Parte III.

Monitoreo del
proceso de purificacin.
A. Determinacin de la
concentracin de protenas
Objetivos

1. Conocer los mtodos que se utilizan para monitorear el proceso
de purificacin de una protena.
2. Adquirir la habilidad para analizar el progreso de la purificacin
de una protena.
3. Aplicar un mtodo espectrofotomtrico para medir la
concentracin de una protena.
4. Determinar la concentracin mediante la deteccin de la
absorbancia a 280nm.
5. Determinar la concentracin de una protena utilizando un
mtodo colorimtrico: Determinacin de protenas por Bradford.
6. Analizar el progreso de la purificacin de una protena.
7. Conocer algunos parmetros que se determinan durante la
purificacin de una protena: rendimiento y pureza.
8. Aplicar el conocimiento adquirido para elaborar esquemas de
purificacin de protenas.
Cmo monitorear un proceso de
purificacin?
Para evaluar de manera cuantitativa el xito
de una purificacin de protenas es
necesario conocer dos parmetros:
a) el rendimiento y
b) el grado de pureza

de cada paso del proceso de purificacin.

El rendimiento
Parmetro expresado en porcentaje que se
obtiene de medir la actividad biolgica de la
protena de inters en cada paso de la
purificacin.
El 100% corresponde a la actividad del
extracto inicial.
Grado de pureza
Se refiere al incremento en pureza, valor que
se obtiene de dividir la actividad especfica
de cada paso entre la actividad especfica del
paso inicial de purificacin, este ndice da el
valor de 1 para el extracto inicial.

La actividad especfica se expresa en
Unidades/ mg protena
-1

Tabla de purificacin

Qu necesitamos hacer para construir
nuestra tabla de purificacin de la LDH?
a) una tcnica que determine la concentracin
de protenas en la muestra, y
b) una tcnica que especficamente detecte o
mida la cantidad de la protena blanco
(Unidades de actividad).
.
Nishimune T et al. J. Nutr. 2000;130:1625-1628
2000 by American Society for Nutrition
Chromatofocusing of RGP-2 on mono-P.
Potempa J et al. J. Biol. Chem. 1998;273:21648-21657
1998 by American Society for Biochemistry and Molecular Biology
Determinacin de protenas
mediante un mtodo no
destructivo
A 280 nm

DETERMINACIN DE PROTENAS POR EL
MTODO ABS 280 NM.
1. Descongelar slo las alcuotas de las fracciones de
protena destinadas para este protocolo y que fueron
recolectadas durante la purificacin de la lactato
deshidrogenasa.
2. Mantener las fracciones en un recipiente con hielo
durante todo el experimento.
3. Colocar las fracciones en cuvetas de metacrilato
grado UV.
4. Leer la absorbancia las fracciones que te indique el
profesor a la longitud de 280 nm.
Calcular la concentracin de protena y
llenar la tabla

10 *
(%)
) / (
280
|
|
.
|

\
|
=
c

nm
Abs
L g in Concentrac
Tubo Absorbancia Concentracin (g/L)
F0

F1

F2

F3

F4

FPA

FPB


Despus..
Usar el estimado para determinar las
diluciones o alcuotas a usar en la
determinacin colorimtrica de protenas.
Recordar que la sensibilidad del Bradford es
de 1 a 20 g de protena con una
absorbancia mxima aproximada de 0.6.

porqu usar Bradford?
Determinacin de protenas
por Bradford
Construccin de curva patrn
Determinacin de protenas de las
muestras
Se utilizar una curva estndar de BSA
1. Aadir los reactivos en el orden mostrado, agitando
despus de cada adicin. Precaucin, maneja
con cuidado el reactivo de Bradford, ya que
contiene H3PO4!.




2. Registrar la absorbancia a 595 nm.
3. Graficar absorbancia del estndar vs cantidad de
protena (g) y obtener los parmetros de regresin.
Tubo B 1 2 3 4 5
H
2
O (L) 800 770 760 740 720 700
BSA (L) 0 30 40 60 80 100
Reactivo Bradford (L) 200 200 200 200 200 200
Absorbancia

1000 uL
Calcular la concentracin de protena
Utilizar los parmetros de regresin obtenidos de la curva
estndar, para calcular el contenido de protena de cada una
de las muestras de acuerdo a la siguiente frmula:




Donde, b es la ordenada al origen, m la pendiente y F es el factor
de dilucin de cada muestra.
El valor obtenido en 9 dividirlo entre el volumen de muestra
que utilizaste en el ensayo, obteniendo la concentracin de
protena en g/L.
Posteriormente realizar los promedios por muestra, recuerda
que tienes duplicados para cada fraccin.
F
m
b Abs
g protena de Contenido
nm
* ) (
595
|
.
|

\
|

=


Rendimiento proteico