480)

Transwell Boyden chamber assay (SW480)

SW480: expresso alta de AP4 constitutiva miRNA: silenciamento gnico via represso de translao ou degradao do RNA alvo

Jackstadt R et al. JEM 2013;210:1331-1350

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Analyses of the requirement of AP4 and SNAIL for EMT-associated traits.

Imunoblot (DLD-1)

Microscopia de contraste de fase

Transwell Boyden chamber assay (DLD-1)

siRNA interfere com expresso de genes especficos com sequncia de nucleotdeos complementares

Jackstadt R et al. JEM 2013;210:1331-1350

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Analyses of the requirement of AP4 and SNAIL for EMT-associated traits.

Imunoblot (DLD-1)

Microscopia de contraste de fase

Transwell Boyden chamber assay (DLD-1)

AP4 e SNAIL funcionam de maneira independente AP4 fator de transcrio com capacidade para induo de TEM
Jackstadt R et al. JEM 2013;210:1331-1350
2013 Jackstadt et al.

A circuitry involving c-MYC, AP4, and SNAIL regulates EMT and invasion.

Microscopia de contraste de fase

Microscopia confocal de clulas DLD-1 com expresso ectpica de AP4 Deteco de E-caderina por imunofluorescncia indireta

Jackstadt R et al. JEM 2013;210:1331-1350

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A circuitry involving c-MYC, AP4, and SNAIL regulates EMT and invasion.

Imunoblot

Imunoblot (HT29 e DLD-1 pRTR-c-MYC -VSV)

AP4 desempenha importante papel na induo de SNAIL pela ativao de c-MYC

Jackstadt R et al. JEM 2013;210:1331-1350

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A circuitry involving c-MYC, AP4, and SNAIL regulates EMT and invasion.

Microscopia de contraste de fase DLD-1/pRTRc-MYCVSV

Wound healing

Boyden chamber transwell assay

Jackstadt R et al. JEM 2013;210:1331-1350

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A circuitry involving c-MYC, AP4, and SNAIL regulates EMT and invasion.

Boyden chamber transwell assay

A induo de SNAIL pelo c-MYC em grande parte mediada por AP4, mas tambm h um componente AP4-independente
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Requirement of AP4 for metastasis in a xenograft mouse model.

Imunoblot

Imunoblot

Imunoblot SW-620-Luc

AP4 est downstream a c-MYC SNAIL est downstream a AP4

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Requirement of AP4 for metastasis in a xenograft mouse model. Bioluminescncia Camundongo NOD/SCID 9 semanas aps injeo

Boyden chamber transwell assay (SW620-Luc)

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Jackstadt R et al. JEM 2013;210:1331-1350

Requirement of AP4 for metastasis in a xenograft mouse model.

Bioluminescncia

Resseco pulmonar aps 9 semanas

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Jackstadt R et al. JEM 2013;210:1331-1350

Requirement of AP4 for metastasis in a xenograft mouse model.

Funo de AP4 e SNAIL necessria para crescimento de metstases de clulas de CCR nesse modelo animal
2013 Jackstadt et al.

Jackstadt R et al. JEM 2013;210:1331-1350

Association of AP4 with metastasis and poor patient survival. Estudo caso controle 55 pacientes com metstase heptica sincrnica vs 55 pts SED em5 anos

Expresso elevada de AP4 apresentou correlao com grau de diferenciao e presena de metstases distncia e linfonodal
2013 Jackstadt et al.

Jackstadt R et al. JEM 2013;210:1331-1350

Association of AP4 with metastasis and poor patient survival.

Sobrevida cncer especfica em 5 anos de acordo com expresso de AP4 Alta: 50% Intermediria: 70% Baixa: 80%

2013 Jackstadt et al.

Jackstadt R et al. JEM 2013;210:1331-1350

Gray, 2011

Solin, 2013

Association of AP4 with metastasis and poor patient survival.

Jackstadt R et al. JEM 2013;210:1331-1350

2013 Jackstadt et al.

Obrigado